一种丙酸杆菌及其在生产叶酸和烟酸中的应用的制作方法

技术领域：

本发明属于微生物领域，具体涉及一种丙酸杆菌及其在生产叶酸和烟酸中的应用。

背景技术：
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叶酸是一种由嘌呤、对氨基苯甲酸、多聚谷氨酸等三部分组成的水溶性b族维生素。它是细胞代谢不可或缺的重要成分，例如dna和rna的生物合成，以及一些维生素、氨基酸等的合成都离不开它。通常所说的叶酸(folate)包括叶酸(folicacid)及其同类物，包括四氢叶酸(tetrahydrofolicacid)、甲基四氢叶酸盐(methyltetrahydrofolate)、次甲基四氢叶酸盐(methenyltetrahydrofolate)、亚叶酸(folinicacid)等。人体缺乏叶酸会带来多种危害，如骨质疏松、提高罹患乳腺癌和结肠直肠癌的风险、造成认知障碍、神经管缺陷等等。叶酸缺乏也会影响到动物健康和生产性能，动物饲料中添加适量叶酸，能改善动物的免疫力、生产及繁殖性能等。

叶酸普遍存在于动植物和发酵食品中。一些细菌可以利用简单的前体如gtp、对氨基苯甲酸、谷氨酸盐合成叶酸。目前报道的合成叶酸的微生物主要有乳酸菌，如lactococcuslactis，streptococcusthermophilus，双歧杆菌如bifidobacteriumbifidum、bifidobacteriumlongum，丙酸菌如propionibacteriumsp.等。例如重要的工业菌株l.lactismg1363的叶酸总产量大约100ng/ml。牛奶是叶酸的一个重要来源，每升牛奶含20-50μg叶酸。工业上常利用streptococcusthermophilus、bifidobacteriumlongum等来生产发酵乳制品，特别是酸奶，可提高其中的叶酸含量至150μg/l。

烟酸，又称为维生素b3或维生素pp，是具有生物化学活性的全部吡啶-3-甲酸及其衍生物的总称。它是生物有机体内氧化还原反应的重要参与者，主要以辅酶i、辅酶ii形式作为脱氢酶的辅酶在生物氧化中起递氢体的作用，参与丙酮酸盐代谢、葡萄糖酵解、戊糖的生物合成和脂肪、氨基酸、蛋白质及嘌呤的代谢。当烟酸缺乏时生物体内的锌吸收率、肠道锌、血红蛋白和肝内铁的含量呈明显降低趋势，还会引起赖皮病。在饲料添加剂方面。动物体内的烟酸可以维持机体组织的完整性，并参与体内脂类、碳水化合物和蛋白质等物质的新陈代谢过程。通过抑制脂肪组织的动员作用，提高血糖浓度同时减少游离脂肪酸的释放，达到降低动物体内脂肪的生成，提高产奶量以及肉的品质。此外，烟酸对家禽的骨骼生长、抗应激反应、产蛋量及种蛋孵化率都有积极作用，是饲料中的重要添加剂。肠道微生物、瘤胃微生物被认为可产生烟酸。目前利用微生物生成烟酸，主要是利用微生物细胞的腈水解酶催化3-氰基吡啶生成烟酸和氨，如菌株nocardiagloberulanhb-2和rhodococcusrhodochrousj1。

技术实现要素：
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本发明的第一个目的是提供一种新的丙酸杆菌(corallicolasp.)scsio13291菌株，该菌于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.14538。

