本发明涉及呈现生发促进活性和/或黑色素生成促进活性的肽、包含上述肽作为有效成分的脱发防止和/或改善用组合物、包含上述肽作为有效成分的生发和/或育发促进用组合物、上述肽的脱发防止和/或改善用途、上述肽的生发和/或育发促进用途、包含上述肽作为有效成分的黑色素减退症的预防和/或治疗用药剂学组合物、包含上述肽作为有效成分的黑色素减退症的预防和/或改善用化妆品组合物及上述肽的黑色素减退症的预防、改善和/或治疗用途。
背景技术：
：毛囊作为哺乳动物皮肤的独特器官，原生表皮的下部生长并向进一步深的皮肤层延伸而成的器官。在毛囊的基部存在作为小囊或真皮乳头细胞众所周知的细胞的塞(stennandpaus,physiol.rev.,81:449(2002))，乳头是在毛囊的正常循环(oliver,embryol.exp.morph.15:3311(1966)；oliver,embryol.exp.morph.16:231(1966))及毛干的生长中必须的。毛干为利用由角蛋白丝和纤丝凝集蛋白填充的坚固地紧贴的细胞制备而成的踏板形状的结构。人类的毛发周期性地重复生长期、退行期、休止期，并经过毛发脱掉且再次生成的过程。毛发周期的确定通过激素调节或很多生长因子等的调节形成。另一方面，毛发可由严重的压力或营养缺乏等提前经过退行期，来进入休止期从而诱发严重的脱发(americanjournalofpathology,162(3)(2003),(arck,petraclara；handjiski,bori))。在男性秃头中，头皮的前面及上部的毛囊相对于雄激素呈现感受性。因而，在男性秃头的情况下，与毛囊的破坏相比，相当于毛囊的小型化，原因在于作为男性激素的雄激素的过度分泌。因雄激素过多分泌导致激活5-α还原酶，从而睾酮变形为双氢睾酮(dihydrotestosterone，dht)，像这样生成的双氢睾酮缩短毛发生长的期间，对毛囊进行小型化，从而减少粗且结实的成毛的数量，因此诱发脱发。通常随着年龄的增加脱发扩散。例如，伤痕脱发症、烧伤或与压迫伤害相关的伤痕形成状态等不同地疾病状态可导致显著的脱发。为了治疗这种脱发现象，目前为止作为医药品使用多种物质，但是价格太贵，并诱发多种副作用。并且，存在如下缺点：这种医药品需要持续使用，当停止使用时，存在再次诱发脱发，并对功效的每个人的差异严重，并且每个人的副作用也存在差异。除此之外，用作化妆品的原料存在价格低廉的优点，但是由来源于植物提取物的成分构成，因此存在实际其功效不大的缺点。因此，还在有效、费用的方面上，在本领域中与进一步经济的新的有效成分相关的需求突出。目前为止众所周知的2种可利用的药物(米诺地尔及非那斯特莱)可延迟追加脱发，但是未诱导新的毛囊的再生。并且，在头发化妆品中，利用植物提取物等的脱发防止产品上市得多。例如，开发了如下男性脱发产品，即，含有苦参、辣椒、当药、上白皮、霜叶、人参、甘草、芍药、地黄、茴香、山茱萸、大蒜等的提取物的产品；通过添加含有黄嘌呤及生长激素的组合物，来改善基于双氢睾酮的过剩的细胞代谢的抑制，同时生长激素促进毛发生长，从而防止脱发及再生毛发，来呈现毛发生长促进效果的产品；为了促进生发及毛发的生长，通过开发含有矿物质及维生素类、绿茶、迷迭香、艾草、甘草提取液的产品，来向头皮和毛发供给营养，并对脱发的预防及促进毛发生长具有效果的生发促进用产品；通过混合维生素b、维生素c、维生素d、维生素e、烟酸、泛酸、生物素及叶酸等的物质和植物提取物，来抑制人体内的5-α还原酶，从而在男性激素的代谢过程中不形成双氢睾酮，有助于头发的新陈代谢作用的男士脱发产品，但是难以找到对新生毛发的生成为止产生影响的产品。皮肤细胞作为防御机制对紫外线或环境污染及除此之外的外部因子的刺激从存在于表皮基底层的黑素细胞(melanocyte)的黑素体(melanosome)中生成黑色素。黑色素为确定动物的皮肤、眼珠及头发的颜色的重要的因素。众所周知，减退症为皮肤癌的危险因子。东方人对形成过量的黑色素敏感，从而抑制黑色素生成的与美白相关的研究进行得多。但是，近来与通过抑制黑色素生成来呈现的白癜风(vitiligo)相关的需求也增加，从而还进行对此的研究。白癜风为由黑色素细胞的凋亡或坏死引起的多种大小及形态的白色斑呈现在皮肤的后天性脱色素疾病。作为发生在全球约1％的人口的比较常见的疾病，没有基于人种或地区的差异。发病年龄在10～30岁中最多，在95％的情况下，发生在40岁以前，30％的患者有家族史。对于白癜风生成的原因尚未确切的报告，但是提出自身免疫说、神经体液说、黑色素细胞自身破坏说等多种学说。自身免疫说为如下学说：因与黑色素细胞类抗原相关的自身抗体的表达，导致黑色素细胞的破坏或功能异常或由细胞毒性淋巴细胞或激活的淋巴细胞分泌的淋巴因子黑色素细胞被破坏。神经体液说作为儿茶酚胺生物合成的异常和单胺氧化酶的增加等造成与应激相关的过氧化氢，由此黑色素被破坏的学说，白癜风可根据神经节发生或还可以神经损伤或应激之后发病。