本发明涉及一种枯草芽孢杆菌的制备方法，属于微生物发酵工程领域。
背景技术：
枯草芽孢杆菌是一类重要的益生菌生产菌株，相对于其他类型益生菌(如乳酸菌)，芽孢杆菌一般对营养要求简单，代谢速度快，而且易于分离、培养和保藏，对工业化生产技术条件不苛刻，此外，芽孢杆菌产生的芽孢对热、紫外线、电离辐射和低pH(2-3)等不良环境有极强的抵抗能力。因此，芽孢杆菌作为益生菌剂易于保存，使用方便。活性成分高，有很大的推广和应用价值，芽孢杆菌常以芽孢的形式作为饲料添加剂。
枯草芽孢杆菌在培养过程中，由于培养条件掌握不好，常出现活菌数量低、芽孢形成率低等问题。提高活菌数尤其是提高芽孢形成率，对以芽孢的形式作为饲料添加剂生产有着积极意义。目前文献报道枯草芽孢杆菌发酵技术制备得率是80-120cfu/ml左右，其中芽孢得率在40％-90％。研究重点多集中在培养基、培养温度和初始pH等方面，忽视了发酵过程pH调控可能带来的影响。
中国专利CN 102168055A公布了一种高芽孢率的枯草芽孢杆菌发酵方法，该方法是经激活枯草芽孢杆菌、二步发酵培养生产目标产品。先接种激活的枯草芽孢杆菌，培养温度为35～38℃、罐压0.02～0.06Mpa、通气比例为1∶0.5～1∶1、搅拌转数为150rpm～200rpm，发酵培养8～14小时，得到种子菌液，再将种子菌液接种培养20～26小时，得到高芽孢率枯草芽孢杆菌液体产品。本发明方法的培养基成分易得且价格便宜、工艺参数简单、发酵周期短，所得的枯草芽孢杆菌活菌数高，并且芽孢率高，达到3.0×109CFU/ml以上，显著提高产品的芽孢数和产品质量。但是上述方法同样是通过优化培养基来提高芽孢率的。同时上述专利中培养基成分复杂，尤其是碳源和氮源。既有豆粕又有黄豆；尿素在高温下可进行缩合反应，生成缩二脲、缩三脲和三聚氰酸。三聚氰酸很 容易生成三聚氰胺。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高活菌数、高芽孢形成率的枯草芽孢杆菌的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，进行斜面培养；
(2)斜面培养后的枯草芽孢杆菌接种于种子培养基上，进行种子培养；
(3)将经种子培养的种子液接种于发酵培养基上，进行发酵培养，从发酵开始到5～6小时不控制pH值，在5～6小时到8小时之间pH值控制在6.0-6.5之间，8小时后pH控制在7.0-7.5之间至发酵结束，得到枯草芽孢杆菌产品，枯草芽孢杆菌产品中活菌数200-400cfu/ml，芽孢形成率87～92％。
所述的斜面培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L。
进行斜面培养的条件为：将枯草芽孢杆菌接种在斜面培养基上，控制斜面培养基pH7.3-7.5，控制温度为36～38℃，培养24～48h，直至长出孢子.