本发明的丙酸杆菌scsio13291从三亚鹿回头岸礁区(109°29′e，18°13′n)采集的珊瑚样本组织中分离获得。

本发明的菌株scsio13291(丙酸杆菌scsio13291)的特性：

形态学特征：

该菌株细胞革兰氏染色阳性，不运动，有氧培养时细胞呈球状或短杆状，细胞多成对或成簇(图1a)；在厌氧条件下细胞呈短杆状，细胞单个或成对(图1b)。

生理生化特征：

菌株scsio13291过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性，脲酶阴性，不能降解明胶、淀粉，不能还原硝酸盐，不产生硫化氢。生长ph范围为ph6.0～10.0，最适生长ph值8.0；生长温度范围为15℃～40℃，最适生长温度为30℃；能耐受10％的nacl浓度。碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、白氨酸芳氨酶、酸性磷酸酶、萘酚-as-bi-磷酸水解酶、α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、n-乙酰-葡萄糖胺酶均为阳性。类脂酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-甘露糖甙酶、β-岩藻糖甙酶均为阴性。能利用糊精、d-麦芽糖、d-海藻糖、龙胆二糖、蔗糖、d-松二糖、木苏糖、棉籽糖、d-乳糖、蜜二糖、d-水杨苷、n-乙酰-d-葡糖胺、n-乙酰-d-甘露糖胺、n-乙酰神经氨酸、α-d-葡萄糖、d-甘露糖、d-果糖、d-半乳糖、3-甲酰葡萄糖、d-果糖、l-果糖、l-鼠李糖、肌苷、d-山梨醇、d-甘露醇、d-阿拉伯醇、甘油、d-葡萄糖-6-磷酸、d-果糖-6-磷酸、d-天冬氨酸、氨基乙酰-l-脯氨酸、l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-组胺、l-焦谷氨酸、l-丝氨酸、胶质、d-半乳糖醛酸、l-半乳糖醛酸内酯、d-葡萄糖酸、d-葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、粘酸、奎宁酸、糖质酸、d-乳酸甲酯、α-酮戊二酸、d-苹果酸、l-苹果酸、溴-丁二酸、吐温40、γ-氨基-丁酸、β-羟基-d,l丁酸、α-酮-丁酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸、甲酸。不能利用d-纤维二糖、β-甲酰-d-葡糖苷、n-乙酰-d-半乳糖胺、d-丝氨酸、肌醇、p-羟基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、l-乳酸、柠檬酸、α-羟基-丁酸。

细胞化学分类特征：

细胞壁特征性氨基酸组分为d-dap，全细胞水解糖组分包括核糖，甘露糖，葡萄糖，鼠李糖。主要的呼吸醌为mk-9(h4)，主要的磷酸类脂成分为双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol)和磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol)。基因组dnag+c含量为71.2％。

系统发育特征：

提取菌株scsio13291的基因组dna，采用通用引物27f/1492r扩增16srrna基因片段并测序，其核苷酸序列如seqidno.1所示。对16srrna基因序列进行blast比对分析，发现其与菌株慢生棒状丙酸菌(propioniciclavatarda)wr061^t(序列号nr112669)的序列相似性最高，为94％。采用邻接法构建系统发育树，清晰的反映了该菌株与丙酸杆菌科(propionibacteriaceae)的成员之间的亲缘关系(图2)。菌株scsio13291属于丙酸杆菌科的成员，但它与其最近缘的棒状丙酸菌属(propioniciclava)之间在形态、生理特征、细胞壁特征氨基酸成分等方面显著不同，因此鉴定菌株scsio13291应为丙酸杆菌科的新属新种，命名为corallicolasp.scsio13291。

本发明的丙酸杆菌(corallicolasp.)scsio13291菌株用tsb培养基，培养温度为30℃时，培养87小时后，收集发酵液，采用国标gb5009.211-2014法检测，其胞外叶酸产量为35.71±6.64μg/l；采用国标gb5413.15-2010/第一法检测，其胞外烟酸产量为5.27±0.56mg/l。

因此，本发明的第二个目的是提供丙酸杆菌(corallicolasp.)scsio13291在生产叶酸和/或烟酸中的应用。

本发明的第三个目的是提供丙酸杆菌(corallicolasp.)scsio13291在制备食品、化妆品或饲料添加剂中的应用。

本发明提供了一种新的丙酸杆菌(corallicolasp.)scsio13291，该菌能够发酵高效生产大量叶酸和烟酸，可为叶酸和烟酸的微生物合成提供优良的菌株资源，也可用于饲料添加剂、益生菌剂等的开发。

本发明的丙酸杆菌(corallicolasp.)scsio13291于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.14538。

附图说明：

图1是本发明菌株scsio13291的显微形态透射电镜图；其中a为有氧培养时细胞的显微形态透射电镜图，b为厌氧培养时细胞的显微形态透射电镜图；

图2是基于16srrna基因序列构建的本发明菌株scsio13291及其亲缘关系最近的物种之间的系统发育树，图中的scsio13291即为本发明的菌株scsio13291。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：本发明菌株scsio13291的分离

在三亚鹿回头岸礁区(109°29′e，18°13′n)采集珊瑚样本，用无菌海水将采集到的珊瑚表面彻底洗净，取表面积为2cm²的珊瑚块，用无菌海水冲洗下珊瑚组织，震荡混匀作为珊瑚组织样品。取0.2ml的组织样品涂布于谷氨酰胺培养基(谷氨酰胺培养基的配方为：每升含有谷氨酰胺0.5g和琼脂粉15g，余量为海水，ph7.2)上，25℃培养30天后挑取菌落在isp2(internationalstreptomycesproject2)培养基上进一步纯化，得到菌株scsio13291。

