本发明涉及一种卢立康唑中间体的酶法制备方法，尤其涉及一种利用重组酮还原酶不对称催化生产卢立康唑中间体(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的方法，属于生物制药和生物化工技术领域。
背景技术：
卢立康唑是日本农药株式会社开发的咪唑类抗真菌药物，其通过抑制羊毛甾醇脱甲基酶从而抑制麦角固醇的合成，减少构成真菌麦角固醇和相对的羊毛甾醇积累，该药适用于真菌治疗，包括体癣、念珠菌病和花斑癣等。与以往抗真菌外用药相比，卢立康唑最大的优势是皮肤贮留率高，用药周期短(为一般药物的一半)，疗效好且不易复发，故具有很大的竞争力。卢立康唑的化学结构式如下：
(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇是卢立康唑化学合成过程中一个重要的中间体。但目前主要以化学合成为主，但该方法需要使用价格昂贵的手性配体(s,s)-tsdpen和金属试剂[ru(p-cymene)cl2]2，产品收率低，手性ee值不高，化学生产成本大且对环境不优化，不适于规模化生产(cn103044192a)。
(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的大规模生物制备方法目前尚未见报道。但(r)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的生物制备，目前已见报道，手性ee值大于99，转化效率大于99(j.org.chem.2011,76,2115–2122)。在该文献中亦可见(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的生物转化，但手性ee值不高(ee值90)，因此不能满足工业化生产的需要。
(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇生物催化的反应路线为：
技术实现要素：
针对现有化学法合成卢立康唑中间体(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的不足之处，本发明的目的是提供一种利用重组酮还原酶不对称催化生产卢立康唑中间体的方法，使得该中间体的生产经济、环保，从而满足卢立康唑的工业化生产。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：一种卢立康唑中间体的酶法制备方法，所述方法以2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮为底物，在酮还原酶、辅因子及氢供体的存在下，发生不对称还原反应生成(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，包括如下步骤：
(1)酮还原酶的制备：将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含有卡那霉素抗性的液体lb培养基中，37℃过夜培养；将活化后得到的培养物接种到含有卡那霉素的液体lb培养基中，37℃振荡培养至od600为0.6-0.8，加入终浓度为0.1m的iptg，于25℃下诱导培养8-10h；离心，收集菌体，超声破壁后即获得重组酮还原酶。
(2)(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的制备：将底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮加入到缓冲液中并加入一定量的辅因子nad(p)及异丙醇，加入重组酮还原酶于30℃进行生物催化反应，待反应结束后，加入乙酸乙酯进行萃取，即获得产物(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇。
作为优选：所述步骤(1)的酮还原酶的dna序列如seqno.1所示，其编码的氨基酸序列如seqno.2所示；
所述步骤(2)中的底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮的浓度为25-50g/l。
作为优选：所述步骤(2)中的重组酮还原酶的使用量为10-50g/l；辅因子为nad+或nadp+，其浓度为0.05-0.1g/l；氢供体为异丙醇，其浓度为5％-10％。
作为优选：所述步骤(2)中的缓冲液为磷酸缓冲液，ph为6.5-7.5；所述生物催化反应的温度为25-35℃；所述生物催化反应的时间为8-12h；
所述的产物(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的结构式如下：
本发明采用特定的酮还原酶催化还原反应，具有酶用量小、反应条件温和、操作简单、反应时间短、收率高、光学纯度好和绿色环保等优势。与现有技术的化学法相比，经济性高、污染小，具有重要的工业应用价值。
附图说明
图1是本发明的生物合成路线；
图2是本发明构建的重组酮还原酶的表达质粒pet26-kred；
图3是大肠杆菌bl21(de3)/pet26-kred诱导表达后重组酮还原酶的sds-page电泳图；其中m是蛋白分子量标准品，1号是破碎后上清液，2号是纯化后的重组酶。
图4是产物(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的手性hplc液相图；
图5是产物(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的1hnmr图谱。
具体实施方式
以下通过附图及实施例对本发明作进一步的描述：本发明所述的一种卢立康唑中间体的酶法制备方法，所述方法以2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮为底物，在酮还原酶、辅因子及氢供体的存在下，发生不对称还原反应生成(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，包括如下步骤：
(1)酮还原酶的制备：将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含有卡那霉素抗性的液体lb培养基中，37℃过夜培养；将活化后得到的培养物接种到含有卡那霉素的液体lb培养基中，37℃振荡培养至od600为0.6-0.8，加入终浓度为0.1m的iptg，于25℃下诱导培养8-10h；离心，收集菌体，超声破壁后即获得重组酮还原酶。
(2)(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的制备：将底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮加入到缓冲液中并加入一定量的辅因子nad(p)及异丙醇，加入重组酮还原酶于30℃进行生物催化反应，待反应结束后，加入乙酸乙酯进行萃取，即获得产物(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇。
本发明所述步骤(1)的酮还原酶的dna序列如seqno.1所示，其编码的氨基酸序列如seqno.2所示；所述步骤(2)中的底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮的浓度为25-50g/l。
本发明所述步骤(2)中的重组酮还原酶的使用量为10-50g/l；辅因子为nad+或nadp+，其浓度为0.05-0.1g/l；氢供体为异丙醇，其浓度为5％-10％。
本发明所述步骤(2)中的缓冲液为磷酸缓冲液，ph为6.5-7.5；所述生物催化反应的温度为25-35℃；所述生物催化反应的时间为8-12h；
