一群与口腔鳞癌发生发展相关基因的制作方法

专利名称：一群与口腔鳞癌发生发展相关基因的制作方法
技术领域：
本发明关于一群基因，特别关于一群与口腔鳞癌发生发展相关基因。
背景技术：
口腔鳞癌占全身恶性肿瘤的4％，由于口腔位于呼吸道与消化道的重要位置，病变结果严重影响患者的生活和生存质量。目前研究肿瘤发生发展机制的常用方法之一是检测临床标本中的一些分子标记物的表达情况，从而推测这些分子标记物和肿瘤的相关性。方法二是以已经建立的肿瘤细胞系为研究对象。通过检测临床标本中的分子标记物表达情况的方法可以在一定程度上阐述某些因子和肿瘤发生发展的关系，但它受标本的限制，不能动态地观察细胞恶变过程，不能系统研究肿瘤的发生机制；目前已经建立的肿瘤细胞系在一定程度上为肿瘤发生机制的研究提供了实验平台，但也不能在纵向研究肿瘤的发生发展机制。上述技术一次性只能研究个别基因与肿瘤的相关性，而基因芯片技术可以满足高通量检测的要求，更加全面地研究肿瘤发生、发展机制相关基因。

发明内容
本发明的目的在于提供一群与口腔鳞癌发生发展相关基因。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的通过基因芯片技术筛选口腔鳞癌体外癌变模型各细胞系间的差异表达基因，进一步验证差异基因在细胞癌变过程中的表达情况，动态地研究口腔鳞癌癌变发生、发展进程中恶变相关基因表达情况，为进一步预防和治疗鳞癌提供候选基因。
首先通过转染HPV 16 E6/E7永生化口腔上皮细胞系，采用化学致癌剂苯丙芘或复合促癌剂佛波酯诱导永生化细胞恶变；这样在生物因素(人乳头状瘤病毒)，化学致癌因素(苯丙芘)，促癌因素(佛波酯)以及血清等方面体现了癌变过程中多因素作用的过程；细胞在从正常粘膜上皮细胞到永生化，然后逐步表现出恶性细胞特性，最终恶变的过程。这一过程很好地验证了肿瘤多因素、多阶段、多步骤发生学说。该模型在一定程度上反映了体内口腔黏膜上皮细胞的癌变过程。(上述部分已经申请专利见本申请人申请的中国发明专利“一种口腔粘膜上皮细胞癌变模型”其专利申请号200510028310.5)进一步通过Affymetrix PLUS 2.0(USA)寡核苷酸芯片检测永生化上皮细胞HIOEC、HIOEC-B(a)P(56G)和HIOEC-B(a)P(96G)细胞基因表达谱，采用GeneSpring 7.01软件分析芯片结果，得到上述各细胞系间的差异表达基因谱。筛选差异倍数在2倍以上的基因，选取可能与肿瘤发生、发展关系密切的候选基因。采用RT-PCR和实时定量PCR验证差异表达基因。在口腔鳞状细胞癌体外多因素、多阶段、多步骤癌变模型的基础上，筛选到与肿瘤发生发展相关基因。相关基因具有如SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5、SEQID6、SEQID7、SEQID8、SEQID9、SEQID10、SEQID11所示的核苷酸序列。
本发明所公开一群与口腔鳞癌发生发展相关基因，其优点表现在
(1)首先我们建立的口腔黏膜上皮细胞体外癌变模型可以动态地反映肿瘤发生发展过程；(2)Affymetrix寡核苷酸基因芯片包含人类全基因组信息，具有高通量和高准确性的优点；(3)芯片检测结果通过Genespring软件分析以及综合生物信息学分析可以筛选到与肿瘤发生发展相关候选基因。


图1显示永生化上皮细胞在化学致癌剂诱导早期细胞形态学。
图2显示永生化上皮细胞在化学致癌剂和促癌剂诱导早期细胞形态学。
图3显示永生化上皮细胞在化学致癌剂作用后细胞形态学。
图4显示永生化上皮细胞在化学致癌剂和促癌剂作用后细胞形态学。
图5显示HIOEC-B(a)P细胞软琼脂集落形成能力。
图6显示HIOEC-B(a)P-TPA细胞软琼脂集落形成能力。
图7显示显微镜放大200倍观察第55代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
图8显示显微镜放大400倍观察第55代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
图9显示显微镜放大200倍观察第69代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
图10显示显微镜放大400倍观察第69代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
图11显示显微镜放大200倍观察第96代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
图12显示显微镜放大400倍观察第96代HIOEC-B(a)P细胞在裸小鼠皮下的成瘤性。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1I、在已经建立的HPV 16 E6/E7永生化口腔上皮细胞系的基础上，采用化学致癌剂苯丙芘(benzo(a)pyrene，B(a)P)诱导培养，B(a)P的浓度为0.1-1.2μg/ml，体外递增浓度、间歇诱导培养6个月；诱导细胞第18代克隆培养，第21代改用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养；体外连续传代培养1年，建立恶性细胞系HIOEC-B(a)P(见图1)。
