一种心脑血管疾病精准用药基因检测固相PCR试剂盒的制作方法

本发明涉及pcr应用
技术领域：
，尤其涉及的是一种心脑血管疾病精准用药基因检测固相pcr试剂盒。
背景技术：
：我国每年因心脑血管疾病死亡的人数达350万，平均每10秒就有1人死于心脑血管疾病。可见，防治心脑血管疾病已成为保障人类健康的头等大事。由于每个人的遗传原因、性别、身高体重、所处环境、生活方式等均不相同，导致治疗效果差别较大。现在临床医师用药原则上都是遵循治疗指南，但指南针对的是群体，而个体差异是很大的。精准医学通过基因检测及后天因素综合分析，制定个体化的治疗方案，一方面减少了治疗用药及其相应的毒副作用，另一方面也能节约医疗成本。为了避免心脑血管疾病患者因治疗用药不当造成的伤害，需对其药物敏感性进行检测，进而实现精准用药。对此，我们选取了心脑血管疾病常用的抗高血压，心律失常，冠心病心绞痛，血栓栓塞性疾病，心、脑及其他动脉循环障碍疾病，心肌梗死、中风、静脉栓塞，急性和慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动，高血脂，心脏病药物进行检测。这些药物包括普利类(依那普利、赖诺普利、贝那普利、培哚普利、福辛普利)、硝酸甘油、华法林、氯吡格雷、阿司匹林、沙坦类、氨氯地平、β受体阻滞剂(美托洛尔、阿替洛尔、卡维地洛)、利尿剂(氢氯噻嗪、布美他尼、呋塞米、托拉塞米、吲达帕胺)、单硝酸异山梨酯、地高辛、他汀类(辛伐他汀、阿伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀)、叶酸等。普利类药物对于高血压患者具有良好的靶向保护作用和心血管终点事件预防作用，尤其适用于高血压伴有慢性心力衰竭、心肌梗死后伴有心功能不全、糖尿病肾病、非糖尿病肾病、代谢综合征、蛋白尿者。该药可在抗高血压的同时，保护肾功能，但确实是把双刃剑，既可改善肾功能，也可能引起急性肾衰竭和高血钾症。硝酸甘油可直接松弛血管平滑肌，特别是小血管平滑肌，使全身血管扩张，外周阻力减少，静脉回流减少，减轻心脏前后负荷，降低心肌耗氧量、解除心肌缺氧。用于心绞痛急性发作，也用于急性左心衰竭。华法林为双香豆素类抗凝药，能阻碍已形成血栓的扩展，但无溶栓作用。氯吡格雷用于预防和治疗因血小板高聚集引起的心、脑及其他动脉循环障碍疾病，是血小板聚集抑制剂，选择性地抑制adp与血小板受体的结合及抑制adp介导的糖蛋白gpiih/iiia复合物的活化，而抑制血小板聚集。也可抑制非adp引起的血小板聚集。对血小板adp受体的作用是不可逆的。口服吸收迅速，血浆中蛋白结合率为98％，在肝脏代谢，主要代谢产物无抗血小板聚集作用。阿司匹林对血小板聚集有抑制作用，可降低急性心肌梗死疑似患者的发病风险，预防心肌梗死复发，是中风的二级预防，降低短暂性脑缺血发作及其继发脑卒中的风险，还可预防大手术后深静脉血栓和肺栓塞，降低心血管危险因素者(冠心病家族史、糖尿病、血脂异常、高血压、肥胖、抽烟史、年龄大于50岁者)心肌梗死发作的风险。沙坦类药物阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统，具有显著的肾脏保护作用，在糖尿病肾病、高血压肾损害以及原发性肾病患者中，沙坦类药物的作用尤为突出，可有效降低全身以及肾小球局部血压，减少肾小球对蛋白的通透性，降低蛋白尿，阻止肾小球硬化的发生，延缓肾病的发展。氨氯地平适用于轻、中度高血压病的治疗，也可用于慢性稳定型心绞痛的治疗，可显著减少心绞痛发作频率及延长患者运动时间。美托洛尔、阿替洛尔记忆卡维地洛是目前临床上应用较广泛的口服β受体阻滞剂，β受体阻滞剂作为一类重要的心血管活性药物，在高血压、冠心病及心力衰竭等疾病的药物治疗中占据着不可替代的地位。氢氯噻嗪、布美他尼、呋塞米、托拉塞米、吲达帕胺为利尿剂，通过利尿排钠，降低容量负荷，改善增高的血压。单硝酸异山梨酯用于冠状粥样硬化性心脏病心绞痛的预防和治疗，心肌梗死伴有持久性心绞痛的后期治疗，肺动脉高压，严重的心肌损。地高辛用于高血压、瓣膜性心脏病、先天性心脏病等急性和慢性心功能不全。尤其适用于伴有快速心室率的心房颤动的心功能不全，还可用于控制伴有快速心室率的心房颤动、心房扑动患者的心室率及室上性心动过速。他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶a还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面低密度脂蛋白受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白b-100，从而减少富含甘油三酯av、脂蛋白的合成和分泌。