本实用新型属于单细胞捕捉与配对
技术领域：
，涉及一种基于介电电泳的微流控芯片。
背景技术：
：细胞融合，也被称为细胞杂交，是通过诱导和培养等方法，使两个或两个以上的同源或异源细胞在离体条件下形成杂合细胞的过程。目前已经成为现代生物工程技术研究中的一项重要手段。细胞融合技术在遗传学、免疫医学、发育生物学、药物或基因传输、杂交育种等研究领域具有广泛应用。精准的单细胞捕获和配对是开展细胞融合研究的前提，因此需要设计和构建行之有效的单细胞捕获与配对实验平台。介电电泳(Dielectrophoresis，DEP)是一种在非均匀电场中根据微粒的介电性质对微粒进行操纵的技术。通过改变施加电压的频率等条件，能够控制微粒受正介电电泳力作用向高电场或者受负介电电泳力作用向低电场运动，从而实现对微粒的操纵。因此，基于DEP的方法可以实现有效的高通量的细胞捕捉与配对的过程。日本兵库大学的Yasukawa课题组报道了一种基于介电电泳方法的垂直配对细胞的微流控装置，此装置主要利用顶部的ITO电极和底部的图案化的微电极产生的正介电电泳力将两种细胞依次捕获在微腔阵列内，实现垂直的高通量细胞配对的过程。日本东北大学的Matsue课题组报道了一种基于介电电泳方法的细胞配对的微流控芯片，此芯片中包含有微型的叉指电极和葫芦形的微腔阵列，细胞配对的过程是利用顶部的ITO电极与底部的叉指电极产生的正介电电泳力依次捕获两种细胞，进而形成细胞对的过程。目前的基于DEP方法的高通量细胞配对的微流控芯片采用的是ITO电极在顶部，微电极在底部的方式来产生DEP，这种结构的缺点是：(1)聚二甲基硅氧烷(PDMS)是微流控芯片中用于微流道制备的最常用的材料，易于与芯片进行封装，并且通过简单的打孔器即可在PDMS上制备芯片的进出口，而ITO电极在顶部时，封装过程和进出口的制备都更加麻烦；(2)DEP捕捉细胞的过程是在电极间施加交流信号产生非均匀电场进而导致细胞的定向运动，在配对的过程中，ITO在顶部作为两种细胞捕获的共用电极，在捕获第一种细胞时，由于感应电场的作用，用于捕捉另一种细胞的位置也会被第一种细胞占据，影响芯片的配对效率。因此，如何简化芯片封装过程，提高芯片的配对效率是当前迫切需要解决的问题。技术实现要素：针对上述问题，本实用新型的主要目的在于开发了一种基于介电电泳的微流控芯片，所述微流控芯片通过改变“上下”结构为“平面”结构不仅使芯片封装过程简化，而且可以有效提高芯片的配对效率。为达此目的，本实用新型采用以下技术方案：本实用新型提供了一种基于介电电泳的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括底部的平面形芯片16和顶部的微流道13，所述平面形芯片具有依次叠加的四层结构；所述平面芯片的第一层结构1包括在玻璃基底上的电极，所述电极为叉指电极2；所述平面芯片的第二层结构3包括微腔阵列8，用于细胞捕捉；所述平面芯片的第三层结构4包括导电层10，用于形成叉指电极两端的导电区域；所述平面芯片的第四层结构5包括微腔阵列12和位于微腔阵列中的微挡板11，所述微腔阵列12用于细胞配对，所述微挡板11用于细胞接触；所述第二层结构(3)和第四层结构(5)上还包括微流通道(9)，用于在细胞配对后将每个微腔阵列中的细胞冲到微挡板的位置。本实用新型中，所述叉指电极在施加电信号的情况下，产生非均匀电场，细胞在正向介电泳力的作用下，被捕捉到电极表面。根据本实用新型，为透明导电材料，优选为ITO(铟锡氧化物)、AZO(铝掺杂的氧化锌的透明导电玻璃)或石墨烯中的任意一种或至少两种的组合，优选为ITO。优选地，所述叉指电极2的数量为2-10，例如可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10，优选为2。本实用新型中，所述叉指电极为2套以上，由于后续是两种以上的荧光细胞进行捕捉和配对，所述叉指电极要与所述荧光细胞的种类对应，以能够实现不同的荧光细胞与不同的叉指电极配合，从而单独实现捕捉，在进行配对。优选地，所述叉指电极(2)的宽度为10-30μm，例如可以是10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm，优选为15-25μm，进一步优选为20μm。