本发明菌株scsio13291的特性：

形态学特征：

该菌株细胞革兰氏染色阳性，不运动，有氧培养时细胞呈球状或短杆状，细胞多成对或成簇(图1a)；在厌氧条件下细胞呈短杆状，细胞单个或成对(图1b)。

生理生化特征：

菌株scsio13291过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性，脲酶阴性，不能降解明胶、淀粉，不能还原硝酸盐，不产生硫化氢。生长ph范围为ph6.0～10.0，最适生长ph值8.0；生长温度范围为15℃～40℃，最适生长温度为30℃；能耐受10％的nacl浓度。碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、白氨酸芳氨酶、酸性磷酸酶、萘酚-as-bi-磷酸水解酶、α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、n-乙酰-葡萄糖胺酶均为阳性。类脂酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-甘露糖甙酶、β-岩藻糖甙酶均为阴性。能利用糊精、d-麦芽糖、d-海藻糖、龙胆二糖、蔗糖、d-松二糖、木苏糖、棉籽糖、d-乳糖、蜜二糖、d-水杨苷、n-乙酰-d-葡糖胺、n-乙酰-d-甘露糖胺、n-乙酰神经氨酸、α-d-葡萄糖、d-甘露糖、d-果糖、d-半乳糖、3-甲酰葡萄糖、d-果糖、l-果糖、l-鼠李糖、肌苷、d-山梨醇、d-甘露醇、d-阿拉伯醇、甘油、d-葡萄糖-6-磷酸、d-果糖-6-磷酸、d-天冬氨酸、氨基乙酰-l-脯氨酸、l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-组胺、l-焦谷氨酸、l-丝氨酸、胶质、d-半乳糖醛酸、l-半乳糖醛酸内酯、d-葡萄糖酸、d-葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、粘酸、奎宁酸、糖质酸、d-乳酸甲酯、α-酮戊二酸、d-苹果酸、l-苹果酸、溴-丁二酸、吐温40、γ-氨基-丁酸、β-羟基-d,l丁酸、α-酮-丁酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸、甲酸。不能利用d-纤维二糖、β-甲酰-d-葡糖苷、n-乙酰-d-半乳糖胺、d-丝氨酸、肌醇、p-羟基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、l-乳酸、柠檬酸、α-羟基-丁酸。

细胞化学分类特征：

细胞壁特征性氨基酸组分为d-dap，全细胞水解糖组分包括核糖，甘露糖，葡萄糖，鼠李糖。主要的呼吸醌为mk-9(h4)，主要的磷酸类脂成分为双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol)和磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol)。基因组dnag+c含量为71.2％。

系统发育特征：

提取菌株scsio13291的基因组dna，采用通用引物27f/1492r扩增16srrna基因片段并测序，其核苷酸序列如seqidno.1所示。对16srrna基因序列进行blast比对分析，发现其与菌株慢生棒状丙酸菌(propioniciclavatarda)wr061^t(序列号nr112669)的序列相似性最高，为94％。采用邻接法构建系统发育树，清晰的反映了该菌株与丙酸杆菌科(propionibacteriaceae)的成员之间的亲缘关系(图2)。菌株scsio13291属于丙酸杆菌科的成员，但它与其最近缘的棒状丙酸菌属(propioniciclava)之间在形态、生理特征、细胞壁特征氨基酸成分等方面显著不同，因此鉴定菌株scsio13291应为丙酸杆菌科的新属新种，命名为corallicolasp.scsio13291，该菌于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：cgmccno.14538。

实施例2：本发明丙酸杆菌(corallicolasp.)scsio13291的培养及叶酸、烟酸产量分析

将菌株scsio13291接种至100mltsb培养基(tsb培养基的配方为：每升含有胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨3.0g、葡萄糖2.5g、氯化钠5.0g和k2hpo42.5g，余量为水，ph7.3)中，30℃，180转/分钟，培养72小时，用作种子液。将该种子液以2％(v/v)的接种量接种至新鲜的tsb培养基中，30℃，180转/分钟，培养87小时后，于4℃，7000rpm离心15分钟，收集上清液，上清液采用冷冻真空干燥法避光冻干后，采用gb5009.211-2014法检测其叶酸含量，采用gb5413.15-2010/第一法检测其烟酸含量。空白tsb培养基冷冻真空干燥法避光冻干后，采用gb5009.211-2014法检测其叶酸含量，采用gb5413.15-2010/第一法检测其烟酸含量，分别作为叶酸和烟酸含量的本底值。检测结果为菌株scsio13291胞外叶酸产量为35.71±6.64μg/l，胞外烟酸产量为5.27±0.56mg/l。本发明的丙酸杆菌scsio13291能够发酵高效生产大量叶酸和烟酸，可为叶酸和烟酸的微生物合成提供优良的菌株资源，也可用于饲料添加剂、益生菌剂等的开发。

序列表

<110>中国科学院南海海洋研究所

<120>一种丙酸杆菌及其在生产叶酸和烟酸中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1452

<212>dna

<213>丙酸杆菌scsio13291(corallicolasp.scsio13291)

<400>1

agtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgg60

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