高半胱氨酸是心脏病、脑中风的危险因素之一，叶酸有助于分解高半胱氨酸，降低心脏病的发生几率。基于此，我们需要研发一种方便快捷、通量高的心脑血管疾病精准用药基因检测固相pcr试剂盒。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种方便快捷、通量高的13种心脑血管疾病精准用药基因检测试剂盒，利用其可检出acers1799752，vkorc1rs9923231，cyp2c9*3rs1057910，nat2rs1801279，nat2rs1801280，mtrrrs1801394，mthfrrs1801131，mthfrrs1801133，adrb1rs1801253，add1rs4961，nppa-as1rs5065，cyp2c19*2rs4244285,cyp2c19*1/17rs12248560,pon1rs662,cyp2c19*3rs4986893,aldh2rs671,cyp2d6rs1065852,cetprs708272,gp1bars6065,ltc4srs730012基因。本发明是通过以下技术方案实现的：一种心脑血管疾病精准用药基因检测固相pcr试剂盒，其特征在于，包括pcr反应液混合液及12联排管或96孔pcr反应板构成，所述pcr反应液混合液包括引物组、热启动dna聚合酶和pcr反应缓冲液。优选的，所述的引物对由20对引物组成，具体如下表1：检测靶标引物序列(f/r)acers1799752accactcccatcctttctcc/aggctgaggcaggagaatgvkorc1rs9923231cagggttcaagtggttctcg/aagggtaggtgcaacagtaaggcyp2c9*3rs1057910acgtgtgattggcagaaacc/cccggtgatggtagaggtttnat2rs1801279cgggctgttccctttgaga/cacctgaggctgatccttccnat2rs1801280cgggctgttccctttgaga/cacctgaggctgatccttccmtrrrs1801394gccttgaagtgatgaggagg/ccactgtaacggctctaaccmthfrrs1801131ggcagaatttacaggaatggc/ggaggtctcccaacttaccctmthfrrs1801133cctctcctgactgtcatccc/gccttcacaaagcggaagaaadrb1rs1801253ttcaactggctgggctacg/ggccctacaccttggattccadd1rs4961cgggagaagacaagatggc/ctgggtcagaaaggctgganppa-as1rs5065ggcgaggaagtcaccatca/ccaggtcaccaagccagatcyp2c19*2rs4244285aattacaaccagagcttggcata/actccttgacctgttaaacatcccyp2c19*1/17rs12248560tggggctgttttccttagataa/gctggcagaactgggatttpon1rs662gaaggctccatcccacatc/aacatacgaccacgctaaacccyp2c19*3rs4986893cctgcaatgtgatctgctcc/tgtacttcagggcttggtcaaldh2rs671tacaagatgtcggggagtgg/tctcaggcttaaaatgggaaacyp2d6rs1065852ccatttggtagtgaggcaggta/ggtccagcctgtggtttcaccatttcetprs708272ggcttttgaacttggcgatac/ggagatgggctgagtggaggp1bars6065ccctggatctatcccacaat/cccgtggagaaaagcaaaaltc4srs730012cgctgggactccattctga/caccacttcctgcttgttcg作为优选，所述的引物的终浓度为200nm-1um，优选500nm。优选的，所述的固相pcr试剂盒是将所述的引物组、热启动dna聚合酶和pcr反应缓冲液固定在96孔pcr反应板或12联排pcr反应孔中的，加样时添加核酸模板进行上级扩增。一种如权利要求1-4任意所述的基于固相pcr试剂盒检测13种心脑血管疾病精准用药检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)13种心脑血管疾病精准用药基因检测固相pcr扩增试剂盒的生产；(2)口腔拭子dna提取试剂盒按照说明书提取核酸；(3)固相pcr扩增反应；(4)pcr产物电泳分析后测序。