黑色素细胞自身破坏说为如下学说：作为在黑色素形成过程中生成的中间代谢物质或最终代谢物质的苯酚复合物蓄积在黑色素细胞内，从而破坏细胞。除此之外，还提出固有细胞缺陷(inherentcellulardefect)、遗传因素，细胞凋亡，钙代谢异常等多种因子。黑色素从黑色素生成细胞(melanocytes)合成，通过紫外线照射或吸收毒性物质和化学物质，来在保护皮肤中起到重要的作用。因而，在不正常的发生黑色素合成的人中，与全部皮肤变成白色相比，部分变成白色，从而存在产生斑点的外形上的问题，进一步成为问题的是对外部刺激敏感。作为在黑色素合成中重要的酶的酪氨酸酶(tyrosinase)、酪氨酸酶相关蛋白-1(trp-1，tyrosinaserelatedprotein-1)、酪氨酸酶相关蛋白-2(trp-2，tyrosinaserelatedprotein-2)在氧化反应中作为催化剂起到作用(pigmentcellres.14(6):43744)。酪氨酸酶起到将酪氨酸(tyrosine)氧化为多巴(dopa，l-3,4-二羟基苯基丙氨酸(l-3,4-dihydroxyphenylalanine))，将多巴氧化为多巴醌(quinone)的作用，酪氨酸酶相关蛋白-1作为二羟基吲哚羧酸氧化酶(dihydroxyindolecarboxylicacidoxidase)参与将5，6-二羟基吲哚-2-羧酸(5，6-dihydroxyindole-2-carboxylicacid；dhica)转换为吲哚-5，6-醌-2-羧酸(indol-5，6-quinone-2-carboxylicacid)。酪氨酸酶相关蛋白-1起到稳定酪氨酸酶且调节活性的作用，酪氨酸酶相关蛋白-2利用多巴铬互变异构酶(tautomerase)，将多巴铬转换为5,6-二羟基吲哚-2-羧酸，来形成形成黑色素细胞的真黑色素(eumelanon)和苯丙氨酸(pheomelanon)，并根据它们的比率确定皮肤、头发、眼珠的颜色等。黑色素合成因紫外线照射和促黑素细胞激素(msh，α-melanocytestimulatinghormone)被激活。众所周知，α-促黑素细胞激素(α-msh)利用肽激素通过紫外线生成，并且在包括脑下垂体及皮肤的各种细胞中制备。α-促黑素细胞激素通过旁分泌(paracrine)作用于黑色素生成细胞的黑皮素受体(mcr，melanocortinreceptor)，来调节作为转录因子的小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)的活性，从而调节在黑色素合成中起到重要的作用的酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1(dhicaoxidase)、酪氨酸酶相关蛋白-2(dopachrometautomerase)等的活性(thejournalofbiologicalchemistryvol.273,no.31,issueofjuly31,pp.195609565,1998)。据报道，若黑色素形成细胞由紫外线(uv)或α-促黑素细胞激素受到刺激，则分别由p38或蛋白激酶a(pka，proteinkinasea)酪氨酸酶激活。但是，据报道在两种途径中，尤其，α-促黑素细胞激素→环磷腺苷(camp)→蛋白激酶a过程在黑色素合成中起到重要的作用，环磷腺苷的增加促进环磷腺苷效应元件结合蛋白(camp-responsiveelementbindingprotein)的磷酸化，环磷腺苷效应元件结合蛋白(camp-responsiveelementbindingprotein)的磷酸化促进作为转录因子的小眼畸形相关转录因子的表达，作为转录因子的小眼畸形相关转录因子的表达提高酪氨酸酶的活性，并使酪氨酸酶信使核糖核酸(mrna)的表达增加(nucleicacidsres.30(14):3096106,pigmentcellmelanomares21(6):66576)。另一方面，包括韩国的东方人希望具有白色皮肤，因此多进行与抑制黑色素生成的美白成分相关的研究。但是从皮肤的和色素生成细胞合成黑色素，通过紫外线照射或吸收毒性物质和化学物质，来在保护皮肤中起到重要的作用。在不呈现黑色素的正常合成的情况下，皮肤对外部刺激敏感且在外形上看起来也非正常，因此需要治疗为黑色素合成正常，并还进行过与此相关的研究。但是，到目前为止未充分地进行与促进黑色素合成相关的技术开发。本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的
技术领域：
