一种ERCC2基因的rs13181位点SNP核酸质谱检测方法与流程

本发明属于snp检测
技术领域：
，特别涉及一种ercc2基因的rs13181位点snp核酸质谱检测方法。
背景技术：
：单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。snp在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。ercc2基因又称dna切除修复基因，位于19号染色体13.2～13.3处，是核苷酸切除修复通路中的重要基因。ercc2基因具有多种功能，一方面参与核苷酸切除修复途径，并且可以在使用铂类药物化疗过程中取出铂-dna加合物；另一方面其编码的蛋白还参与组成ⅱ转录因子复合物及p53介导的凋亡反应，同时还参与基础转录。ercc2基因上存在中多snp位点，每个snp位点的不同表达形式均可能对上述病症产生不同的影响。其中rs13181位点的野生型为tt，同时还存在gt和gg两种形式的突变型。目前已有研究表明，这两种突变型均会增加皮肤黑色素瘤的患病风险，同时gg型还可能与卵巢癌的发生存在相关性。因此，提供一种高效、准确的snp检测方法，将会为研究ercc2对上述疾病的影响机制提供重要的参考信息和理论支持。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种ercc2基因的rs13181位点snp核酸质谱检测方法。本发明具体技术方案如下：本发明一方面提供了一种ercc2基因的rs13181位点snp核酸质谱检测引物组，包括如下引物：上游引物rs13181-f：5`-acgttggatgtaagaccttctagcaccacc-3`(如seq.id.no.1所示)；下游引物rs13181-r：5`-acgttggatgagcagctagaatcagaggag-3`(如seq.id.no.2所示)；延伸引物rs13181-e：5`-caatctgctctatcctct-3`(如seq.id.no.3所示)；ercc2基因的rs13181位点野生型碱基序列如seq.id.no.4所示。本发明另一方面提供了一种应用该引物组的ercc2基因rs13181位点snp核酸质谱检测方法，包括如下步骤：s1：用上游引物rs13181-f和下游引物rs13181-r进行第一轮pcr，对模板dna进行扩增，得到含有所述rs13181位点的片段；s2：对步骤s1得到的片段进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段；s3：用延伸引物rs13181-e对所述脱磷酸片段进行单碱基延伸，对不同snp进行分型；s4：对步骤s3得到的样品进行脱盐处理，用质谱仪进行检测。进一步地，步骤s1中，第一轮pcr的反应体系中包括如下组分：模板dna2ng/μl、rs13181-f引物0.05μm、rs13181-r引物0.05μm、mg2+4mm、1×pcrbuffer、dntp10μm以及taqdna聚合酶1u。进一步地，步骤s1中，第一轮pcr的反应条件如下：(1)预变性：95℃2min；(2)扩增：95℃30s，56℃30s，72℃60s，共45个循环；(3)延伸：72℃5min，4℃∞。步骤s1的目的是扩增出含有snp位点的片段，而非单独扩增snp位点，以提高样品的可操作性以及后续操作的精度；“4℃∞”即为保持在4℃下，以防止外界温度剧烈变化对扩增产物造成影响。进一步地，步骤s2中，去磷酸化的反应体系在第一轮pcr扩增产物的基础上还包括如下成分：0.24×sapbuffer以及sap酶0.5u。进一步地，步骤s2中，去磷酸化的反应条件如下：(1)去磷酸化：37℃40min；(2)sap酶灭活：85℃5min，4℃∞。步骤s2的目的是通过sap对步骤s1得到的扩增产物进行去磷酸化处理，防止dna分子5'端与3'端连接，在后续步骤准备好之前让dna分子保持线性状态，从而保证后续实验的准确度。