优选地，所述叉指电极(6)中两根电极之间的间距为3-10μm，例如可以是3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm，优选为6μm。优选地，所述叉指电极(6)和叉指电极(7)的间距为5-50μm，例如可以是5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、18μm、20μm、22μm、23μm、25μm、28μm、30μm、32μm、33μm、35μm、38μm、40μm、42μm、45μm、48μm或50μm，优选为10μm。本实用新型中，所述叉指电极的长度可以根据所做的平面形芯片的尺寸进行调整。本实用新型中，采用上述尺寸的叉指电极才能够产生足够强的电场进而形成足够的吸引单个细胞的介电电泳力，其深度和间距都是相关联的，只有在本申请的范围内才能实现单细胞的捕捉和配对。根据本实用新型，所述第二层结构3的材料为负胶，优选为SU-8负胶。优选地，所述微腔阵列8的直径可根据单个细胞的尺寸进行设计，微腔的厚度跟介电泳力大小相关，越深介电泳力越小，越浅介电泳力越大，本实用新型中所述微腔阵列8的直径为10-30μm，例如可以是10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm，优选为15-25μm，进一步优选为20μm。优选地，所述微腔阵列8的深度为1-20μm，例如可以是1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、17μm、17μm、18μm、19μm或20μm，优选为5-15μm，进一步优选为10μm。根据本实用新型，所述导电层10的材料为铜、、银、铬或ITO中的任意一种或至少两种的组合，优选为铜。优选地，所述导电层10的尺寸为的厚度为0.5-5μm，例如可以是0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm，优选为1μm。本实用新型中，由于导电层位于第三层结构，而第二层结构为负胶材料，所以在第二层结构设置了腔体用于将导电层与第一层结构联通，用于导电，所述腔体的大小，本领域技术人员只需满足导电层和第一层结构的联通导电即可，在此不作特殊限定。优选地，所述第二层结构3和第四层结构5上的微流通道9位置对应，尺寸相同。本发明中，所述第四层结构5上的微流通道9穿过了微挡板11，当液体冲完细胞后可以从微挡板的位置流出去。优选地，所述微流通道9的宽度为3-15μm，例如可以是3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm或15μm，优选为8μm。根据本实用新型，所述第四层结构5的材料为负胶，优选为SU-8负胶。优选地，所述微腔阵列12的直径为130-200μm，例如可以是130μm、132μm、135μm、138μm、140μm、145μm、150μm、155μm、170μm、175μm、170μm、175μm、180μm、185μm、190μm、195μm或200μm，优选为150-170μm，进一步优选为170μm。优选地，所述微腔阵列12的深度为10-30μm，例如可以是10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、17μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm，优选为15-25μm，进一步优选为20μm。