所述的种子培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L。
进行种子培养的条件为：控制种子培养基pH7.3-7.5，控制温度为36～38℃，培养16～24h。
所述的发酵培养基包括以下组分：豆粕25-35g/L，玉米粉5-15g/L，酵母粉0.1-1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸镁0.1-1g/L，硫酸亚铁0.1-1g/L，碳酸钙0.1-1g/L硫酸锰0.1-1g/L，氯化钠1-10g/L。
作为优选，所述的发酵培养基包括以下组分：豆粕30g/L，玉米粉10g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.1g/L，碳酸钙0.1g/L硫酸锰0.2g/L，氯化钠5g/L。
进行发酵培养的条件为：控制发酵培养的温度为35～38℃，从发酵开始到5～6小时不控制pH值，在5～6小时到8小时之间添加氨水控制pH值在6.0-6.5 之间，8小时后开始补加磷酸溶液使pH控制在7.0-7.5之间，至发酵结束，发酵培养总时间为48-56h。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、采用新的发酵培养基配方，尤其是对碳源和氮源进行优化，碳源和氮源的优化是通过对众多碳源、氮源进行单因子的筛选，在此基础上选取一些因子，再设计不同浓度和因素的正交试验；通过多次正交试验和验证优选得到。本发明通过选取代谢过程指标性的系列酶，监测酶活变化数据得出本发明发酵培养基的配方。例如：限定CaCO30.1-1g/L是由于CaCO3有利于芽孢的形成，芽孢富含钙离子，而且大多数钙离子与芽孢所特有的化学成分吡啶二羧酸结合，因此需要通过测定Ca-吡啶二羧酸的量判断该培养基的优效。
2、在发酵过程中，从发酵开始到5～6小时不控制pH值，在5～6小时到8小时之间不加或少量添加氨水控制pH值在6.0-6.5之间，8小时后开始补加磷酸溶液使pH控制在7.0-7.5之间，至发酵结束后活菌数可达200-400cfu/ml，芽孢形成率90％左右。本发明采用不用于其他培养基的发酵控制条件，该培养基在发酵开始到5～6小时，该阶段是淀粉酶、蛋白酶等大量分解培养基底物转化为速效氮源和碳源的阶段，补加氨水会与分解的底物反应和抑制酶活；8小时以后生长明显加快pH值很快上升，避免pH值过高需加酸控制。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
对比例
一种枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)斜面培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L。将枯草芽孢杆菌接种在斜面培养基上进行斜面培养，控制斜面培养基pH7.3-7.5，控制温度为36～38℃，培养24～48h，直至长出孢子；
(2)斜面培养后的枯草芽孢杆菌接种于种子培养基上，控制种子培养基pH7.3-7.5，控制温度为36～38℃，培养16～24h，种子培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L；
(3)将经种子培养的种子液接种于发酵培养基上，进行发酵培养，发酵培养基组成为：豆粕30g/L，葡萄糖5g/L，玉米粉5g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.1g/L，碳酸钙0.1g/L硫酸锰0.2g/L，氯化钠5g/L，PH为7.0，配置成的发酵培养基灭菌后接入种子液，在35～38℃、转速为200rpm、pH值控制在6.8-7.2的发酵罐中发酵培养51小时其发酵水平为110cfu/ml其中芽孢占比80％。
实施例1
一种枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)斜面培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L。将枯草芽孢杆菌接种在斜面培养基上进行斜面培养，控制斜面培养基pH7.3-7.5，控制温度为36～38℃，培养24～48h，直至长出孢子；
(2)斜面培养后的枯草芽孢杆菌接种于种子培养基上，控制种子培养基pH7.3-7.5，控制温度为36～38℃，培养16～24h，种子培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L；
(3)将经种子培养的种子液接种于发酵培养基上，进行发酵培养，发酵培养基组成为：豆粕30g/L，玉米粉10g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.1g/L，碳酸钙0.1g/L硫酸锰0.2g/L，氯化钠5g/L，PH为7.4，配置成的发酵培养基灭菌后接入种子液，在35～38℃、转速为200rpm、pH值控制在7.0--7.4的发酵罐中发酵培养54小时其发酵水平为240cfu/ml其中芽孢占比88％。
实施例2
一种枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)斜面培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L。将枯草芽孢杆菌接种在斜面培养基上进行斜面培养，控制斜面培养基pH7.3-7.5，控制温度为36～38℃，培养24～48h，直至长出孢子；
(2)斜面培养后的枯草芽孢杆菌接种于种子培养基上，控制种子培养基pH7.3-7.5，控制温度为36～38℃，培养16～24h，种子培养基包括以下组分：蛋 白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L；