II、通过软琼脂集落形成和裸小鼠皮下成瘤性鉴定诱导细胞的恶性表型。不同培养时期的细胞接种裸小鼠皮下形成不同恶性程度的肿瘤。(见图2，图3)III、分别培养永生化上皮细胞HIOEC、HIOEC-B(a)P(56G)和HIOEC-B(a)P(96G)细胞，待细胞生长至80％铺满培养瓶(25cm2)底时，弃去培养液，每瓶细胞分别加入2ml TRIzol reagent(Invitrogen，USA)，充分吹打后将液体吸入1.5ml离心管中，-80℃保存备用。每种细胞分别收集4份，其中3份用于芯片检测重复实验3次，1份备做验证芯片结果。
IV.总RNA的提取和纯化1.样品置冰上融化后，用加样枪反复吸吹，使样品充分裂解，移入1.5ml离心管中，室温静置3～5分钟。
2.在离心管中每1mlTRIzol起始量加200ul氯仿，振荡混匀。
3.将离心管在4℃，12000rcf，离心15分钟。
4.用移液器小心吸出上层水相，加入另一离心管中，每ml TRIzol起始量加入500ul异丙醇。
5.-20℃，沉淀过夜。
6.4℃，12000rcf，离心10分钟。
7.小心移出上清。
8.沉淀中加入1mL 75％乙醇，4℃，12000rcf，离心10分钟。
9.重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀。
10.去上清，稍微晾干，RNA略显透明，加入适当体积(30ul)的RNase-free的水，充分溶解。
V.定量和检测总RNAa)紫外定量和检测1)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD＝40ug/ml。
2)根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。
b)变性胶电泳质检1)配制1.2％的电泳胶10×MOPS Gel Buffer 10mlAgrose1.2g
RNase-Free Water90ml加热溶解Agrose，稍微冷却，加入37％甲醛 1.8mlEB(10mg/ml) 1ul摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1×MOPS Gel Buffer中平衡10分钟，待用。
2)样品变性5×Loading Buffer2ulRNA样品 1ugRnase-Free water 调节至10ul在65℃，变性5分钟，立即置于冰上冷却。
3)电泳将处理好的RNA样品，稍微离心，70V恒压电泳1小时。在凝胶成像仪上观察结果。
VI.纯化总RNARNeasy Mini Kit1.将总RNA的体积用RNase-free的水调整到100ul，(因QIAGEN纯化柱的最大上样量为100ugRNA，所以一般取RNA不大于100ug)。
2.加入350ul RLT工作液(1ml RLT中加10ul 2-ME，混匀而成)，充分混匀。
3.加入250ul无水乙醇，充分混匀(不要离心)。
4.将混好的700ul样品加到QIAGEN纯化柱中，＞8000rpm，离心15秒。
5.弃滤液，加入500ul RPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，＞8000rpm，离心15秒。
6.弃滤液，加入500ul RPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成)，＞8000rpm，离心2分钟。
7.将纯化柱放入一个新的收集管，最大转速，离心1分钟。
8.将纯化柱换入一个EP管中，在纯化柱膜中间加25ul RNase-free的水，室温放置1分钟，最大转速，离心1分钟。
9.将EP管中的样品移入一个新的EP管中。
VII.纯化总RNA的定量和检测(同V)a紫外定量和检测总RNA的浓度和OD260/OD280。
b变性胶电泳质检VIII.cDNA的合成和纯化1.1stcDNA的合成(Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit)a)总RNA5～16ug(8ug，不足取10ul)b)RNase-free water 补至10ulT7-(dT)24 Primer(50uM) 2ul混匀，70℃温浴10分钟，置于冰上至少2分钟，离心片刻；c)5×1st Strand Buffer 4ulDTT(0.1M) 2uldNTP(10mM) 1ul混匀，42℃，温浴2分钟；d)SuperScript II RT(200U/ul)2uL(8～16ug起始)
1uL(5～8ug起始)e)混匀，42℃，温浴1小时。
2.2ndcDNA的合成(Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit)a)将1st cDNA合成产物置于冰上，加入下列试剂Component VolumeRNase-Free water91ul5×2nd Strand Buffer30uldNTP(10mM) 3ulE.coli DNA Ligase(10U/ul) 1ulE.coli DNA Polymerase(10U/ul) 4ulE.coli RNase H(10U/ul) 1ulTotal Volume130ul混匀，16℃，反应2小时；b)加入2ul T4 DNA Polymerase，混匀，16℃，5分钟；c)加入10ul EDTA(0.5M)，混匀，终止反应。