的水平及本发明的内容。技术实现要素：技术问题本发明人努力开发生物学上具有有效的活性的肽，结果，确认具有序列表中序列1或序列2的氨基酸序列的肽呈现优秀的生发功效及黑色素生成促进活性，且阐明这些可有效地使用于脱发防止或改善及黑色素减退症的预防及治疗，从而完成了本发明。因此，本发明的目的在于，提供由序列1或序列2的氨基酸序列组成的呈现生发促进活性的肽。本发明的再一目的在于，提供脱发防止和/或改善用组合物，包含由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽作为有效成分。本发明的另一目的在于，提供生发和/或育发促进用组合物，包含由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽作为有效成分。本发明的还一目的在于，提供由序列1或序列2的氨基酸序列组成的呈现黑色素生成促进活性的肽。本发明的又一目的在于，提供黑色素减退症的预防和/或治疗用药剂学组合物，包含由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽作为有效成分。本发明的又一目的在于，提供黑色素减退症的预防和/或改善用化妆品组合物，包含由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽作为有效成分。根据以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图更加明确本发明的其他目的及优点。解决问题的方案本发明人努力开发生物学上具有有效的活性的肽，结果，确认由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽呈现优秀的生发功效及黑色素生成促进活性，且阐明这些可有效地使用于脱发防止或改善及黑色素减退症的预防及治疗，从而完成了本发明。本发明的肽为本发明人通过细胞增殖实验从保留的肽文库中筛选生发功效优秀的肽，作为本发明的肽提供共2种。本发明的一实施方式涉及包含序列1或序列2的氨基酸序列的呈现生发促进活性的肽。上述肽可包含序列1或序列2的氨基酸序列，例如，可以为由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽。作为本发明的肽选定氨基酸序列的一部分部位，为了增加其活性，可诱导肽的n-末端和/或c-末端变形。例如，上述c-末端变形可以为肽的c-末端变形为羟基(-oh)、氨基(-nh2)、叠氮化合物(-nhnh2)等，但不限定于此。并且，上述n-末端变形可以为肽的n-末端结合有选自乙酰基、芴基甲氧基羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基及硬脂酰基及聚乙二醇(peg)中的一种以上的保护基，但不限定于此。上述保护基起到从生物体内的蛋白质切割酶的攻击保护本发明的肽的作用。上述肽的n-末端和/或c-末端变形起到大大地对肽的稳定性进行改善的作用，通过这种变形，本发明的肽可使生物体内给药时的半衰期增加，从而具有高半衰期。根据本发明的一实施方式，本发明的肽促进毛囊细胞的生长，并促进作为毛发生长相关因子的β-连环蛋白的表达，使作为生发相关生长因子的角质形成细胞生长因子(kgf，keratinocytegrowthfactor)、血管内皮生长因子(vegf，vascularendothelialgrowthfactor)的表达增加，使作为生发信号分子的磷脂酰肌醇-3激酶(pi3k，phosphoinositide3-kinase)的表达增加，使细胞外信号调节激酶(erk，extracellularsignal-regulatedkinase)的磷酸化增加，使作为毛发生长相关因子的msh同源盒2(msx2)、ha3-ⅱ及角蛋白-14的表达增加，减少与毛发生长阻滞相关的转化生长因子-β1及dickkopfwnt信号通路抑制剂1(dkk-1)的表达，并诱导作为细胞细胞凋亡抑制蛋白质的b细胞淋巴瘤-2的表达增加及作为与细胞凋亡相关的蛋白质的b细胞淋巴瘤-2相关x蛋白的表达的减少。这种结果意味着本发明的肽对生发具有非常优秀的功效。因此，本发明的肽可作为脱发防止和/或改善、生发促进及毛发改善用途利用。本发明的再一实施方式涉及脱发防止或改善用组合物，包含选自由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽中的一种以上的肽作为有效成分。本发明的肽可通过诱导位于可生成毛根的皮肤组织的头发卵胞(hairfollicle)的细胞的增殖，来生成新的毛囊。尤其，通过激活β-连环蛋白(beta-catenin)的信号，来表达生发促进基因，并使参与生发的生长因子的表达增加。本发明的肽起到促进作为毛发生成且生长的时期的生长期的作用，通过以生长期保持因多种环境因素进行退行期的毛发的周期，来呈现脱发抑制效果，并且在正常毛发中，向毛发提供营养成分来可保持毛发健康。