所述的产物(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的结构式如下：
实施例1：
(1)羰基还原酶原始基因的合成：根据羰基还原酶lkadh的原始基因序列，按照大肠杆菌密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化并进行目的基因的全合成，合成后的全基因两端分别带用ndei和xhoi酶切位点并连接到pet26b(+)上，获得重组表达载体pet26b-lkadh。优化的lkadh原始基因序列如seqno.1所示，其编码的氨基酸序列如seqno.2所示。
(2)羰基还原酶突变体的构建：
(3)羰基还原酶的表达：将重组表达载体pet26b-lkadh和pet26b-lkadhm通过热激转化法转到表达菌株bl21(de3)中。挑取单菌落，将单菌落接入到5ml含卡那霉素的lb培养液中，37℃，振荡培养过夜，次日取1ml菌液加入到含卡那霉素的100mltb培养基中，37℃下振荡培养至od600至3.0，然后添加iptg至终浓度为0.1mm，25℃下诱导培养过夜。
(4)细胞破碎：5000g离心10min后收集菌体，用0.1m磷酸缓冲液(ph7.0)缓冲液重悬菌体，超声破碎后所得液体即为粗酶液。
(5)酶催化：将0.5g底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮加入到85ml反应器中，随后，将15ml含有10mgnadp+，120mg重组羰基还原酶的0.1mtris-hcl缓冲液(ph7.0)加入该反应器中。30℃反应10-20h。
(6)产物提取：hplc检测底物完全消耗，加nacl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，得黄色油状液体。
(7)产物鉴定：利用核磁共振1hnmr对目标产物进行鉴定。
实施例2：
a)酮还原酶基因的合成：
根据大肠杆菌密码子偏爱性，全基因合成酮还原酶基因kred(seqidno.1)，并委托上海捷瑞生物科技有限公司进行基因的全合成，合成后的全基因两端分别带用ndei和xhoi酶切位点并连接到pet26b(+)上，获得重组表达载体pet26-kred。
b)、将重组表达载体转化到大肠杆菌中：制备大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，通过氯化钙法转化将重组表达载体pet26-kred转化至bl21(de3)感受态细胞，涂布于含有50μg/ml的卡那霉素抗性的lb平板，37℃培养过夜。挑取单菌落，小量扩增后提取质粒，然后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，含有质粒条带的为实验所需的重组大肠杆菌。保存甘油菌备用。
c)、重组酮还原酶的表达：挑取单菌落加入到5ml含卡那霉素的lb培养液中，37℃，200转/分，摇床培养过夜，次日取1ml菌液加入到含50μg/ml的卡那霉素的100mltb培养基中，37℃下振荡培养至od600为3.0，然后添加iptg至终浓度为0.1mm，25℃下诱导培养过夜。离心后收集菌体备用。
d)、细胞破碎：用0.1mpbs(ph7.0)缓冲液重悬菌体，进行超声破碎(超声功率200w，工作5s，停7s，工作次数为50次)，超声破碎后液体即为粗酶液。
e)、(s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的制备工艺：
将5.0g底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮加入到250ml反应器中，随后，将0.1g/lnadp+，30g/l含重组酮还原酶的湿菌体，5ml异丙醇加入到95ml的0.1m磷酸缓冲液(ph7.0)加入该反应器中。在30℃下磁力搅拌反应8-12h，并用0.1mna2co3调节反应ph值，使其维持在7.0左右。利用薄层层析法定性检测底物的消耗及产物的生成情况。hplc检测底物完全消耗，加nacl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，得4.6g黄色油状液体，手性ee值大于99。
核磁数据1hnmr(cdcl3):δ2.90(d,j＝3.6hz,1h,oh),δ3.54(dd,j＝8.4,11.6hz,1h,chh’cl),δ3.90(dd,j＝3.2,11.2hz,1h,chh’cl),δ5.28(m,1h,ch),δ7.34(dd,j＝2,8.4,1h,phh),δ7.40(d,j＝2hz,1h,phh),δ7.60(d,j＝8.4hz,1h,phh)。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。
凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110><120>一种卢立康唑中间体的酶法制备
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>2106
<212>dna
<213>
<400>1
atggctaaaaactttagcaatgtcgaatatcctgccccgccgccagctcataccaaaaacgaatcactgcaggtactggatctgttcaaactgaacggcaaagtcgcgtctatcaccggtagcagctcaggcattggttacgcgctggccgaagcttttgcgcaggttggcgcagacgttgcgatctggtataacagccaggatgccaccggtaaagcagaggccctggctaaaaaatatggcgtaaaagtcaaggcttataaagctaatgtcagctcgagtgatgcggtgaaacagactattgagcagcagatcaaggattttggccacctggacattgttgtggcgaacgcaggcatcccatggactaagggtgcatacatcgatcaggatgacgataaacattttgaccaggtgattgacgtcgacctgaaaggcgtaggctatgtagcaaaacatgcgggtcgccattatcgtgaacgtttcgaaaaagaaggcataaagggcgccttgatttttacggcttccgtgtcgggtcacatcgttaacattccgcaatttcaggcgacctacaatgcggccaaggcaggcgtgcgtcatttcgcaaagtccctggccgtggaatttgctcctttcgcacgtgttaactctgtatctcctggctatattaataccgagatctctgatttcgtcccgcaagaaacacaaaataaatggtggagcttagttccattgggtcgtggtggggaaactgcggaattagttggtgcctacctgttcctggcaagtgatgcgggctcctacgccacgggcacagatatcattgtggatggcggctacacgctgccgtaa
氨基酸序列为：
maknfsnveypapppahtkneslqvldlfklngkvasitgsssgigyalaeafaqvgadvaiwynsqdatgkaealakkygvkvkaykanvsssdavkqtieqqikdfghldivvanagipwtkgayidqdddkhfdqvidvdlkgvgyvakhagrhyrerfekegikgaliftasvsghivnipqfqatynaakagvrhfakslavefapfarvnsvspgyinteisdfvpqetqnkwwslvplgrggetaelvgaylflasdagsyatgtdiivdggytlp*