本发明涉及基因工程疫苗领域，具体地说，涉及一种霍乱弧菌菌影及其在家禽疫苗中的应用。
背景技术：
霍乱弧菌菌影(vibriocholeraghosts，cg)是通过基因遗传操作将phix174的裂解基因e导入野生型e1tor菌株中，通过诱导表达e基因使细菌细胞壁穿孔，细菌胞浆内容物外流，最终获得具有免疫原性的菌体外壳。
传统兽用疫苗为灭活疫苗，常采用加热、放射或是化学试剂处理灭活抗原，这些方法容易造成菌体抗原表位的变性，从而影响免疫效果，变性剂的残留还可能影响环境及动物本身的安全。
相比之下，菌影不仅能够保持细菌抗原表位的天然结构，而且可以将外源蛋白锚定于菌影包膜上，制备成多价疫苗。此外，菌影制备、纯化工艺简单，适合大量生产，而且产品可以常温长期保存，不必担心效价的降低。菌影具有安全、高效、成本低廉的特点，将其应用于兽用疫苗将有效的预防各类动物传染性疾病。
研究发现霍乱弧菌具有良好的黏膜免疫刺激效果，霍乱弧菌感染后小肠内可迅速出现分泌型lga，局部的siga在肠粘膜与病菌之间形成免疫屏障，可阻断病原粘附和中和毒素。此外，霍乱弧菌自身具有佐剂特性，经无害化处理得到的霍乱弧菌菌影(choleraghost，cg)不仅保持原有抗原结构和功能的完整，还能够装载外源的抗原蛋白，有效的刺激抗原递呈细胞，其佐剂效力甚至优于铝佐剂和完全弗氏佐剂等常用佐剂，黏膜免疫比其它途径免疫有以下优点:使用方便，副作用少，便于多次加强免疫。
然而，目前尚无关于将cg应用于家禽、家畜等的兽用疫苗的研究报道，因此cg在该方面的应用研究还有待进一步开发。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种霍乱弧菌菌影及其在作为畜禽疫苗佐剂中的应用。为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种用于黏膜免疫和体液免疫的霍乱弧菌菌影(cg)。所述cg为霍乱弧菌经过e裂解蛋白的诱导裂解以及随后的冻干处理后获得的完整细菌空壳冻干粉。
本发明所提供的霍乱弧菌菌影重组蛋白的冻干粉，命名为bg/312，其外观为白色棒状颗粒，用无菌磷酸盐缓冲液重溶后为悬浊液体，无任何活菌残留。
进一步地，所述霍乱弧菌菌影的制备方法包括如下步骤：
(1)构建含有裂解蛋白e基因的重组质粒；
(2)制备霍乱弧菌感受态细胞；
(3)将步骤(1)所得重组质粒转化进入步骤(2)所述的感受态细胞中；
(4)诱导菌体裂解及鉴定；
(5)菌影的收集和保存。
进一步地，步骤(1)中所述重组质粒的制备方法为：
利用高保真pcr方法获得带有特异性酶切位点的裂解蛋白e基因片段(nc001422.1)，纯化回收后，sali、ecori限制性内切酶酶切获得目的片段，将酶切后的裂解基因e片段连接进入pbad-24质粒，即获得所述重组质粒pbad-se(见图1)。
所述步骤(2)选用霍乱弧菌e1tor株制备霍乱弧菌感受态细胞，属于野生菌株，具有一定的腹泻致病性，atcc编号14033，血清型为o1，购自美国atcc中心。
所述步骤(2)具体为：取出保存的菌种，划线接种于lb平板，于36-38℃温箱中培养过夜；待平板上长出直径1-2mm菌落的时候，从平板上挑取单个菌落，接种至含有lb培养液的试管中，36-38℃振荡培养过夜；次日取菌液接种至含有lb培养基的培养瓶中，36-38℃剧烈震荡培养2-3小时，直到od600＝0.4-0.5，停止培养；将培养瓶取出置于冰上，待菌液温度降至4℃左右时，无菌条件下把菌液倒入离心管中，4℃条件下离心；弃上清，吸干残留的培养液，加预冷的2mm的cacl2到离心管中，轻轻吹打混匀，悬浮菌体，冰浴；之后，4℃条件下离心，弃上清，重复清洗2次，加预冷的0.1m的cacl2含有10％甘油的2mm的cacl2重悬浮菌体；离心后，4℃预冷的10％甘油重悬菌体，并将其分装到预冷的灭菌离心管中，于-80℃低温保存。