(3)将经种子培养的种子液接种于发酵培养基上，进行发酵培养，发酵培养基组成为：豆粕30g/L，玉米粉10g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.1g/L，碳酸钙0.1g/L硫酸锰0.2g/L，氯化钠5g/L，PH为7.4，配置成的发酵培养基灭菌后接入种子液，在35～38℃、转速为200rpm、pH值6-8小时控制在6.0-6.5之间，其后控制在7.0--7.4发酵罐中发酵培养58小时其发酵水平为430cfu/ml其中芽孢占比90％。
实施例3
一种枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)斜面培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L。将枯草芽孢杆菌接种在斜面培养基上进行斜面培养，控制斜面培养基pH7.3-7.5，控制温度为36～38℃，培养24～48h，直至长出孢子；
(2)斜面培养后的枯草芽孢杆菌接种于种子培养基上，控制种子培养基pH7.3-7.5，控制温度为36～38℃，培养16～24h，种子培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L；
(3)将经种子培养的种子液接种于发酵培养基上，进行发酵培养，发酵培养基组成为：豆粕30g/L，玉米粉10g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.1g/L，碳酸钙0.1g/L硫酸锰0.2g/L，氯化钠5g/L，PH为7.4，配置成的发酵培养基灭菌后接入种子液，在35～38℃、转速为200rpm、pH值6-8小时控制在6.0-6.5之间，其后控制在7.0--7.4发酵罐中发酵培养53小时其发酵水平为370cfu/ml其中芽孢占比87％。
实施例4
一种枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)斜面培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L。将枯草芽孢杆菌接种在斜面培养基上进行斜面培养，控制斜面培养基pH7.3-7.5，控制温度为36～38℃，培养24～48h，直至长出孢子；
(2)斜面培养后的枯草芽孢杆菌接种于种子培养基上，控制种子培养基 pH7.3-7.5，控制温度为36～38℃，培养16～24h，种子培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L；
(3)将经种子培养的种子液接种于发酵培养基上，进行发酵培养，发酵培养基组成为：豆粕30g/L，玉米粉10g/L，酵母粉0.2g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.1g/L，碳酸钙0.1g/L硫酸锰0.2g/L，氯化钠5g/L，PH为7.4，配置成的发酵培养基灭菌后接入种子液，在35～38℃、转速为200rpm、pH值6-8小时控制在6.0-6.5之间，其后控制在7.0--7.4发酵罐中发酵培养55小时其发酵水平为460cfu/ml其中芽孢占比92％。
实施例5
一种枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)斜面培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L。将枯草芽孢杆菌接种在斜面培养基上进行斜面培养，控制斜面培养基pH7.3-7.5，控制温度为38℃，培养48h，直至长出孢子；
(2)斜面培养后的枯草芽孢杆菌接种于种子培养基上，控制种子培养基pH7.3-7.5，控制温度为38℃，培养24h，种子培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L；
(3)将经种子培养的种子液接种于发酵培养基上，进行发酵培养，发酵培养基组成为：豆粕25g/L，玉米粉5g/L，酵母粉0.1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸亚铁0.1g/L，碳酸钙0.1g/L硫酸锰0.1g/L，氯化钠1g/L，PH为7.0，配置成的发酵培养基灭菌后接入种子液，在35～38℃、转速为200rpm、pH值6-8小时控制在6.0-6.5之间，其后控制在7.0--7.4发酵罐中发酵培养55小时其发酵水平为480cfu/ml其中芽孢占比90％。
实施例6
一种枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)斜面培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L。将枯草芽孢杆菌接种在斜面培养基上进行斜面培养，控制斜面培养基pH7.3-7.5，控制温度为36℃，培养24h，直至长出孢子；
(2)斜面培养后的枯草芽孢杆菌接种于种子培养基上，控制种子培养基pH7.3-7.5，控制温度为36℃，培养24h，种子培养基包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠10g/L；
(3)将经种子培养的种子液接种于发酵培养基上，进行发酵培养，发酵培养基组成为：豆粕35g/L，玉米粉15g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，磷酸氢二钾3g/L，硫酸镁1g/L，硫酸亚铁1g/L，碳酸钙1g/L硫酸锰1g/L，氯化钠10g/L，PH为7.5，配置成的发酵培养基灭菌后接入种子液，在38℃、转速为200rpm、pH值6-8小时控制在6.0-6.5之间，其后控制在7.0-7.4发酵罐中发酵培养55小时其发酵水平为470cfu/ml其中芽孢占比91％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。