桔青霉LB及在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用的制作方法

本发明属于生物化工技术领域，是关于一种以连翘苷为原料生物转化制备连翘脂素的方法。

(二)

背景技术：

连翘脂素(phillygenin)，又名连翘苷元(CAS号为487-39-8，分子式为C₂₁H₂₄O₆，分子量为372.41)，属于双环氧木脂素类物质。连翘脂素具有多种生物活性，包括良好的抗氧化性，表现出非常强的DPPH、ABTS、FRAP自由基清除能力及降血脂活性；连翘脂素对人肝癌细胞(SMMC27721)、人宫颈癌细胞(Hela)、中国仓鼠肺成纤维细胞(V79)及小鼠黑色素肉瘤细胞(B16)具有体外抗肿瘤活性，也能降低高血脂症小鼠的血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，且可通过氧化途径来降低血脂水平；研究表明连翘脂素能预防或治疗由过氧化物引起的相关疾病，如类风湿关节炎，癌症，动脉粥样硬化和神经退行性疾病。

连翘脂素以游离状态存在于一些木犀科植物中，如连翘、流苏树和桂花等，因此可以从这些植物中分离获得，但其含量相对较低，如从产于河南的连翘叶提取连翘脂素的收率仅为0.162％(崔燕岩，冯少勇，赵光，等.连翘有效成分的HPLC法测定[J].药学学报，1992(8):603-608)。在上述植物中，连翘脂素更多的与葡萄糖结合成苷，即连翘苷(phillyrin，CAS号为487-41-2，分子式为C₂₇H₃₄O₁₁，分子量为534.56)，含量相对较高。如从产于河南的连翘叶提取连翘苷的收率可达3.14％，是连翘脂素含量的19.4倍。虽然连翘苷也具有多种生物活性，如清热解毒、排脓化瘀、抗氧化、抗病毒等药理作用，但是其口服吸收效果较差，对一些肿瘤细胞没有抑制活性。有研究报道，连翘苷在体内转化为连翘脂素后才能发挥效用。

可以看出，连翘脂素具有更好的药理活性，如将连翘苷转化为连翘脂素，对连翘资源的深度开发具有重要意义。目前，已有酶法转化的研究报道，如采用纤维素酶转化连翘苷，转化48h，转化率可达93.6％(中国发明专利CN 105331653 A)，但该方法的纤维素酶用量较大，是底物质量的1～10倍，酶的成本无疑较高；如果采用酸水解法，存在的问题则是副产物较多，构型容易转变，生成的同分异构体难以分离。

为了提高连翘脂素的生产效率，克服现有连翘脂素生产方法的不足，本发明采用微生物法转化连翘苷为连翘脂素(反应式见图1)，筛选获得了一株转化能力高、专一性好的微生物菌株，培养获得菌体，以菌体为生物催化剂，将连翘苷转化为连翘脂素，在底物浓度为2g/L时，转化得率可达90％以上。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一株产糖苷酶的微生物菌株—桔青霉(Penicillium citrinum)LB，及其在转化连翘苷制备连翘脂素中的应用。较好地克服现有酶解法中酶消耗量大的不足，本工艺具有成本低、流程简单、转化得率高和副产物少等优点。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株—桔青霉(Penicillium citrinum)LB，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60050，保藏日期2016年6月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。

本发明所述桔青霉LB，是从土壤中分离，经过筛选得到的优良菌株。所述桔青霉LB的形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，28℃条件下培养2天，即长出菌落。菌落初期为白色细绒毛状，之后表面逐渐呈灰绿色，产生大量绿色分生孢子，背面呈黄色。在显微镜下观察到菌丝有横隔，孢子梗顶端产生成串的青色分生孢子，分生孢子穗呈青霉属菌种特有的帚状。

所述桔青霉LB的18s rDNA部分核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种所述桔青霉LB在生物转化连翘苷制备连翘脂素中的应用。

所述的应用是将桔青霉LB经发酵培养后获得的湿菌体为生物催化剂，以连翘苷为底物，以甲醇为助溶剂，以含湿菌体的发酵液或将湿菌体悬浮于缓冲液中构成转化体系，于30～35℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得连翘脂素。