所述步骤(3)具体为：将感受态细胞置于冰浴中，使其融化；将重组质粒加入到刚融化的感受态细胞中，轻摇混匀，冰浴5min后；1800v，200ω条件下电击，结束后，加入适量的无抗性lb培养基，迅速放入42℃水浴中热激90s，再冰浴5min；加入预热至37℃的lb液体培养基，于36-38℃的摇床中振荡1-2h；取菌液直接涂布一个lb/amp平板；剩余菌液常温下离心收集细胞，再加入新鲜的lb液体培养基，轻轻吹打混匀后，涂布第二个lb/amp平板；将两个梯度涂布菌液的lb/amp平板，倒置放入37℃培养箱中培养12-16h。
所述步骤(4)具体为：挑取鉴定阳性的单个菌落，接种于新鲜的lb/amp培养液中，36-38℃摇床过夜培养；之后将菌液接种于新鲜的lb/amp培养液中，同样条件下增菌培养；在两个三角瓶中分别加入lb/amp培养液，用新鲜培养液调整初始菌液浓度至od600＝0.4-0.5；36-38℃摇床培养至od600＝0.4左右时，加入终浓度为0.1％-0.2％的arabinose，诱导重组质粒的e基因表达裂解蛋白，裂解菌体，直到od600小于0.3，将菌液分装到离心管中，置于冰上使菌液完全冷却，8000rpm、4℃离心30min收获菌体，之后依次用预冷的去离子水、预冷的pbs-sp和预冷的pbs-s重悬菌体，每次重悬后均进行冰浴和高速离心；最后用预冷的pbs-s重悬菌体，即得。
本发明使用的重组质粒能够高效裂解霍乱弧菌，将细菌内容物全部释放而仅存细菌外壳，再经冷冻干燥后可获得无任何活菌残留的菌影。经动物实验后，猪、鸡等均无任何不良反应，达到了安全无毒的使用标准，具有较大的应用前景。
本发明所述的霍乱弧菌菌影(cg)是通过调控噬菌体phix174的裂解基因e在霍乱弧菌中表达而形成的无细胞浆和繁殖能力的完整细菌空壳。霍乱弧菌菌影制备过程温和且无需变性作用，完好地保留了菌体表面结构和各种抗原成分，具有良好的免疫原性和内在佐剂性。霍乱弧菌菌影的最大优势在于对黏膜免疫有良好的刺激性，而且易于被免疫系统所识别、能够诱导机体产生良好的体液、细胞免疫应答。此外，霍乱弧菌菌影易于大量生产，易于纯化，只需常规的离心机离心收集，经冷冻干燥处理后的菌影可以常温下长期保存。
不仅如此，本发明所述的霍乱弧菌菌影完好地保留了菌体外膜结构、相关抗原蛋白和免疫刺激成分，因而具有内在的免疫佐剂性和免疫系统靶向性，能有效诱导机体产生体液免疫应答、细胞免疫应答以及免疫保护反应。经免疫试验证实，经cg佐剂免疫后血清抗体水平及其杀菌活性以及攻毒后的相对免疫保护率均显著高于传统的灭活苗、弱毒疫苗，实现较高水平的呼吸道免疫，有效防止畜禽衣原体、家禽新城疫的流行和爆发。
第二方面，本发明还提供了所述霍乱弧菌菌影作为免疫佐剂在制备疫苗中的应用。经本发明研究发现，本发明所述的霍乱弧菌菌影与兽用活疫苗以及灭活疫苗混合后使用，可以增强当前使用疫苗的体液免疫和细胞免疫，清除细胞内胞内菌感染以及病毒感染，提高疫苗的免疫效果。
因此，所述应用具体为将霍乱弧菌菌影作为免疫佐剂与禽畜疫苗搭配使用，所述禽畜疫苗可为活疫苗或灭活疫苗。
作为优选，所述禽畜疫苗为禽流感疫苗(例如禽流感h9n2疫苗、新城疫灭活疫苗或新城疫弱毒疫苗，用于防治家禽新城疫和禽流感h9n2等)。
更为优选，本发明优化了霍乱弧菌菌影与疫苗的配比，每1000羽份中添加20-40mg本发明所述的霍乱弧菌菌影将可表现出最佳的免疫效果。
每1000羽份的新城疫灭活疫苗中，加入20mg-40mgcg佐剂，可以显著增强疫苗的体液免疫效果，提高抗体滴度持续的时间，免疫后12天就可以获得免疫保护。
