一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法
【技术领域】
[0001]本发明公开一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法，属于组织和器官的人工制造技术领域。
【背景技术】
[0002]20世纪80年代中期，美国麻省理工学院的化学工程师Langer R与哈佛医学院的外科学副教授Vacanti J P提出了组织工程(Tissue Engineering)的概念。组织工程的本质在于细胞通过某种方式与基质(Matrix)或载体支架(Scaffold)结合起来制造新组织。组织工程为克服以往临床应用的组织器官修复与重建技术的诸多缺点开创了新途径，在全世界范围内得到广泛关注和迅速发展。基于细胞与载体支架相结合方式的组织工程研究，具体是先成形支架，然后种植细胞，也可称为细胞间接受控组装。目前已经在构建结构性组织如皮肤、软骨、骨、血管和神经等简单组织器官及小尺寸组织方面取得了很大的进展。细胞组装过程中常用的组装技术有动态混合、搅拌、灌流种植、真空深度吸滤等细胞组装技术，这些方式虽提高了细胞的组装率，但很难控制初始细胞种植数目和分布空间，多种细胞在三维空间定点粘附和沉积的可操作性也差，而初始细胞种植数目、细胞的初始分布空间对随后组织生长过程具有决定性的影响。特别是对于构建大尺寸实体结构的工程化组织，在支架中心部位的细胞由于组织液的渗透能力降低而发生营养不良，从而导致生长迟缓，缺乏血管化，最终导致“夹心”的现象发生。研究者围绕其中的困难和矛盾进行了大量的研究，包括研究新的细胞组装技术、改进支架的特性及材料的表面性能等。
[0003]使用电场力操控微粒的介电泳技术于1978年被波尔发现，至今已经得到广泛的应用。当一个介电颗粒被放置在一个非均匀场，这一微颗粒会变的有极性，非接触式的介电泳力就会作用于微颗粒。这一技术主要被应用在对不同微粒的筛选、移动和转运。最近的研究显示电场可以同时布置多种细胞以满足组织工程的潜在应用。然而现有介电泳力的应用都仅使用了二维的电极结构。正方形和菱形排布是两种常用的用于产生非均匀电场的介电泳电极尖端设计方法，也有集成微观尖端在两个同心螺旋电极间进而提高局部电场梯度，电极对产生的介电泳力只是操控周围的细胞贴附于电极表面的二维图案上。基于介电泳力的三维细胞操控技术近期出现报道，通过使用简单的金属电极提供三维电场以定位和定向目标细胞，通过设计具有不同高度电极尖端用以捕获或者分离特定的细胞。Henry K.Chu等在期干丨Jlab on chip上发表文章 “Dielectrophoresis-based Automatic 3D CellManipulat1n and Patterning through a Micro-electrode Integrated Mult1-layerScaffold”阐述了基于介电泳技术的三维细胞操控，有望将这一技术应用在组织工程中，然而由于文中采用的材料是碳黑与聚二甲基娃氧烧(carbon black andpolydime thylsi loxane，CB-PDMS)的共混物，这两种材料是完全无法在体内降解的，故无法应用于以组织工程为目的细胞三维组装中，其次论文采用的支架制造技术是通过手工叠加单层立体光刻的导电材料，无法精确的构造类组织结构体。
[0004]提出一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法，通过制造具有导电性的组织工程支架，将不同细胞(成体细胞、干细胞、内皮细胞或内皮祖细胞)被导电的组织工程支架吸附，实现精确控制细胞的分布和相对复杂结构体的成形，通过调选支架上导电区域控制不同细胞组装，进而实现具有血管网络的多种细胞组织工程支架的制造。
[0005]由于介电泳被认为是一种可以大批量非接触式操控带电粒子的无损伤技术，研发超过二维空间环境应用的介电泳技术，结合快速成形技术制造可导电的组织工程支架，通过对其结构的设计和组装细胞介质中电场梯度分布及强弱调控，进而实现特定细胞在标定结构上的空间分布。这一技术中的组织工程支架在兼有生物相容性、可降解性、结构强度等特点外，还具有导电性及管网络，这是基于支架制造的组织工程领域的一个新挑战。基于此技术制造可模拟自然组织器官的结构，将多种细胞及生物因子等，定量定位组装于不同空间位置，组装成具有活性的复杂结构体，预期可发育为一定功能的类组织前体，或是为研究不同细胞之间及与生物信号分子(生物因子，药物分子等)之间在类自然组织三维结构中的生物反应等提供必要的基础技术支持。可预见到，本技术在组织工程器官构建、多种细胞相互作用研究、药物系统筛选、生物传感器等诸多领域有重要的应用价值。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于通过采用快速成形方法与可导电可降解的生物材料，制造可导电的组织工程支架，进而通过介电泳力吸附及调控实现将不同细胞(成体细胞、干细胞、内皮细胞或内皮祖细胞)粘附于导电的组织工程支架上，实现精确控制细胞的分布和相对复杂结构体的成形，甚至实现具有血管网络的类组织器官的人工制造。