进一步，所述的转化体系是由含菌体的发酵液、连翘苷和甲醇构成；或将发酵液过滤，取湿菌体悬浮于等同发酵液体积、pH 6的磷酸缓冲液中，再加入连翘苷和甲醇构成转化体系。所述转化体系中生物催化剂用量以湿菌体干重计为1.51～1.64g/L。

进一步，转化体系中所述底物连翘苷的终浓度为1～2g/L，所述助溶剂甲醇的体积终浓度为1％～5％(优先选用甲醇溶解连翘苷，然后再加入转化体系)。

进一步，所述的转化反应条件为：在30～35℃、150～250r/min恒温振荡条件下转化18～24h。

进一步，所述生物催化剂按如下方法制备：将桔青霉LB接种至发酵培养基，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，获得发酵液，发酵液经过滤，收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖6～10g/L，(NH₄)₂SO₄ 4～7g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄5g/L，MgSO₄ 1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，溶剂为水，pH 5～7。

所述桔青霉LB菌株在发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养，再经过种子培养基扩大培养，然后用种子液接入发酵培养基进行培养。

所述生物催化剂制备方法为：(1)活化培养：将桔青霉LB菌种孢子接种于平板培养基，于28～30℃恒温培养2～3天，获得平板孢子，所述的平板培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，其终浓度组成为：马铃薯200g/L(马铃薯洗净去皮，切成小块，加5倍质量水煮沸20-30min，4层纱布过滤去渣留汁)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然；(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后桔青霉LB孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，得种子液，所述种子培养基，除不含琼脂外，其终浓度组成和配制方法同平板培养基；(3)菌体发酵：将种子液以体积浓度5％～10％的接种量接种至发酵培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3天，获得发酵液。所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖6～10g/L，(NH₄)₂SO₄ 4～7g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄5g/L，MgSO₄ 1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，溶剂为水，pH 5～7。

进一步，优选所述发酵培养基终浓度组成为：蔗糖7g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄ 1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，溶剂为水，pH 6。

本发明所述的连翘脂素分离纯化的方法为：在生物转化反应结束后，转化体系用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入原转化体系体积1/4的甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，于45℃下减压干燥，(优选滤液转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加少量甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净培养皿中，减压干燥后)，即得连翘脂素。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种利用桔青霉LB发酵获得生物催化剂，以连翘苷为底物制备连翘脂素的方法，在底物投料浓度为2g/L时，连翘脂素的转化得率为90.5％。相比于现有技术，采用本发明的技术优势有：桔青霉LB营养要求低、发酵时间短、抗污染能力强；生长快；转化反应专一性好，转化效率高，副产物少；本发明把活性低的连翘苷转化活性更好的连翘脂素，可大规模工业化应用，生产工艺具有周期短，转化率高，环境污染小等优点。

(四)附图说明

图1连翘苷转化为连翘脂素的化学反应式；

图2 HPLC法分析连翘脂素浓度的标准曲线；

图3转化样品的HPLC分析图谱，A为标准品连翘苷和连翘脂素的HPLC图谱；B为连翘苷转化0h的HPLC图谱；C为连翘苷经生物转化20h的HPLC图谱(实施例6样品)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1转化菌种的分离与筛选

采集花坛肥沃土壤，用无菌水稀释1×10⁶倍后涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃恒温培养4天，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，置于28℃恒温培养3天，得孢子丰富的菌株12株(菌株编号见表1)，保存于4℃冰箱中备用。

接种环分别挑取上述各个菌株的平板培养基上的孢子2环，接种到装有100mL初始发酵培养基中(250mL三角瓶装)，于30℃、200r/min振荡培养3天(不同菌株发酵液的干菌体浓度在1.42g/L～4.37g/L之间不等)，1mg的连翘苷溶于1mL甲醇后加入发酵液，使转化体系中连翘苷的浓度为10mg/L。三角瓶于30℃、200r/min恒温振荡转化18h。转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体后，用100mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用3mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中连翘脂素的浓度。

HPLC分析来自不同菌株发酵液转化样品中的连翘脂素浓度，计算连翘脂素的转化得率，由此比较不同菌株产酶转化连翘苷为连翘脂素的能力高低。12个菌株中，编号为LB的霉菌转化生成连翘脂素得率最高，转化液中连翘脂素的浓度为5.11mg/L，转化得率达到73.3％。

表1不同菌株转化连翘苷生成连翘脂素的浓度和得率

所述的PDA平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，再加入葡萄糖20g、琼脂20g，pH自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后分装于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入无菌培养皿，每皿25～30mL。