本发明霍乱弧菌菌影佐剂可通过发酵罐规模化生产，发酵产物用离心方法进行收集，并以冻干的形式保存于室温，无需像蛋白疫苗那样复杂的纯化工作。另外，本发明疫苗为冻干粉剂，性质稳定，便于保存和运输，有效降低了制备成本。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种霍乱弧菌菌影(choleraghost，cg)及其制备方法，以及其在畜禽疫苗中的应用。将霍乱弧菌经过e裂解蛋白的诱导裂解以及随后的冻干处理后获得的完整细菌空壳冻干粉(即为本发明所述的霍乱弧菌菌影)，并将其作为兽用疫苗佐剂，优化使用剂量为畜禽1000羽份疫苗添加20-40mg霍乱弧菌菌影，经点眼、滴鼻、喉头呼吸道、或肌肉注射的免疫途径进行免疫后，可有效介导细胞免疫，增强动物机体对胞内寄生菌和病毒的抵抗能力。
本发明通过优化畜禽疫苗与cg的使用配方，充分发挥cg优秀的黏膜免疫佐剂作用，并以此技术为基础，促进国内家禽、家畜等的兽用疫苗的开发。
附图说明
图1为pbad-se质粒构建图。
图2为裂解蛋白e基因片段的pcr鉴定结果。
图3为pbad-se质粒双酶切鉴定结果。
图4为霍乱弧菌诱导及生长曲线。
图5为电子扫描显微镜鉴定结果(打孔前和打孔后)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1霍乱弧菌菌影(cg)制备及保存
1、材料
霍乱弧菌e1tor株，atcc编号14033，血清型为o1，购自美国atcc中心。
电转杯：genepulsercovette，购自bio-rad公司。
ddh2o：nuclease-freewater，购自ambion公司。
taqdna聚合酶、10×反应用缓冲液、10×dntpmix，highmassdnaladder，lowmassdnaladder，10×dnaloadingbuffer，均购自invitrogen公司。
高保真pcr试剂盒：expandhighfidelitypcrsystem，dntppack，购自roche公司。
核酸胶染料：gelrednucleicacidstain(10000×)，购自美国biotium公司。
sali、ecori限制性内切酶：购自fisherscientific公司。
t4连接酶：购自fisherscientific公司。
质粒小提试剂盒：qiaprepspinminiprepkit(250)，购自德国qiagen公司。
pcr产物纯化试剂盒：qiaquickpcrpurificationkit(50)，购自德国qiagen公司。
胶回收试剂盒：qiaquickgelextractionkit(50)，购自德国qiagen公司。
lbbroth:购自fisherscientific公司。
lb培养基：购自oxoid公司。
琼脂：购自invitrogen公司。
arabinose：购自索莱宝公司。
硫酸链霉素，硫酸庆大霉素：购自索莱宝公司。
2、主要仪器
电转化仪：genepulser，购自美国bio-rad公司。
冷冻干燥机：savantmodmlyo，购自美国savant公司。
pcr仪：mastercyclergradient，购自eppendorf公司。
电泳仪：powerpac200，购自bio-rad公司。
电泳槽：minitrans-blotcell，购自bio-rad公司。
核酸胶成像系统：foto/analystinvestigator，购自fotodyne公司。
电子扫描电镜：su8010，日本hitachi。
3、方法：
3.1含有裂解蛋白e基因的重组质粒的构建
3.1.1裂解基因e的获取
利用高保真pcr方法获得带有特异性酶切位点的裂解蛋白e基因片段(见图2)，pcr体系见表1。回收纯化后，测序鉴定后，-20℃保存备用。
表1pcr反应体系
3.1.2pbad-se质粒的构建
将用sali、ecori限制性内切酶处理后的e基因，其用t4dna连接酶与经同样酶切的pbad-24质粒16℃过夜连接，即可获得pbad-se重组质粒，酶连体系见表2，双酶切鉴定(见图3)、测序鉴定后，-80℃保存备用。
表2酶连反应体系
3.2霍乱弧菌感受态细胞的制备