优选地，所述微挡板11的形状为只要能够对配对后的细胞冲入微腔阵列中实现遮挡功能的微挡板都是可行的，本领域技术人员可以根据需要进行调整，本申请采用半圆形、正方形或长方形中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述微挡板11的尺寸根据微流道的尺寸进行调整，所述微挡板的尺寸为可以遮挡从微流道冲入微腔阵列的细胞，本领域技术人员可以根据需要进行调整，本申请微挡板11的的宽度为30-50μm，例如可以是30μm、31μm、32μm、33μm、35μm、36μm、38μm、40μm、41μm、43μm、45μm、48μm或50μm，优选为40μm，所述微挡板11的长度为50-70μm，例如可以是50μm、52μm、53μm、55μm、56μm、58μm、60μm、62μm、65μm、68μm或70μm，优选为60μm。根据本实用新型，所述微流道13的材料为透明硅胶类材料，优选为PDMS。优选地，所述微流道13包括进样流道14、出样流道15和工作流道17。优选地，所述进样流道14和出样流道15为逐级分支状。优选地，所述进样流道14的深度为100-500μm，例如可以是100μm、102μm、103μm、105μm、110μm、115μm、120μm、125μm、130μm、132μm、135μm、138μm、140μm、145μm、150μm、160μm、170μm、180μm、200μm、220μm、250μm、260μm、280μm、300μm、320μm、350μm、380μm、400μm、420μm、450μm、480μm或500μm，优选为120-200μm，进一步优选为125μm。优选地，所述出样流道15的深度为100-500μm，例如可以是100μm、102μm、103μm、105μm、110μm、115μm、120μm、125μm、130μm、132μm、135μm、138μm、140μm、145μm、150μm、160μm、170μm、180μm、200μm、220μm、250μm、260μm、280μm、300μm、320μm、350μm、380μm、400μm、420μm、450μm、480μm或500μm，优选为120-200μm，优选为120-130μm，进一步优选为125μm。优选地，所述工作流道17的深度为50-150μm，例如可以是50μm、51μm、53μm、55μm、58μm、60μm、61μm、63μm、65μm、68μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、105μm、110μm、115μm、120μm、125μm、130μm、135μm、140μm、145μm或150μm，优选为70-100μm，进一步优选为80μm。微流控芯片的工作原理包括以下步骤：1)制备两种不同颜色荧光标记的细胞分散液：用两种荧光标记染料分别染色细胞，再将发红光和绿光的两种细胞分散在低导电性缓冲液中，得到2×105-2×107/mL细胞浓度的分散液；2)将绿色荧光细胞分散液微流控芯片上的微流道13的进样流道14中，流速为5-20μL/min，在施加正弦交流信号的叉指电极6之间产生非均匀电场，使得细胞在正介电电泳力的作用下捕捉到一侧的微腔阵列8中，捕捉1-10min，用缓冲液将多余的细胞冲走，实现绿色荧光细胞阵列的捕捉；3)红色荧光细胞分散液加入微流控芯片上的微流道13的进样流道14中，流速为5-20μL/min，在施加正弦交流信号的叉指电极7之间产生非均匀电场，进而使得细胞在正介电电泳力的作用下捕捉到另一侧的微腔阵列8中，捕捉1-10min，用缓冲液将多余的细胞冲走，实现红色荧光细胞阵列的捕捉，同时两种荧光细胞形成细胞配对；其中，所述施加正弦交流信号的交流电的电压峰峰值5-20Vpp，所述交流电的频率2-10MHz。4)将微流道13用夹具与平面形芯片17紧密贴合，从进样流道14引进缓冲液，缓冲液通过微流通道9流入，将每个微腔阵列8中配对的两个细胞冲到微腔阵列12的微挡板11上，实现细胞的接触。与现有技术相比，本实用新型具有如下有益效果：(1)本实用新型微流控芯片的平面形结构易于封装，通量高；(2)本实用新型的微流控芯片进行高通量单细胞捕捉和配对，所述方法配对效率高，配对效率可达60％，局部配对效率可达80％。