[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]一种基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法，其特征在于该方法按如下步骤进行:
[0009]I)将导电可降解生物材料均匀混合于聚酯类材料中制成重量与体积百分比浓度为5?15%的溶液；
[0010]2)将导电性极差或者不导电的生物可降解材料配制成重量与体积百分比浓度为5?10 %的溶液，置于无菌4°C?10 °C环境下5min?20min预凝胶化，具体凝胶化时间由材料的浓度及环境温度决定；
[0011]3)根据预先设计的CAD结构模型，在计算机控制下，将所述两种及以上配制材料分别装入料腔并装载在成形设备上并配以相应的喷头，在成形平台的同步运动下逐层堆积成与预设计一致的三维结构体；
[0012]4)将堆积成形的亚稳态三维结构体于-80°C低温储存5min后冷冻干燥形成三维支架，使用时装入正负电极并紫外灭菌；
[0013]5)将带有正负电极的三维支架浸入待组装的细胞溶液中并接通一定幅值的交流电，维持一段时间以完成细胞组装；
[00Μ]本发明所述的导电可降解生物材料为聚卩比略(Polypyrrole，PPy)或者是聚(3,4-乙稀二氧噻吩)_聚苯乙稀横酸(P1y (3，4-ethy lened1xyth1phene)poIystyrenesulfonate，PED0T: PSS)包裹的无氧化镁颗粒，聚酯类材料为聚乳酸-轻基乙酸共聚物(ploy(lactic-co-glycolic acid)，PLGA);所述的导电性差的材料采用明胶、胶原、壳聚糖、卡拉胶和海藻酸钠中的一种或者几种;所述的三维支架由导电层和不导电层交互叠加，导电层具有均勾分布的微尖端，层厚为50μηι?ΙΟΟμπι;所述的一定幅值的交流电为30Vpp?90Vpp;维持时间为5?lOmin。
[0015]本发明具有以下优点及突出性效果:
[0016]I)本发明采用的工艺介电泳被认为是一种可以大批量非接触式操控带电粒子的无损伤技术，将其应用于细胞组装，则在细胞组装过程中组装效率很高，而细胞的损伤率很低。
[0017]2)通过分步分时通电不同的组织工程支架材料区域，可实现不同细胞(成体细胞、干细胞、内皮细胞或内皮祖细胞)吸附及组装，进而实现特定细胞在标定结构上的空间分布。
[0018]3)本发明所采用的导电材料是可以用于快速成形及三维打印工艺的，实现精确控制细胞的分布和相对复杂结构体的成形，结构体强度高，可以支持大尺寸结构体的体内外长期生长，进而实现具有血管网络的类组织器官的人工制造。
【附图说明】
[0019]图1为基于介电泳吸附原理的细胞三维组装方法的工艺流程示意图。
[0020]图2为实现本发明的可导电组织工程支架成形系统示意图。
[0021]图1为本发明的工艺流程示意图。将导电可降解生物材料与聚酯类材料按一定比例配制成几种不同导电率的导电可降解复合材料，重量与体积百分比浓度为5?15%的溶胶状溶液，同时配制重量与体积百分比浓度为5?10%的不导电生物可降解材料并预凝胶化;将上述配制的材料分别装入成形设备的料腔中，在具有层片信息的三维支架几何模型的直接驱动下成形出可导电的组织工程支架结构体，将结构体冷冻干燥并灭菌备用;将已制备好并灭菌的导电组织工程支架接装电极对并浸入需要组装的细胞悬浮液，在一定幅值电压下保持一段时间，实现细胞被介电泳力作用进而粘附于支架上。
[0022]图2为实现本发明中提及的可导电组织工程支架成形系统示意图。制备一种或多种导电可降解生物材料及不导电生物材料溶胶溶液，装入挤压/喷射组装成形设备中，其系统组成示意图如图2所示。整个成形装置包括三维运动平台(21)、温控成形室(22)、挤压/喷射喷头组件(23)、挤压/喷射驱动装置(24)、控制软硬件(25)等;在计算机CAD模型直接驱动下，通过控制各喷头的挤压喷射运动及三