进一步地，步骤s3中，单碱基延伸的反应体系在去磷酸化产物的基础上还包括如下成分：0.222×iplexgoldbuffer、1×iplexterminationmix、iplex延伸引物0.15μm以及1×iplexenzyme。进一步地，步骤s3中，单碱基延伸的反应条件如下：(1)预变性：94℃30s；(2)扩增内循环：94℃5s，52℃5s，共5个循环；(3)扩增外循环：94℃5s，52℃5s，80℃5s，共40个循环；(4)延伸：72℃4min，4℃∞。步骤s3的目的是对rs13181位点的序列进行单碱基延伸，从而实现不同snp的分型。本方案中，在变性-退火-延伸的外循环中间还对变性-退火设置内循环，以便充分将dna的双链解旋、分离，从而提高dna单链的分离程度以及单碱基延伸的准确性。进一步地，所述步骤s4包括如下步骤：s4.1：在树脂板上铺好洁净树脂待用，每孔6mg树脂，风干10～20分钟；s4.2：向样本板的样本空内加入待测样品，每个样本孔再加15～20μlddh2o，用封口膜密封，进行瞬时离心；s4.3：打开覆盖所述样本孔的封口膜，将所述样本板倒扣在所述树脂板上固定，将固定好的样本板和树脂板整体翻转，轻敲树脂板，以使树脂板中的树脂完全落入样本板上相应样本孔，用封口膜密封，进行瞬时离心；s4.4：将样本树脂混合物摇匀，在旋转器上慢速旋转15min后，在4000rpm条件下离心5min，离心后点样上机、用质谱仪对样品进行检测。步骤s4的目的是去除样品中溶解的盐类，防止盐类对质谱系统造成污染、影响信号的生成，从而保证测量结果的可靠性。本发明的有益效果如下：本发明提供了一种ercc2基因rs13181位点snp核酸质谱检测方法，首先通过第一步pcr反应扩增出含有snp位点的片段，而非单独扩增snp位点，以提高样品的可操作性以及后续操作的精度；通过sap对步骤s1得到的扩增产物进行去磷酸化处理，防止dna分子5'端与3'端连接，在后续步骤准备好之前让dna分子保持线性状态，从而保证后续实验的准确度；最后通过步骤s3对rs13181位点进行单碱基延伸，利用变性-退火内循环使dna双链充分解螺旋、分离，从而实现不同snp的精确分型。通过上述方法，可以快速、准确地获得ercc2基因rs13181位点的snp分型信息，操作简便、可靠性强，可以为后续的相关研究提供可靠的参考信息。附图说明图1为实验例1中不同方法的rs13181位点snp分型结果比较；图2为实验例2中所有样品的rs13181位点snp分型示意图；图3为实验例2中样品rs13181位点的tt纯合型的质谱图；图4为实验例2中样品rs13181位点的gt杂合型的质谱图；图5为实验例2中样品rs13181位点的gg纯合型的质谱图。具体实施方式实施例一种ercc2基因的rs13181位点snp核酸质谱检测方法，包括如下步骤：s1：用上游引物rs13181-f和下游引物rs13181-r进行第一轮pcr，对模板dna进行扩增，引物的碱基序列如下：上游引物rs13181-f：5`-acgttggatgtaagaccttctagcaccacc-3`；下游引物rs13181-r：5`-acgttggatgagcagctagaatcagaggag-3`；反应体系如下：反应条件如下：(1)预变性：95℃2min；(2)扩增：95℃30s，56℃30s，72℃60s，共45个循环；(3)延伸：72℃5min，4℃∞；s2：对所述步骤s1得到的扩增产物进行去磷酸化处理，得到脱磷酸片段，去磷酸化操作使用的sap混合液体系如下：使用浓度加入量(μl)nanopurewater,autoclavedn/a1.53sapbuffer0.24×0.17sapenzyme(1.7u/μl)0.5u0.30总体积[μl]2/rnx将上述sap混合液加入到步骤s1得到的扩增产物中，并按照如下反应条件进行去磷酸化处理：(1)去磷酸化：37℃40min；(2)sap酶灭活：85℃5min，4℃∞；s3：用延伸引物rs13181-e对所述脱磷酸片段进行单碱基延伸，对不同snp进行分型，延伸引物的碱基序列如下：rs13181-e：5`-caatctgctctatcctct-3`；反应体系如下：反应条件如下：(1)预变性：94℃30s；(2)扩增内循环：94℃5s，52℃5s，共5个循环；(3)扩增外循环：94℃5s，52℃5s，80℃5s，共40个循环；(4)延伸：72℃4min，4℃∞；s4：对所述步骤s3得到的样品进行脱盐处理，用质谱仪进行检测，具体包括如下步骤：s4.1：在树脂板上铺好洁净树脂待用，每孔6mg树脂，风干10～20分钟；s4.2：向样本板的样本空内加入待测样品，每个样本孔再加15～20μlddh2o，用封口膜密封，进行瞬时离心；s4.3：打开覆盖所述样本孔的封口膜，将所述样本板倒扣在所述树脂板上固定，将固定好的样本板和树脂板整体翻转，轻敲树脂板，以使树脂板中的树脂完全落入样本板上相应样本孔，用封口膜密封，进行瞬时离心；s4.4：将样本树脂混合物摇匀，在旋转器上慢速旋转15min后，在4000rpm条件下离心5min，离心后点样上机、用质谱仪对样品进行检测。对照例一种ercc2基因rs13181位点snp核酸质谱检测方法，其中单碱基扩增的反应条件如下：(1)预变性：94℃30s；(2)扩增内循环：52℃5s，80℃5s，共5个循环；(3)扩增外循环：94℃5s，52℃5s，80℃5s，共40个循环；(4)延伸：72℃4min，4℃∞；其余步骤和反应体系均与实验例相同。实验例1以本发明提供的方法作为实验组，以对照例提供的方法作为对照组1，以常规的taqman方法作为对照组2，分别对15ng的ercc2基因的rs13181位点标准品(包括5nggt杂合、5nggg纯合以及5ngtt纯合)进行检测，并对各组实验的分型定量结果进行比较。如图1所示，实验组与对照组1的分型结果均好于对照组2，并且实验组的定量结果高于对照组1、更加接近标准品的含量。表明本发明提供的方法对ercc2基因的rs13181位点的snp分型检测较现有方法更加准确、效果更好，同时说明本方法在单碱基延伸过程中设置的变性-退火内循环，比常规的退火-延伸内循环具有更好的snp分离和延伸效果。实验例2随机选取24名健康的成年(18～60周岁)志愿者，分别采集血样并提取全血基因组，按照实施例中提供的方法对24个样品进行rs13181位点snp检测，并对上述多个样品的质谱检测结果进行分析。如图2～5所示，所有样品均得到了可分析的结果，其中19个样品为tt纯合，3个样品为gg纯合，2个样品为gt纯合。表明该snp位点上tt的纯合子较多，gg的纯合子以及g-t杂合子也有检出。图2中不同基因型的样品点彼此分离、互相无相交，同时图3～5中不同分型的峰型和分离情况良好，表明本发明提供的引物特异性良好、灵敏度高，分型结果准确。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>沃森克里克（北京）生物科技有限公司<120>一种ercc2基因的rs13181位点snp核酸质谱检测方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>30<212>dna<213>人工合成()<400>1acgttggatgtaagaccttctagcaccacc30<210>2<211>30<212>dna<213>人工合成()<400>2acgttggatgagcagctagaatcagaggag30<210>3<211>18<212>dna<213>人工合成()<400>3caatctgctctatcctct18<210>4<211>201<212>dna<213>homosapiens<400>4cgctgggaaccagggccaggcaagactcaggagtcaccaggaaccgtttatggccccacc60cgccccactcagagctgctgagcaatctgctctatcctcttcagcgtctcctctgattct120agctgctccaggctgagcagggacaggcccagctgatcctcctgcagagaacagaggaaa180gggagaggggggcactgttgg201当前第1页12