因此，本发明的组合物对脱发防止和/或改善非常有效。本发明的组合物包含上述的本发明的肽作为有效成分，因而为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间的共同的记载内容。本发明的另一实施方式涉及生发和/或育发促进用组合物，包含选自由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽中的一种以上的肽作为有效成分。本发明的组合物可制备成化妆品组合物，但不限定于此。上述化妆品组合物可包含本发明肽的化妆品有效量(cosmeticallyeffectiveamount)。并且，上述化妆品组合物还可包含在化妆品上接受的载体，但不限定于此。本发明的化妆品组合物可制备成本发明所属领域中通常制备的任何剂型，例如，可剂型化为溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、乳霜、乳液、粉、肥皂、含有表面活性剂的洁面剂、油、粉状粉底、乳浊液粉底、蜡粉底和/或喷雾剂的剂型等，但不限定于此。例如，可制备成柔肤化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、洁面霜、洗面奶、卸妆水、面膜、喷雾剂和/或粉的剂型。上述化妆品组合物的剂型为糊剂、乳霜或凝胶的情况下，可利用动物性油、植物性油、蜡、石蜡、淀粉、胺黄树胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等作为载体成分，但不限定于此。上述化妆品组合物的剂型为粉或喷雾剂的情况下，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙和/或聚酰胺粉作为载体成分，但不限定于此。上述化妆品组合物的剂型为喷雾剂的情况下，还可包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等的推进剂，但不限定于此。上述化妆品组合物的剂型为溶液或乳浊液的情况下，利用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体成分，例如可利用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或山梨糖醇的脂肪酸酯，但不限定于此。上述化妆品组合物的剂型为悬浮液的情况下，作为载体成分可利用液体稀释剂，如水、乙醇或丙二醇等；悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇，聚氧乙烯山梨醇酯和/或聚氧乙烯脱水山梨醇酯等；微晶纤维素；偏氢氧化铝；膨润土；琼脂和/或胺黄树胶等，但不限定于此。在上述化妆品组合物的剂型为含有表面活性剂的洁面剂的情况下，可利用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物性油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体成分，但不限定于此。包含于本发明的化妆品组合物的成分除了作为有效成分的肽类和载体成分之外，可包含通常利用于化妆品组合物的多种成分，例如，可包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和/或香料等的通常的助剂，但不限定于此。本发明的还一实施方式涉及由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽的脱发防止和/或改善用途。上述肽与上述的肽相同，因此为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间的共同的记载内容。本发明的又一实施方式涉及由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽的生发和/或育发促进用途。上述肽与上述的肽相同，因此为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间的共同的记载内容。本发明的又一实施方式涉及由序列1或序列2的氨基酸序列组成的呈现黑色素生成促进活性的肽。根据本发明的一实施方式，本发明的肽在黑色素形成细胞中使黑色素生成增加，使作为调节黑色素合成的酶的酪氨酸酶的活性及表达增加，使作为参与黑色素形成因子的小眼畸形相关转录因子(mitf)、酪氨酸酶相关蛋白1(trp1)的表达增加，使环磷腺苷效应元件结合蛋白(creb)的磷酸化增加。这种结果是指本发明的肽增加黑色素生成，从而具有缓解黑色素减退症的效果。因此，本发明的肽可作为黑色素减退症的预防、改善和/或治疗用途利用。