-20℃保存或进行下步纯化。
3.纯化cDNA(Affymetrix GeneChip Sample Cleanup Module)a)将600ul cDNA Binding Buffer加入cDNA合成产物中，振荡混匀3秒。
b)将500ul液体移入cDNA Cleanup Spin Column管中，不要振荡，＞＝10000rpm，室温离心1分钟，弃滤液。
c)将剩余液体移入cDNA Cleanup Spin Column管中，不要振荡，＞＝10000rpm，室温离心1分钟，弃滤液。
d)换一个新收集管，加入750ul cDNA Wash Buffer，最大转速离心1Min，弃滤液。
e)打开盖子，最大转速离心5Min，弃滤液。
f)将柱子转移至1.5mL的收集管中，加入14ul的cDNA Elution Buffer。室温静置1分钟，最大转速离心1分钟。
IX.cRNA的合成和纯化1.IVT合成cRNA(GeneChip IVT Labeling Kit)ReagentVolumeTemplate cDNA 12ulRNase-Free water 8ul10×IVT Labeling Buffer4ulIVT Labeling NTP Mix 12ulIVT Labeling Enzyme Mix4ulTotal Volume 40ul混匀，稍离心，37℃温浴16小时。
合成产物可保存在-20℃或直接进行下一步纯化。
2.纯化cRNA(Genechip Sample Cleanup Module)1)加入60ul RNase Free水，振荡混匀3’。
2)加入350ul IVT cRNA binding Buffer，振荡混匀3’。
3)加入250ul无水乙醇，用加样枪混匀。
4)将以上混合液加入cRNA Cleanup Spin Colum，＞＝10000rpm，离心15’，弃滤液。
5)将柱子移至1.5mL的收集管，加入500ul的IVT cRNA WashBuffer，＞＝10000rpm，离心15’，弃滤液。
6)加入500ul 80％乙醇，＞＝10000rpm，离心15’，弃滤液。
7)换一个收集管，打开盖子，＞＝10000rpm，离心5min，弃滤液。
8)将柱子转移至1.5mL的收集管，加入11ul的Rnase Free水，＞＝10000rpm 1min。
9)加入10ul的Rnase Free水，＞＝10000rpm 1min。
cRNA的定量和检测a.用紫外分光光度计测量cRNA的浓度和OD260/OD280b.变性胶检测cRNA取2ug cRNA在1.2％的变性胶上电泳，纯化的cRNA应该呈弥散状长条带。
X.cRNA片段化、配制杂交液1.片段化cRNAa.校正cRNA浓度根据公式 cRNA的测量浓度；VcRNA的洗脱体积；M合成cRNA时所用总RNA的量；RcRNA的回收得率；[校正cRNA]cRNA校正后的浓度。
b.配制片段化反应体系根据校正cRNA的浓度片段化(40ul)cRNA15ug5×Fragmentation Buffer 6ulRNase-Free Water 补充至30ulc.片段化混匀，94℃温浴35分钟，之后置于冰上。
d.片段化cRNA的质检变性胶电泳质检，片段化cRNA约为35～200bp。
2.配制杂交液根据芯片类型按下表配制适当量的杂交液见表1表1

XI.芯片杂交先进行测试芯片的杂交、洗染和分析，根据测试芯片的结果再杂交表达谱芯片。
1和2同时进行，直到第3步1.预杂交芯片1)取出芯片，平衡至室温；2)加入1×杂交Buffer；3)45℃，60rpm，预杂交10分钟。
2.杂交液的准备1)杂交液混匀，离心片刻；2)99℃，温浴5分钟；
3)将杂交液转至45℃，温浴5分钟；4)离心机最大转速离心5分钟。
3.杂交芯片1)吸出芯片中的1×杂交Buffer；2)将杂交液加入到芯片中；3)45℃，60rpm，杂交16小时；4)杂交结束后，吸出芯片中的杂交液，加入洗液A，进行后面的洗染过程。
XII.洗脱芯片在洗脱工作站上按照芯片类型，运行洗脱程序。
XII.扫描芯片扫描仪上扫描芯片。
XIV.数据分析结果见表21.应用Genespring 7.01软件进行数据分析。
2.Normalization方法将芯片所有探针组的Signal从小到大排序，去掉最大的2％和最小的2％后，将剩下探针组的平均信号值调整到500。
表2 一群与口腔鳞癌发生发展相关基因表达差异结果

H＝HIOEC细胞A＝HIOEC-B(a)P细胞96G(成瘤)B＝HIOEC-B(a)P细胞56G(不成瘤)C＝HIOEC-B(a)P-TPA细胞75G(软琼脂克隆)D＝HIOEC-B(a)P-TPA细胞47G(软琼脂无克隆)