优选的，上述步骤(1)所述的固相pcr试剂盒是在含有pcr反应混合液的表面封闭一层石蜡混合物，石蜡混合物的熔点在30—38℃之间，所述石蜡混合物用于隔离pcr反应液中的酶和其他成分，所述石蜡混合物由液体石蜡和熔化后的固体石蜡混合而成，所述固体石蜡和液体石蜡的比值为1:4-1:12，优选1:7-1:9。作为优选，上述步骤(2)所述的核酸浓度不低于10ng/ul，纯度为1.8-2.0之间。优选的，所述的pcr反应液混合液为5×pcrbuffer(tris-hclph8.5100mm、kcl500nm、mgcl215nm、dntps10mm)、mg2+、20对引物及热启动dna聚合酶构成。本发明提供了一种心脑血管疾病精准用药基因检测固相pcr试剂盒，包括pcr反应液混合液及12联排管或96孔pcr反应板构成，所述pcr反应液混合液包括引物组、热启动dna聚合酶和pcr反应缓冲液。与现有技术相比，1)操作简便：仅需在固相pcr板中加入核酸模板即可直接上机扩增，且操作简单，临床检测特异性好，灵敏度与定量pcr相当，具有较强的临床应用推广价值；2)灵敏度高、特异性强：本发明公开的固相pcr试剂盒采用热启动dna聚合酶，避免非特异性扩增，提高检测灵敏度和特异性；3)检测位点全，适宜于心脑血管疾病安全用药指导；此外，本发明公开的试剂盒可一次性检测与心脑血管疾病相关的20种靶点，涵盖普利类(依那普利、赖诺普利、贝那普利、培哚普利、福辛普利)、硝酸甘油、华法林、氯吡格雷、阿司匹林、沙坦类、氨氯地平、β受体阻滞剂(美托洛尔、阿替洛尔、卡维地洛)、利尿剂(氢氯噻嗪、布美他尼、呋塞米、托拉塞米、吲达帕胺)、单硝酸异山梨酯、地高辛、他汀类(辛伐他汀、阿伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀)、叶酸等13种相关药物。综上所述，本发明提供一种心脑血管疾病精准用药基因检测固相pcr试剂盒，本发明采用特异性的引物序列，保证检测结果的可靠性；该检测方法操作简单，省时省力；检测通量大，试剂耗材成本低；可直接对提取的核酸检测；对检测平台和检测人员的要求低，能够在临床一线广泛推广。附图说明图1为试剂盒12联排图；图2为试剂盒检测患者1电泳图；图3为试剂盒检测患者1测序结果。具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例113种心脑血管疾病精准用药固相pcr检测试剂盒的组成该试剂盒由pcr反应液混合液及12联排管或96孔pcr反应板构成，其中pcr反应混合液为5×pcrbuffer(tris-hclph8.5100mm、kcl500nm、mgcl215nm、dntps10mm)、mg2+、20对引物及热启动dna聚合酶构成。该试剂盒是在上述pcr反应混合液的表面封闭一层石蜡混合物，石蜡混合物由固体石蜡和液体石蜡按照1:8(w/v)混合而成。该试剂盒的反应体系(25ul)为：pcr反应液23ul，模板2ul。实施例2试剂盒的操作和结果判定1、基因组dna的提取采用口腔拭子提取人口腔内表面脱落细胞，用口腔拭子基因组dna提取试剂盒(天根生化科技，货号：dp322)按照试剂盒说明书提取dna。2、反应体系的配制取心脑血管疾病精准用药基因检测固相pcr反应试剂盒12联排管或者96孔pcr反应板，加入2ul提取的dna。3、pcr扩增将pcr管放入普通pcr仪中按照说明书建议才做程序进行pcr扩增。4、1.0％琼脂糖凝胶电泳分析pcr产物5、结果判读本试剂盒结果判读标准如下表1检测靶标扩增片段大小(bp)acers1799752174vkorc1rs9923231278cyp2c9*3rs1057910253nat2rs1801279342nat2rs1801280342mtrrrs1801394159mthfrrs1801131226mthfrrs1801133168adrb1rs1801253355add1rs4961279nppa-as1rs5065248cyp2c19*2rs4244285356cyp2c19*1/17rs12248560250pon1rs662234cyp2c19*3rs4986893214aldh2rs671345cyp2d6rs1065852292cetprs708272416gp1bars6065371ltc4srs730012295实施例3测序结果解读及用药指导以实施例1心脑血管疾病患者口腔拭子提取的dna为模板，用上述试剂盒扩增后，得到如下测序结果，根据测序结果给出相应用药指导如下：以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12