取出-70℃冰冻保存的菌种，划线接种于lb平板(无抗性)，做好标记，于37℃温箱中培养过夜；待平板上长出直径1-2mm菌落的时候，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3mllb培养液的试管中，37℃振荡培养(200rpm)过夜；次日取菌液1ml接种至含有100mllb培养基的250ml培养瓶中，37℃剧烈震荡(200rpm)培养大约2-3小时，直到od600＝0.4-0.5，停止培养；将培养瓶取出置于冰上，待菌液温度降至4℃左右时，无菌条件下把菌液倒入离心管中，4℃条件下离心；弃上清，吸干残留的培养液，加预冷的2mm的cacl2到离心管中，轻轻吹打混匀，悬浮菌体，冰浴；之后，4℃条件下离心，弃上清，重复清洗2次，加预冷的0.1m的cacl2含有10％甘油的2mm的cacl2重悬浮菌体；离心后，4℃预冷的10％甘油重悬菌体，并将其分装到预冷的灭菌离心管中，于-80℃低温保存。
3.3重组质粒pbad-se转化进入感受态细胞
从-80℃超低温冰箱中取出一管感受态细胞，置于冰浴中，放置5min，使其融化；将1μl质粒pbad-se加入到刚融化的感受态细胞中，轻摇混匀，冰浴5min后；1800v，200ω条件下电击，结束后，加入适量的无抗性lb培养基，迅速放入42℃水浴中热激90s，再冰浴5min；加入预热至37℃的lb液体培养基，于36-38℃的摇床中振荡1-2h；取菌液直接涂布一个lb/amp平板；剩余菌液常温下离心收集细胞，再加入新鲜的lb液体培养基，轻轻吹打混匀后，涂布第二个lb/amp平板；将两个梯度涂布菌液的lb/amp平板，倒置放入37℃培养箱中培养12-16h。
3.4质粒的诱导表达和菌影的制备
挑取鉴定阳性的单个菌落(含有目的质粒pbad-se)，接种于3ml新鲜的lb/amp培养液中，36-38℃、200rpm恒温摇床过夜培养；之后将菌液接种于100ml新鲜新鲜的lb/amp培养液中，同样条件下增菌培养；在两个三角瓶中分别加入lb/amp培养液，用新鲜培养液调整初始菌液浓度至od600＝0.4-0.5；36-38℃摇床培养至od600＝0.4左右时，加入终浓度为0.1％-0.2％的arabinose，诱导pbad-se的e基因表达裂解蛋白，开始裂解菌体，此后每15min测量一下od600值，直到od600小于0.3，表明细菌裂解充分，整个制备过程的od600，生长曲线如图4。到od600小于0.2之后，将菌液分装到400ml高速离心管中，置于冰上1h，使菌液完全冷却之后，8000rpm、4℃离心30min收获菌体，之后分别用预冷的去离子水，重悬菌体，冰浴30min，8000rpm、4℃离心；预冷的pbs-sp重悬菌体，冰浴30min，8000rpm、4℃离心；预冷的pbs-s重悬菌体，8000rpm、4℃离心；最后用1ml预冷的pbs-s重悬菌体，此次重悬要均匀彻底。
3.5霍乱弧菌菌影的冻干及保存
用电子扫描显微镜鉴定霍乱弧菌菌影的形态及特异性孔道的生成(见图5)，诱导裂解后在菌体的中间或两极有特异性孔道形成，并且与野生型的霍乱弧菌相比，诱导后的菌体出现了皱缩，表明菌体内容物在渗透压作用下流出菌体，仅剩下菌体空壳，显示菌影生成。将最后得到的1ml细菌悬液，首先放于-80℃冷冻过夜，使之冷冻彻底，之后用冷冻干燥机进行冻干，最终得到疫苗的冻干粉，称取重量。本次实验的两个样品最高的od600值分别为0.945和0.828，最终获得的冻干粉重量分别为266.6mg和252.3mg，放在干燥的试管中，室温保存。
3.6霍乱弧菌菌影的纯粹性检验
取配置好的100mg/ml的疫苗溶液，进行10倍梯度稀释后，分别涂布于lb/amp+平板上，每个板100μl，37℃培养12-14h后，无任何细菌生长，说明该疫苗裂解彻底，没有活菌的存在，安全性良好。检测菌影生成率达99.77％，安全性良好。实验结果显示含有裂解基因e的质粒pbad-se的重组霍乱弧菌构建成功，并依据以上工艺可以实现生产。
