本发明专利涉及到一种用于肺癌mirna检测的内参mirna基因的鉴定。
背景技术：
肺癌是全世界范围内肿瘤死亡的首要原因，在中国，肺癌的发病率逐年升高，死亡率也是位居肿瘤死亡首位。据世界卫生组织(who)估计，截至2025年，我国每年肺癌死亡病例将达到100万。近年来，尽管肺癌的诊断和临床治疗已取得很大进展，但患者的总生存时间仍很短，5年生存率不超过15％。目前的治疗手段对肺癌总生存率的提高效果不大，ii-iv期肺癌患者5年生存率大约在40％-5％之间，而i期患者5年生存率可高达92％。
已经证实，mirna在组织和细胞中的表达表现为显著的肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性。并且mirna在外周血中的表达同样具有肿瘤相关性和组织特异性，同时与rna比较，其表达稳定性更为显著。研究表明通过检测血浆或血清中的mirna以诊断肺癌可能是可行的、稳定的及具有可重复性的研究方向。
在基因表达研究中有各种因素可导致样品偏差，比如rna的数量和质量，但是表达数据能通过内参基因的校正来修正这种偏差。mirna内参基因的选择非常重要。有研究表明，内参基因的选择可对rt-pcr结果产生显著影响，若内参基因选择不恰当，将使样本间的基因表达差异被掩盖或者过度夸大，导致出现错误甚至与事实相反的结论。此外，由于mirna的特异性表达与肿瘤类型密切相关，因此在选择内参基因时需考虑肿瘤类型、样本来源以及实验方法等因素，以针对性地选择合适的内参基因。近年来出现了用人工合成的非人类(如线虫)mirna作为mirna检测标准化的外源性对照，但是，外源性对照不能纠正样本采集的差异，所以并不是理想的选择。同时，一些内源性基因常被用作组织/细胞mirna检测的内参基因，比如5srrna、18srrna和u6等，但是由于这些基因不是mirna，不能代表mirna的组分，而且这些基因的提取、反转录和pcr扩增的效率可能与mirna有所不同。因此，这些基因也不是最理想的选择。目前尚无研究对肺癌研究中mirna标准化的最佳参照基因进行系统性的鉴定和评估，因此，本领域迫切需要开发能够作为肺癌研究中microrna标准化的参照基因，并建立检测mirna，特别是循环mirna的有效标准化方案。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明公开了一种肺癌mirna检测的内参mirna基因的鉴定。
具体地，本发明提供一种mirna在制备用于肺癌mirna检测的内参试剂的应用，其特征在于：所述mirna为hsa-mir-345-5p。
本发明还提供一种mirna的组合在制备用于肺癌mirna检测的内参试剂的应用，其特征在于：所述组合为hsa-mir-345-5p和hsa-mir-99b构成的组合。
其中hsa-mir-345-5p的序列为：5’-gcugacuccuaguccagggcuc-3’，hsa-mir-99b的序列为：5’-cacccguagaaccgaccuugcg-3’。
本发明还提供用于肺癌mirna检测的内参试剂在制备诊断肺癌的试剂盒中的应用。提供一种诊断肺癌的试剂盒，该试剂盒含有用于检测内参mirnahsa-mir-345-5p或者hsa-mir-345-5p和hsa-mir-99b的组合的试剂。
进一步地，所述试剂盒还包含用于mirna提取及qrt-pcr反应所需的rna分离液、试剂和酶，以及标准品或/和对照品。
本发明还提供一种检测肺癌患者血浆或血清中mirna的相对表达量的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测血浆或血清的总rna并反转录为cdna；
(2)以步骤(1)获得的cdna为模板，分别检测其中目的mirna的编码序列的含量和hsa-mir-345-5p的编码序列的含量；
(3)根据步骤(2)的结果，以所述hsa-mir-345-5p为内参基因，计算目的mirna的相对表达量。
进一步地，提供一种检测肺癌患者血浆或血清中mirna的相对表达量的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测血浆或血清的总rna并反转录为cdna；
(2)以步骤(1)获得的cdna为模板，分别检测其中目的mirna的编码序列的含量和hsa-mir-345-5p、hsa-mir-99b的编码序列的含量；
(3)根据步骤(2)的结果，以所述hsa-mir-345-5p和hsa-mir-99b为内参基因，计算目的mirna的相对表达量。
本发明提供的血清/血浆mirnas检测内参的优点在于：