所述的初始发酵培养基按如下组成和方法配制：葡萄糖4g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄ 1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，pH 7，溶剂为水，250mL的三角瓶装100mL初始发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

所述HPLC分析方法为：LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温为室温；流动相为乙腈和水梯度洗脱(0～30min，乙腈体积分数变化为10％～100％，水体积分数变化为90％～0％；30～40min，100％乙腈)；流速0.8mL/min，检测波长277nm，进样量20μL。由相同分析条件下的标准品连翘脂素浓度-峰面积标准曲线(图2)，计算出转化样品中的连翘脂素的浓度。

所述的连翘脂素转化得率按以下公式计算：

式中，372.41为连翘脂素的分子量，534.56为连翘苷的分子量。

实施例2：菌株LB转化稳定性验证

以菌株LB为转化菌种，在100mL摇瓶发酵规模下，增加了种子扩大培养步骤，用含菌体的发酵液转化连翘苷，验证菌种的转化稳定性，具体工艺步骤如下：

(1)将4℃冰箱中保存的菌株LB平板菌种接种于新鲜平板培养基，平板于28℃恒温培养2天，所述的平板培养基组成和制备方法同实施例1；

(2)用接种环取步骤(1)活化培养后菌株LB孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为1.83g/L的种子液。所述种子培养基，除不含琼脂外，其终浓度组成和配制方法同平板培养基，250mL的三角瓶装50mL，经高压蒸汽121℃灭菌20min。

(3)步骤(2)种子液以体积浓度5％(即5mL)的接种量接种至100mL初始发酵培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天(干菌体浓度为2.76g/L)后，加入1mg的连翘苷(溶于1mL甲醇)，使转化体系中连翘苷的浓度为10mg/L。三角瓶于30℃、200r/min恒温振荡转化18h。所述的初始发酵培养基终浓度组成和配制方法同实施例1。

(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体后，用100mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用3mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中连翘脂素的浓度。

HPLC分析表明，按本实施例方法，菌株LB发酵液转化连翘苷，重复3批次实验，转化样品中连翘脂素平均浓度为4.96mg/L，转化得率平均为71.2％，3批次实验结果无显著性差异，表明菌株LB发酵转化连翘苷为连翘脂素的转化性能稳定。

实施例3：菌株LB的分类鉴定

将菌株LB接种在马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，28℃条件下培养2天，即可长出菌落。菌落初期为白色细绒毛状，之后表面逐渐呈灰绿色，产生大量绿色分生孢子，背面呈黄色。在显微镜下观察到菌丝有横隔，孢子梗顶端产生成串的青色分生孢子，分生孢子穗呈青霉属菌种特有的帚状。

将菌株LB交由生工生物工程(上海)有限公司进行18S rDNA测序，测得序列大小为1282bp，具体序列(SEQ ID NO:1所示)如下：

GCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTACAAACCCCGACTTCAGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTCGGGTCTCGTAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGGCCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGGATTCTATGATGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACAAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATCTTTTGGATGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGCATCTGCGGGCCGCTGGCTTC。

将该序列在GenBank上进行BLAST比对，与超过100株青霉属菌株有99％以上的同源性，与6株桔青霉菌株的18S rDNA序列有100％的同源性。依据18S rDNA序列，绘制的该菌株与青霉属不同种的系统发育树显示，该菌株与桔青霉亲缘关系较近，与青霉属其他种的亲缘关系相对较远，综合菌株LB的形态特征和18S rDNA的序列分析，可以确定菌株LB为一株桔青霉(Penicillium citrinum)，定名为桔青霉LB，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60050，保藏日期2016年6月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。

实施例4：桔青霉LB转化条件的优化

以桔青霉LB为转化菌种，在实施例2的基础上，优化了发酵培养基组成，提高的底物浓度，延长了转化时间，转化得率有显著提高，具体工艺步骤如下：

(1)将4℃冰箱中保存的桔青霉LB平板菌种接种于新鲜平板培养基，平板于28℃恒温培养2天，所述的平板培养基组成和制备方法同实施例1；

(2)用接种环取步骤(1)活化培养后桔青霉LB孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为1.78g/L的种子液。所述种子培养基组成和制备方法同实施例2。