上述黑色素减退症可以为白癜风、白化病、脱色素痣、白色糠疹、花斑癣、炎症后脱色、斑状硬皮病、部分性白化病、特发性点状色素减少症和/或点状白化病，但不限定于此。本发明的又一实施方式涉及黑色素减退症的预防和/或治疗用药剂学组合物，包含选自由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽中的一种以上的肽作为有效成分。在本发明的组合物制备成药剂学组合物的情况下，可包含上述的本发明的肽的药剂学有效量(pharmaceuticallyeffectiveamount)。并且，上述药剂学组合物还可包含在药剂学上接受的载体，但不限定于此。包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体作为制剂时通常所使用的物质，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和/或矿物油等，但并不限定于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂及保鲜剂等，但并不限定于此。本发明的药剂学组合物能够以非口服的方式给药，例如，可通过皮肤局部给药进行给药。本发明药剂学组合物的适合的给药量由制剂化方法，给药方式、患者的年龄、体重、性别、病理状态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应感应性等因素多样，普通熟练的医生可容易地确定及处方对期望的治疗或预防有效的给药量。根据本发明的优选实例，本发明的药剂学组合物的1日给药量为0.001～1000mg/kg。本发明的药剂学组合物通过本发明所属
技术领域：
的普通技术人员可容易实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位容量的形态制备或内入于多容量容器内来制备。此时，剂型为油或水性介质中的溶液、悬浮液和/或乳化液的形态，或可以为浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂、凝胶(例如，水凝胶)的形态，还可包含分散剂和/或稳定剂，但不限定于此。本发明的又一实施方式提供黑色素减退症的预防和/或改善用化妆品组合物，包含选自由序列1或序列2组成的肽中的一种以上的肽作为有效成分。在本发明的组合物制备成化妆品组合物的情况下，可包含上述的本发明的肽的化妆品有效量(cosmeticallyeffectiveamount)。并且，上述药剂学组合物还可包含在化妆品上接受的载体，但不限定于此。在本说明书中，术语“肽”是指由肽键氨基酸残基相互结合而形成的线型分子。可通过本领域的公知的化学合成方法，尤其通过固相合成技术(solid-phasesynthesistechniques；merrifield,j.amer.chem.soc.85:2149-54(1963)；stewart,etal.,solidphasepeptidesynthesis,2nd.ed.,piercechem.co.:rockford,111(1984))或液相合成技术(us授权专利第5516891号)制备本发明的肽。在本说明书中术语“稳定性”是不仅指体内稳定性而且还指储存稳定性(例如，常温储存稳定性)。在本发明中“生发促进”是指生成毛发，以使毛发生成速度及生成量增加的广义来使用。并且，还指增强毛根功能或缩短毛发的脱落及生成周期，来从毛囊中生长的毛发的数量增加。在本发明中“毛发生长”或“育发”是指对所生成的毛发(头发)的粗度增加或长度、生长速度产生影响。在本发明中，“脱发防止”是指抑制或弱化毛发从毛囊或头皮脱落的现象。在本说明书中，术语“化妆品有效量”是指在实现上述的本发明的组合物的功效中充分的量。在本说明书中，术语“药剂学有效量”是指在实现上述的肽的功效或活性中充分的量。发明的效果本发明涉及呈现生发促进活性和/或黑色素生成促进活性的肽、包含上述肽作为有效成分的脱发防止和/或改善用组合物、包含上述肽作为有效成分的生发和/或育发促进用组合物、上述肽的脱发防止和/或改善用途、上述肽的生发和/或育发促进用途、包含上述肽作为有效成分的黑色素减退症的预防和/或治疗用药剂学组合物、包含上述肽作为有效成分的黑色素减退症的预防和/或改善用化妆品组合物及上述肽的黑色素减退症的预防、改善和/或治疗用途。上述肽通过促进毛囊细胞生长且使生发相关生长因子及生发相关因子的表达增加，来对生发呈现优秀的效果。并且上述肽通过使酪氨酸酶的活性增加且使参与黑色素形成的因子的表达增加，来在黑色素生成中呈现优秀的效果。上述的本发明的肽的优秀的活性及稳定性可非常有利地适用于医药、医药外品及化妆品。