(1)血清/血浆mirnas是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子rna内参的成功研究有助于血清/血浆mirnas在肺癌疾病早期诊断及预后判断等方面价值的临床转化，以及不同实验室之间研究结果的比较。
(2)血清/血浆mirnas内参检测试剂盒可用于检测不同受试者血清/血浆中的内参mirnas，有助于反映不同受试者内参mirna的基线表达水平，用于控制个体生物学差异导致的mirna表达水平差异，以凸显真正与疾病相关的差异表达mirna。
(3)采用严密的筛选和验证方案，本发明人初期采用基因芯片对肺癌和正常人血清/血浆mirnas进行表达量分析，以获取稳定表达的血清/血浆mirnas，并应用qrt-pcr(探针法和染料法)的方法进行了单个样本验证；以上方法和策略的应用保证了血清/血浆mirnas内参检测试剂盒的准确性。
总之，hsa-mir-345-5p或者hsa-mir-345-5p和hsa-mir-99b的组合在肺癌患者中稳定表达，用hsa-mir-345-5p或者hsa-mir-345-5p和hsa-mir-99b的组合作为内参基因可以实现不同实验室间研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理，进而促进血清/血浆mirna研究结果向临床成果转化，为临床医生提供更加精确的诊断、分型、预后判断以及个体化治疗的有力工具。以单个mirna或两个mirna的组合作为血清或血浆中的内参基因，适用于高、低通量的检测平台，对于大规模临床检测应用，降低了操作难度，简化了操作流程。
具体实施方式
实例1肺癌病人外周血中mirna表达分析
一材料和方法
1、材料
肺癌病人外周血均来自因肺癌住院病例，分别取30例肺癌病人和20例正常人外周血。
2、方法
2.1、外周血总rna的提取
按triazol试剂盒说明书提取肺癌病人和正常人外周血细胞的总rna，通过凝胶电泳证明rna的完整性，用核酸蛋白仪测定rna的浓度和纯度。步骤如下：
(1)收集病人外周血，离心收集细胞，每管加入1mltrizol试剂，混匀，室温放置5min。加入氯仿200μl，用力振荡15sec，室温孵育2～3min。
(2)在4℃下以12000×g的速度离心15min，混合物分为红色的酚-氯仿相(下相)、白色的中间相以及无色的上层水相。总rna分散在上层水相中。
(3)将上层水相转移到一个新的eppendorf管中，加入1ml无水乙醇，混匀以沉淀rna。
(4)室温孵育10min以上，在4℃下以12000×g的速度离心10min，可见白色的rna沉淀贴于试管底壁。
(5)弃上清，用70％的乙醇洗涤rna沉淀一次，在4℃下以7500×g的速度离心5min。
(6)弃上清，空气中自然干燥，用60μldfpc水溶解沉淀，-70℃保存备用。
(7)总rna完整性鉴定：取2μlrna样品在1.5％琼脂糖凝胶电泳(60v，30min)，分出区带后eb染色，紫外灯下拍照观察。
(8)用核酸蛋白仪测定rna的浓度及纯度。
2.2基因芯片杂交及数据分析
取100ng提取的外周血mirna，使用安捷伦公司的mirnacompletelabelingandhyb试剂盒，按照说明书步骤进行样本的标记和浓缩，使用安捷伦公司的人mirna表达谱芯片进行杂交。使用芯片扫描仪进行图像扫描以后，把数据导入genespringcx11.0软件进行数据的标准化处理及后续的分析，将芯片归一化后的有效数据应用专业软件进行分析。
实施例2血清/血浆中mirna的qrt-pcr验证
根据芯片杂交结果，选择符合下列标准的mirna分子利用qrt-pcr技术进行进一步筛选：a)在肺癌和对照组中的表达水平在前100名；b)在两组均稳定表达，且两组之间无明显差异(p≥0.05)。根据以上标准，共选出9个符合要求的mirna分子(包括hsa-mir-140-5p、hsa-mir-26a、hsa-mir-99b、hsa-mir-106b、hsa-mir-151-5p、hsa-mir-23a、hsa-mir-342-3p、hsa-mir-345-5p、hsa-mir-16-5p)，9个mirna分子的序列如表1所示。此外，由于u6常被作为组织mirna检测的内参分子，为验证其在血清中可否作为内参，u6也作为候选分子被纳入筛选。通过对上述9个mirna及u6采用qrt-pcr技术在另外一组受试者(包括10例肺癌和10例对照)中进行验证，有5个候选分子因表达水平较低而被排除(hsa-mir-140-5p、hsa-mir-26a、hsa-mir-23a、hsa-mir-106b、hsa-mir-151-5p)。对剩余5个分子(hsa-mir-99b、hsa-mir-342-3p、hsa-mir-345-5p、hsa-mir-16-5p及u6)，采用normfinder、genorm软件进行表达稳定性分析。