(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即10mL)的接种量接种至100mL发酵培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2天(干菌体浓度为1.54g/L)后，加入0.2g的连翘苷溶于5mL甲醇的溶液，使转化体系中连翘脂素的浓度为2g/L(转化体系体积按100mL计)。三角瓶于35℃、250r/min恒温振荡转化18h。所述的发酵培养基终浓度组成为：蔗糖7g/L，(NH₃)₂SO₄ 5g/L，NaCl 5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄ 1g/L，MnSO₄ 0.5g/L，溶剂为水，pH 6。250mL的三角瓶装100mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体后，用100mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用5mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤，用甲醇稀释120倍后用HPLC分析样品中连翘脂素的浓度。

HPLC分析表明，按本实施例方法，用桔青霉LB菌株发酵液转化连翘苷，转化样品中连翘脂素浓度为1.26g/L，转化得率为90.5％。

实施例5：菌体缓冲液体系转化

以桔青霉LB为转化菌种，在实施例4的基础上，发酵液经过滤后收获菌体，悬浮于缓冲液中转化连翘苷，具体工艺步骤如下：

(1)将4℃冰箱中保存的桔青霉LB平板菌种接种于新鲜平板培养基，平板于30℃恒温培养2天，所述的平板培养基组成和制备方法同实施例1；

(2)用接种环取步骤(1)活化培养后桔青霉LB孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为1.86g/L的种子液。所述种子培养基组成和制备方法同实施例2。

(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即10mL)的接种量接种至100mL发酵培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养2天(干菌体浓度为1.51g/L)后，发酵液经布氏漏斗过滤，用pH 6的磷酸缓冲液100mL重新悬浮菌体于一只250mL三角瓶中，加入0.2g的连翘苷溶于5mL甲醇的溶液，使转化体系中连翘脂素的浓度为2g/L(转化体系体积按100mL计)。三角瓶于35℃、250r/min恒温振荡转化20h。所述的发酵培养基终浓度组成和配制方法同实施例4。

(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体后，用100mL乙酸乙酯萃取2遍，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用5mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤，用甲醇稀释120倍后用HPLC分析样品中连翘脂素的浓度。

HPLC分析表明，按本实施例方法，用桔青霉LB菌株发酵液转化连翘苷，转化样品中连翘脂素浓度为1.24g/L，转化得率为89.0％。相比于实施例4方法，虽然转化得率略有下降，但因菌体重悬于缓冲液中，体系中杂质较少，有利于后续产物的分离。

所述的pH 6的磷酸缓冲液配制方法为：称取Na₂HPO₄·H₂O 7.16g，用去离子水定容至100mL(A液)；称取NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g，用去离子水定容至100mL(B液)；取87.7mL的A液和12.3mL的B液混合，即得到100mL pH 6的磷酸缓冲液。

实施例6：生物转化法制备连翘脂素

在实施例5的基础上，发酵体系放大到400mL，制备菌体用于连翘苷的生物转化，转化体系放大到400mL，具体工艺步骤如下：

(1)将4℃冰箱中保存的桔青霉LB平板菌种接种于新鲜平板培养基，平板于30℃恒温培养2天，所述的平板培养基组成和制备方法同实施例1；

(2)用接种环取步骤(1)活化培养后桔青霉LB孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天，得干菌体浓度为1.75g/L的种子液。所述种子培养基组成和制备方法同实施例2。

(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即40mL)的接种量接种至400mL发酵培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2天(干菌体浓度为1.64g/L)后，发酵液经布氏漏斗过滤，用400mL、pH 6的磷酸缓冲液重新悬浮菌体于一只1L三角瓶中，加入0.8g的连翘苷溶于20mL甲醇的溶液，使转化体系中连翘脂素的浓度为2g/L(转化体系体积按400mL计)。三角瓶于35℃、250r/min恒温振荡转化24h。所述的发酵培养基终浓度组成同实施例4，1L的三角瓶装400mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌25min。

(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体后，用400mL乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入100mL甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加10mL甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净培养皿中，减压干燥后得0.597g连翘脂素。

称取步骤(4)制备的连翘脂素1mg溶解于5mL甲醇中，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中连翘脂素的浓度。以标准品连翘苷和连翘脂素为对照，同时检测连翘苷转化0h和20h的HPLC图谱。分析结果表明，按本实施例方法，制备的连翘脂素纯度为85.1％，转化得率为91.2％。