附图说明图1a为表示由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的人毛囊毛乳头细胞(humanhairfollicledermalpapillacells，hhfdpc)的生长促进效果的图表。图1b为表示由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的人毛囊毛乳头细胞的生长促进效果的图表。图2a为示出对通过由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽β-连环蛋白的表达增加进行确认的结果的图。图2b为示出对通过由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成成的肽β-连环蛋白的表达增加进行确认的结果的图。图3a为示出对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的角质形成血管内皮生长因子的表达增加进行确认的结果的图。图3b为示出对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的角质形成细胞生长因子的表达增加进行确认的结果的图。图4a为示出对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的细胞外信号调节激酶磷酸化的增加进行确认的结果的图。图4b为示出对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的磷脂酰肌醇-3激酶的表达增加及细胞外信号调节激酶磷酸化的增加进行确认的结果的图。图5为示出对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的msh同源盒2的表达增加进行确认的结果的图。图6a为示出对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的转化生长因子-β1的表达抑制进行确认的结果的照片。图6b为示出对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的转化生长因子-β1的表达抑制进行确认的结果的照片。图7a为示出对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的b细胞淋巴瘤-2的表达增加及b细胞淋巴瘤-2相关x蛋白的表达减少进行确认的结果的照片。图7b为示出对基于由本发明一实施例的序列3的氨基酸序列组成的肽的b细胞淋巴瘤-2的表达增加及b细胞淋巴瘤-2相关x蛋白的表达减少进行确认的结果的照片。图8a为示出对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的ha3-ⅱ及角蛋白-14的表达增加进行确认的结果的图。图8b为示出对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的角蛋白-14的表达增加进行确认的结果的图。图9a为示出在基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽中，对通过双氢睾酮处理增加的作为毛发生长阻滞因子的dickkopfwnt信号通路抑制剂1的信使核糖核酸(信使核糖核酸)的表达减少进行确认的结果的图。图9b为示出在基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽中，对通过双氢睾酮处理增加的作为毛发生长阻滞因子的dickkopfwnt信号通路抑制剂1的信使核糖核酸(信使核糖核酸)的表达减少进行确认的结果的图。图10a为示出对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的dickkopfwnt信号通路抑制剂1的表达减少进行确认的结果的图。图10b为示出对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的dickkopfwnt信号通路抑制剂1的表达减少进行确认的结果的图。图11a为示出对基于由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽的黑色素生成增加效果进行确认的结果的图。图11a为示出对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的黑色素生成增加效果进行确认的结果的图。图12a为示出对通过由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽络氨酸络氨酸酶的活性增加进行确认的结果的图。