序列表<110>上海交通大学医学院附属第九人民医院<120>一群与口腔鳞癌发生发展相关基因<130>/<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2737<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1ctgaacctca gccgcgccgg gaggcgagcc cgttggcgag gggcggggca gatggcgagg 60gagcggggcg agctgctttt tgaggctgcg cactcgcatg gccccacctc gcaggtccac120ttccggcgcc gcggctgttc cgggcggaga ccgcttgtgc tggagtcgga gttgtaacgc180tccactgact gatagagcga ccggccgacc atggcgcccg gagtggcccg cgggccgacg240ccgtactgga ggttgcgcct cggtggcgcc gcgctgctcc tgctgctcat cccggtggcc300gccgcgcagg agcctcccgg agctgcttgt tctcagaaca caaacaaaac ctgtgaagag360tgcctgaaga acgtctcctg tctttggtgc aacactaaca aggcttgtct ggactaccca420gttacaagcg tcttgccacc ggcttccctt tgtaaattga gctctgcacg ctggggagtt480tgttgggtga actttgaggc gctgatcatc accatgtcgg tagtcggggg aaccctcctc540ctgggcattg ccatctgctg ctgctgctgc tgcaggagga agaggagccg gaagccggac600aggagtgagg agaaggccat gcgtgagcgg gaggagaggc ggatacggca ggaggaacgg660agagcagaga tgaagacaag acatgatgaa atcagaaaaa aatatggcct gtttaaagaa720gaaaacccgt atgctagatt tgaaaacaac taaagcgctc cagcacatca gtcccgacgc780ttcctgtgag gtgcacgctc cgcagcccag cccagccggg agaccacgtg gccattgcgg840tctcctgacc ttggccagtg aacctgccag ccttccagga caggcggccg gagagctgcc900cctgaaggac agtcctctcg tcttgcagac tggtgacctt ctattccctg ttcatctctg960tttctagatt tagtcacttg aaataagaaa tctttggggt ttgggctttt ttatactctt 1020
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权利要求
1.一群与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID1所示的核苷酸序列。
2.一群与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID2所示的核苷酸序列。
3.一群与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID3所示的核苷酸序列。
4.一群与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID4所示的核苷酸序列。
5.一群与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID5所示的核苷酸序列。
6.一群与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID6所示的核苷酸序列。
7.一群与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID7所示的核苷酸序列。
8.一群与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID8所示的核苷酸序列。
9.一群与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID9所示的核苷酸序列。
10.一群与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID10所示的核苷酸序列。
11.一群与口腔鳞癌发生发展相关基因，其特征在于它具有如SEQ ID11所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明关于在口腔鳞状细胞癌体外多因素、多阶段、多步骤癌变模型的基础上，筛选到与肿瘤发生发展相关基因。相关基因具有如SEQID1、SEQI D2、SEQID3、SEQID4、SEQID5、SEQID6、SEQID7、SEQID8、SEQID9、SEQID10、SEQID11所示的核苷酸序列。本发明验证差异基因在细胞癌变过程中的表达情况，动态地研究口腔鳞癌癌变发生、发展进程中恶变相关基因表达情况，为进一步预防和治疗鳞癌提供候选基因。
文档编号C12Q1/68GK1800391SQ20051011165
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月19日 优先权日2005年12月19日
发明者潘红芽, 张志愿, 李金忠, 周晓健, 曹俊, 帕提曼, 陈万涛, 张萍 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院