附图说明图1为本实用新型的基于介电电泳的微流控芯片中平面形芯片的结构示意图；其中，图中1-第一层结构，2-叉指电极，3-第二层结构，4-第三层结构，5-第四层结构；图2为本实用新型平面形芯片中第一层结构的结构示意图；其中，图中6-叉指电极A，7-叉指电极B；图3为本实用新型平面形芯片中第二层结构的结构示意图；其中，图中8-微腔阵列，9-微流通道；图4为本实用新型平面形芯片中第三层结构的结构示意图；其中，图中10-导电层；图5为本实用新型平面形芯片中第四层结构的结构示意图；其中，图中11-微挡板，12-微腔阵列；图6为本实用新型的基于介电电泳的微流控芯片的结构示意图；其中，图中13-微流道，14-进样流道，15-出样流道，16-平面形芯片，17-工作流道；图7为本实用新型细胞配对结果图。具体实施方式为更进一步阐述本实用新型所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本实用新型的技术方案，但本实用新型并非局限在实施例范围内。实施例1：基于介电电泳的微流控芯片如图6所示，是本实用新型实施例所述基于介电电泳的微流控芯片的示意图，所述微流控芯片具体的结构如图1-5所示，所述微流控芯片包括底部的平面形芯片16和顶部的微流道13，所述平面形芯片具有依次叠加的四层结构；所述平面芯片的第一层结构1包括在玻璃基底上的ITO电极，所述ITO电极为叉指电极2，所述叉指电极2的数量为2-10，所述叉指电极2的宽度为10-30μm，所述叉指电极6中两根电极之间的间距为3-10μm，所述叉指电极6和叉指电极7的间距为5-50μm；所述平面芯片的第二层结构3为SU-8负胶，所示第二层结构3包括微腔阵列8，用于细胞捕捉，所述微腔阵列8的直径为10-30μm，所述微腔阵列8的深度为1-20μm；所述平面芯片的第三层结构4包括铜导电层10，用于形成叉指电极两端的导电区域，所述铜导电层10的的厚度为0.5-5μm；所述平面芯片的第四层结构5包括微腔阵列12和位于微腔阵列中的微挡板11，所述微腔阵列12用于细胞配对，所述微挡板11用于细胞接触，所述微腔阵列12的直径为130-200μm，所述微腔阵列12的深度为10-30μm，所述微挡板11的形状为半圆形，所述微挡板11的宽度为30-50μm，所述微挡板11的长度为50-70μm。所述第二层结构3和第四层结构5上还包括微流通道9，用于在细胞配对后将每个微腔阵列中的细胞冲到微挡板的位置，所述微流通道9的的宽度为3-15μm；所述微流道13包括进样流道14、出样流道15和工作流道17；所述进样流道14和出样流道15为逐级分支状；所述进样流道14的深度为100-500μm，所述出样流道15的深度为100-500μm；所述工作流道17的深度为50-150μm。微流控芯片的工作原理包括以下步骤：1)制备两种不同颜色荧光标记的细胞分散液：用两种荧光标记染料分别染色细胞，再将发红光和绿光的两种细胞分散在低导电性缓冲液中，得到2×105-2×107/mL细胞浓度的分散液；2)将绿色荧光细胞分散液微流控芯片上的微流道13的进样流道14中，流速为5-20μL/min，在施加正弦交流信号的叉指电极6之间产生非均匀电场，使得细胞在正介电电泳力的作用下捕捉到一侧的微腔阵列8中，捕捉1-10min，用缓冲液将多余的细胞冲走，实现绿色荧光细胞阵列的捕捉；3)红色荧光细胞分散液加入微流控芯片上的微流道13的进样流道14中，流速为5-20μL/min，在施加正弦交流信号的叉指电极7之间产生非均匀电场，进而使得细胞在正介电电泳力的作用下捕捉到另一侧的微腔阵列8中，捕捉1-10min，用缓冲液将多余的细胞冲走，实现红色荧光细胞阵列的捕捉，同时两种荧光细胞形成细胞配对；其中，所述施加正弦交流信号的交流电的电压峰峰值5-20Vpp，所述交流电的频率2-10MHz；4)将微流道13用夹具与平面形芯片17紧密贴合，从进样流道14引进缓冲液，缓冲液通过微流通道9流入，将每个微腔阵列8中配对的两个细胞冲到微腔阵列12的微挡板11上，实现细胞的接触。