实施例2霍乱弧菌菌影佐剂在新城疫弱毒疫苗中的应用
cg免疫佐剂是否具有增强鸡新城疫弱毒活疫苗免疫后抗体水平，以及提高传统弱毒疫苗的保护力。
1、材料
霍乱弧菌菌影：具体制备方法和质量检测见实例1所述。
新城疫弱毒疫苗(lasota株)：购自山东绿都生物技术有限公司
spf鸡：80只21日龄，雄性，购自北京梅里亚维通实验动物有限公司。
新城疫抗体检测试剂盒(含阳性血清、阴性血清)：购自北京中海生物科技有限公司。
2、方法
80只21日龄spf鸡，随机平均分成四组，每组20只鸡。于22日龄时，将新城疫活疫苗(购自山东省绿都生物科技有限公司)，每1000羽份疫苗分别添加cg：20mg/鸡、40mg/鸡和80mg/鸡)混合后，经点眼滴鼻途径进行黏膜免疫，同时设置不添加任何佐剂的对照组。分别在免疫后7、14、21、28和35天于翅下静脉采集血液，分离得到血清后，用elisa试剂盒测定血清样品中新城疫特异性抗体滴度。
3、结果
如表3所示，添加cg佐剂的新城疫抗体水平在免疫后第14天、21天和第28天均显著高于对照组。各剂量组之间，发现菌影cg20mg组显著性高于40mg和80mg菌影组，且极其显著性高于对照组。免疫后35天，20mg和80mg菌影组显著性高于40mg菌影组。按照新城疫抗体与攻毒保护之间的关系，如果hi>1:32，诱导的抗体可以抵抗新城疫的攻毒。每1000羽份的新城疫弱毒疫苗添加20mg的菌影cg，免疫后14天诱导的抗体水平可以抵抗新城疫病毒的攻毒保护，其保护抗体产生时间优于弱毒疫苗，且抗体持续时间优于弱毒疫苗组。
表3添加cg佐剂对新城疫弱毒疫苗抗体影响(log2)
注：同一列中a-b，b-c显示差异显著p<0.05；a-c显示差异极其显著p<0.01。
4、结论
1000羽份新城疫弱毒活疫苗中，加入20mg的cg佐剂，即每羽份添加20μg，可以显著增强新城疫弱毒疫苗的体液免疫效果，提高抗体滴度，免疫后12天就可以获得免疫保护。
实施例3cg佐剂在新城疫油灭活疫苗中的应用
评价cg佐剂在鸡新城疫灭活疫苗中对抗体滴度的影响，从而确定是否提高传统灭活新城疫疫苗的保护效果。
1、材料
霍乱弧菌菌影：具体制备方法和质量检测见实例1所述。
新城疫灭活油佐剂疫苗(lasota株)：购自山东绿都生物技术有限公司，批次20140506.
spf鸡：60只7日龄，雄性，购自北京梅里亚维通实验动物有限公司。
新城疫抗体检测试剂盒(含阳性血清、阴性血清)：购自北京中海生物科技有限公司。
2、方法
动物分组及免疫
60只7日龄spf鸡，随机平均分成四组，每组20只鸡。于1日龄时，将1000羽份新城疫灭活疫苗与不同剂量的cg(20mg和40mg)混合后，经胸肌注射免疫，同时设置白油佐剂疫苗对照组。分别在免疫后7、14、21、28、35和42天于鸡翅下静脉采集血液，分离得到血清后，用hi试剂盒测定样品中新城疫抗体滴度。抗体滴度采用单因素方差分析组间差异，p＜0.05表示差异显著。
3、试验结果
结果如表4所示。在1000羽份疫苗中添加20mg、40mg菌影cg佐剂后，新城疫上升速度在7天均较为缓慢，但是从14天-35天，抗体迅速上升并保持较高水平且显著高于对照组。在1000羽份疫苗中添加40mg菌影cg佐剂，免疫后35、42天新城疫抗体显著性高于20mg菌影cg佐剂组，且抗体持续性升高。
表4添加cg对新城疫灭活疫苗中新城疫抗体水平的影响log2
注：同一列中a-b，b-c显示差异显著p<0.05；a-c显示差异极其显著p<0.01。
4、结论
每1000羽份的新城疫灭活疫苗中，加入40mgcg佐剂，可以显著增强疫苗的体液免疫效果，提高抗体滴度持续的时间。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。