表1mirna候选内参序列
整个研究过程均实施严格质控，每个样本连续检测三次且所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。具体步骤如下：
(1)制备rna样品：参见实施例1
(2)探针法实时定量pcr：使用abi试剂盒。
a)通过rna逆转录反应得到cdna。探针法的逆转录反应体系包括0.15μl100mmdntps混合物、1μl逆转录酶(50u/μl)、1.5μl10x逆转录缓冲液、0.19μlrna抑制剂以及3μl5×逆转录引物(上述9个mirna及u6的逆转录引物混合物，每种mirna加入3/4μl逆转录引物)。加入9.16μl的总rna。反应步骤为16℃孵育30分钟，42℃反应30分钟，85℃孵育5分钟；
b)q-pcr：将cdna加入5μl水稀释，取1μl稀释后的cdna，分别加入0.25μl20×microrna检测探针(上述9个mirna及u6的探针)、2.5μl2×基因表达mastermix、1.25μl双蒸水，5μl体系进行q-pcr。仪器使用的是abiprism7900荧光定量pcr仪，pcr的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行45个循环。
(3)染料法实时定量pcr：
a)通过rna逆转录反应得到cdna。染料法的逆转录的反应体系包括4μl5×amv缓冲液、2μl10mmdntp混合物(takara公司)、0.5μlrnase抑制剂(takara公司)、2μlamv(takara公司)以及1.5μlmirna特异性反向引物的混合物(上述9个mirna及u6的特异性反向引物混合物)，每种加入1.5/4μl)。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；
b)q-pcr：将cdna按1/5体积稀释，取0.5μl稀释后的cdna，加入0.15μltaq酶(takara公司)，0.5μl20×evagreen，0.1μl10μm正向引物一种(即分别采用上述9个mirna及u6对应的正向引物)，0.1μl10μm通用反向引物(urp：tggtgtcgtggagtcg)，0.6μl25mmmgcl2，0.8μl2.5mmdntp混合物(takara公司)，1μl10×pcr缓冲液，6.75μlh2o，10μl体系进行q-pcr。仪器使用的是abiprism7900荧光定量pcr仪，pcr的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行45个循环。
(4)数据处理与分析
对所有样本血清的各mirna分子三次检测结果(ct值)取平均值，排除表达水平较低(ct值中位数大于38)的mirna分子，对剩余分子采用one-wayanova方法分析各个mirna在不同样本组之间是否有表达差异，运用normfinder及genorm计算各个mirna的稳定性(见表2)。由表1可知，若采用单个mirna作为血清内参，hsa-mir-345-5p为稳定性最高的内参，而hsa-mir-345-5p及hsa-mir-99b的组合稳定性更佳。
因此，本发明人证明了hsa-mir-345-5p单独及hsa-mir-345-5p和hsa-mir-99b构成的组合能够稳定地在各肿瘤病人和健康对照中表达。
表2mirna内参的稳定性分析
实施例3表达稳定性的进一步验证
根据qrt-pcr筛选结果，has-mir-345-5p或者has-mir-345-5p与has-mir-99b的组合为表达稳定候选内参基因。采用qrt-pcr方法在一组新的受试样本(包括12个肝癌和12个对照样本)中对其稳定性进行验证，结果显示其在肝癌和正常样本中均稳定表达，具有较好的稳定性。
实施例4于血清/血浆mirna内参检测试剂盒的制作
试剂盒包括血清/血浆mirna引物(包括单独的has-mir-345-5p的引物或者has-mir-345-5p的引物与mir-99b的引物组合，还可以有相应pcr反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dntps，mgcl2，去核酸酶水，荧光染料或探针、taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照。此试剂盒的价值在于可检测肺癌血清/血浆mirna的内参，为不同实验室间研究结果的比较提供依据，以促进相关研究结果的临床转化，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断和更有效的个体化治疗。