图12b为示出对通过由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽络氨酸络氨酸酶的活性增加进行确认的结果的图。图13a为示出对通过由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽小眼畸形相关转录因子、络氨酸酶的信使核糖核酸的表达增加进行确认的结果的图。图13b为示出对通过由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽小眼畸形相关转录因子、络氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白1的信使核糖核酸的表达增加进行确认的结果的图。图14a为示出对通过由本发明一实施例的序列1的氨基酸序列组成的肽小眼畸形相关转录因子及络氨酸酶的蛋白质表达增加进行确认的结果的图。图14b为示出对通过由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽小眼畸形相关转录因子及络氨酸酶的蛋白质表达增加进行确认的结果的图。图15为示出对基于由本发明一实施例的序列2的氨基酸序列组成的肽的环磷腺苷效应元件结合蛋白的磷酸化增加进行确认的结果的图。具体实施方式涉及由序列1或序列2的氨基酸序列组成的呈现生发促进活性和/或黑色素生成促进活性的肽。以下，通过实施例更加详细说明本发明。这种实施例只用于更加详细说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说是显而易见的。实施例合成例1：肽的合成将700mg的氯三苯甲基氯树脂(chlorotritylchlorideresin；ctlresin，novabiochemcatno.01-64-0021)放入反应容器中，并放入10ml的二氯甲烷(mc)来搅拌了3分钟。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(dmf)来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的二氯甲烷溶液放入反应器中，并放入200mmole的fmoc-leu-oh(bachem，swiss)及400mmole的二异丙基乙胺(diea)后，搅拌并均匀溶解，搅拌1小时并进行反应。反应后清洗，将甲醇和二异丙基乙胺(2：1)溶解于二氯甲烷(dcm，dechloromethane)中，反应10分钟，并用过量的二氯甲烷/二甲基甲酰胺(1：1)进行清洗。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(dmf)来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的脱保护溶液(20％的哌啶(piperidine)/二甲基甲酰胺)放入反应容器中，并在常温条件下搅拌10分钟后，去除了溶液。放入同量的脱保护溶液，并重新维持10分钟反应后，去除溶液，并分别以3分钟的方式用二甲基甲酰胺清洗2次、用二氯甲烷清洗1次、用二甲基甲酰胺清洗1次，来制备了leu-ctlresin树脂。在新的反应器中放入10ml的二甲基甲酰胺溶液，并加入200mmole的fmoc-thr(tbu)-oh(bachem，swiss)、200mmole的羟基苯并三唑(hobt)及200mmole的苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(bop)后，搅拌来均匀溶解。在反应器中，经过2次以分馏的方式放入400mmole的n，n-二异丙基乙胺(diea)后，搅拌至所有固体溶解为止至少5分钟。将溶解的氨基酸混合溶液放入具有脱保护的树脂的反应容器中，在常温条件下搅拌1小时并进行反应。去除反应液，并用二甲基甲酰胺溶液每次搅拌5分钟，并搅拌3次后去除。取少量的反应树脂，并利用凯撒测试(nihydrintest)检查了反应程度。使用脱保护溶液，以与上述方法相同的方法进行2次脱保护反应，来制备了thr(tbu)-leu-ctlresin树脂。使用二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分清洗，并重新执行一次凯撒测试，接着以与上述方法相同的方法执行了以下氨基酸附着实验。根据选定的氨基酸序列，按fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-trp-oh、fmoc-lys(boc)-oh及fmoc-trp-oh的顺序进行连锁反应。利用脱保护溶液使fmoc-保护基以10分钟的方式反应2次后，清洗干净并去除。