实施例2：基于介电电泳的微流控芯片所述微流控芯片包括底部的平面形芯片16和顶部的微流道13，所述平面形芯片具有依次叠加的四层结构；所述平面芯片的第一层结构1包括在玻璃基底上的ITO电极，所述ITO电极为叉指电极2，所述叉指电极2的数量为2，所述叉指电极2的宽度为20μm，所述叉指电极6中两根电极之间的间距为6μm，所述叉指电极6和叉指电极7的间距为10μm；所述平面芯片的第二层结构3为SU-8负胶，所示第二层结构3包括微腔阵列8，用于细胞捕捉，所述微腔阵列8的直径为20μm，所述微腔阵列8的深度为10μm；所述平面芯片的第三层结构4包括铜导电层10，用于形成叉指电极两端的导电区域，所述铜导电层10的的厚度为1μm；所述平面芯片的第四层结构5包括微腔阵列12和位于微腔阵列中的微挡板11，所述微腔阵列12用于细胞配对，所述微挡板11用于细胞接触，所述微腔阵列12的直径为170μm，所述微腔阵列12的深度为20μm，所述微挡板11的形状为半圆形，所述微挡板11的宽度40μm，所述微挡板11的长度为60μm；所述第二层结构3和第三层结构4之间还包括微流通道9，用于在细胞配对后将每个微腔阵列中的细胞冲到微挡板的位置，所述微流通道9的宽度为8μm；所述微流道13包括进样流道14、出样流道15和工作流道17；所述进样流道14和出样流道15为逐级分支状；所述进样流道14的深度为125μm，所述出样流道15的深度为125μm；所述工作流道17的深度为80μm。实施例3：细胞的捕捉和配对采用实施例2所述的基于介电电泳的微流控芯片，进行细胞的捕捉和配对，具体步骤如下：1)制备两种不同颜色荧光标记的细胞分散液：用两种荧光标记染料分别染色细胞，再将发红光和绿光的两种细胞分散在低导电性缓冲液中，得到2×106/mL细胞浓度的分散液；2)将绿色荧光细胞分散液微流控芯片上的微流道13的进样流道14中，流速为10μL/min，在施加正弦交流信号的叉指电极6之间产生非均匀电场，使得细胞在正介电电泳力的作用下捕捉到一侧的微腔阵列8中，捕捉3-5min，用缓冲液将多余的细胞冲走，实现绿色荧光细胞阵列的捕捉；3)红色荧光细胞分散液加入微流控芯片上的微流道13的进样流道14中，流速为10μL/min，在施加正弦交流信号的叉指电极7之间产生非均匀电场，进而使得细胞在正介电电泳力的作用下捕捉到另一侧的微腔阵列8中，捕捉3-5min，用缓冲液将多余的细胞冲走，实现红色荧光细胞阵列的捕捉，同时两种荧光细胞形成细胞配对；其中，所述施加正弦交流信号的交流电的电压峰峰值12Vpp，所述交流电的频率4MHz；4)将微流道13用夹具与平面形芯片17紧密贴合，从进样流道14引进缓冲液，缓冲液通过微流通道9流入，将每个微腔阵列8中配对的两个细胞冲到微腔阵列12的微挡板11上，实现细胞的接触。用荧光显微镜检测细胞的捕捉效率，先捕捉绿色荧光细胞，使用蓝色激光激发绿色荧光细胞发出绿光，记录绿色荧光细胞图像，再捕捉红色荧光细胞，使用绿色激光激发红色荧光细胞发出红光，记录红色荧光细胞图像，再用软件将两种荧光细胞图片合并到一起，计算单个细胞配对效率。结果如图7所示，通过单个细胞捕捉配对后，计算的细胞配对效率为80％。实施例4与实施例2相比，除了叉指电极2的宽度为10μm，所述叉指电极6中两根电极之间的间距为3μm，所述叉指电极6和叉指电极7的间距为5μm，其他部件与实施例2相同。实施例5与实施例2相比，除了叉指电极2的宽度为30μm，所述叉指电极6中两根电极之间的间距为10μm，所述叉指电极6和叉指电极7的间距为50μm，其他部件与实施例2相同。实施例2、实施例4-5检测的结果如下表1所示：表1实施例2实施例4实施例5配对率80％68％65％从表1可以看出，叉指电极的尺寸对配对效率产生了影响，实施例2中的配对率可达80％，在本申请的叉指电极的范围内，能够实现单细胞的有效配对。综合实施例与对比例，本实用新型的微流控芯片进行高通量单细胞捕捉和配对，所述方法配对效率高，配对效率可达60％以上，局部配对效率可达80％。申请人声明，本实用新型通过上述实施例来说明本实用新型的详细方法，但本实用新型并不局限于上述详细方法，即不意味着本实用新型必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本实用新型的任何改进，对本实用新型产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本实用新型的保护范围和公开范围之内。当前第1页1 2 3