利用二甲基甲酰胺、二氯甲烷及甲醇，分别将放入乙酸酐和n，n-二异丙基乙胺、羟基苯并三唑(hobt)乙酰化1小时后制备的肽基树脂清洗3次，使氮气慢慢流入来干燥后，在五氧化二磷(phosphoruspentoxide，p2o5)条件下，减压成真空状态，来完全干燥后，放入30ml的泄漏溶液[95％的三氟乙酸(tfa，trifluroaceticacid)、2.5％的蒸馏水、2.5％的苯甲硫醚(thioanisole)]，接着，在常温条件下微动一下，并维持2小时反应。通过过滤对树脂进行过滤，并利用少量的溶液清洗树脂后，与母液进行混合。利用减压蒸馏至剩有总容积的一半左右的容积，并加入50ml的凉的醚诱导沉淀后，进行离心分离来收集沉淀，并利用更凉的醚清洗2次。去除母液，并在氮条件下充分干燥，来合成了0.73g的纯化前的序列1的肽(trp-lys-trp-arg-ser-ala-asp-thr-leu)(收率：93.1％)。当利用分子量测定仪测定时，可得到的分子量为1162.3(理论值：1162.3)。还与上述相同的方法进行了另一由序列2(lys-trp-lys-arg-ser-ala-asp-thr-leu)组成的肽的合成。表1实施例1：dpc增殖分析将人毛囊真皮乳头细胞(humanhairfollicledermalpapillacells)以2×103细胞/孔的密度接种在96孔板后，培养过夜。更换为无血清培养基后，通过处理肽来培养3天，并以每孔100μl的方式处理4mg/ml的mtt溶液，来反应4小时。通过处理二甲基亚砜(dmso)溶解所生成的甲臜后，使用微孔板读板仪测定在560nm条件下的吸光度，并在图1a及图1b示出其结果。如从图1a及图1b可确认，确认了通过处理由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽，人毛囊毛乳头细胞的生长以浓度依赖性的得到促进。实施例2：β-连环蛋白激活测试将人毛囊真皮乳头细胞以4×105细胞/孔的密度接种在6孔板后，培养过夜。更换为无血清培养基后，通过处理肽来培养15分钟、30分钟，并回收细胞，来分别分离核和细胞质蛋白，并利用β-联环蛋白抗体(美国桑塔克鲁兹生物技术公司(santacruzbiotechnology，usa))进行免疫印迹，来比较β-环状蛋白表达形态，并在图2a及图2b示出其结果。如从图2a及图2b可确认，在人毛囊毛乳头细胞中，作为毛发生长相关因子的β-连环蛋白的表达通过序列表中序列1或序列2的肽处理增加。β-连环蛋白的表达增加及活性使毛发生长相关分子的表达增加。实施例3：角质形成细胞生长因子、血管内皮生长因子的逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)将人毛囊真皮乳头细胞以4×105细胞/孔的密度接种在6孔板后，培养过夜。更换为无血清培养基后，通过处理肽来培养24小时，并回收细胞来分离了核糖核酸(rna)。进行核糖核酸定量后，利用互补脱氧核糖核酸(cdna)合成试剂盒(韩国intron公司(intron，korea))合成互补脱氧核糖核酸，并利用聚合酶链式反应(pcr)预混合物(韩国intron公司)及各个角质形成细胞生长因子、血管内皮生长因子的引物进行聚合酶链式反应后，在5％的琼脂糖凝胶中进行电泳，来在各个样品处理条件下，比较上述生长因子的信使核糖核酸(mrna)的表达程度，并在图3a及图3b示出其结果。表2如从图3a可确认，确认了通过由序列1的氨基酸序列组成的肽处理，对人毛囊毛乳头细胞产生影响的血管内皮生长因子的表达增加。并且，如从图3b可确认，确认了通过由序列2的氨基酸序列组成的肽处理，作为对人毛囊毛乳头细胞的生长产生影响的角质形成细胞生长因子的表达增加。实施例4：磷脂酰肌醇-3激酶&磷酸化细胞外信号调节激酶(p-erk)免疫印迹(wb)将人毛囊真皮乳头细胞以4×105细胞/孔的密度接种在6孔板后，培养过夜。更换为无血清培养基后，通过处理肽来培养15分钟、30分钟，并回收细胞，来准备细胞溶解物。利用磷脂酰肌醇-3激酶抗体(美国桑塔克鲁兹生物技术公司)及磷酸-细胞外信号调节激酶抗体(phospho-erk)(美国细胞信号技术(cellsignalingtechnology，usa))进行免疫印迹，来比较蛋白表达形态，并在图4a及图4b示出其结果。如从图4a可确认，通过由序列1的氨基酸序列组成的肽处理，对人毛囊毛乳头细胞的生长产生影响的细胞外信号调节激酶的磷酸化水平增加。并且。如从图4b可确认，通过由序列2的氨基酸序列组成的肽处理，在人毛囊毛乳头细胞中观察到了作为毛发生长信号分子的磷脂酰肌醇-3激酶的表达增加及细胞外信号调节激酶的磷酸化水平的增加。实施例5：msh同源盒2的逆转录-聚合酶链反应将人毛囊真皮乳头细胞以4×105细胞/孔的密度接种在6孔板后，培养过夜。更换为无血清培养基后，通过处理肽来培养24小时，并回收细胞来分离了核糖核酸。进行核糖核酸定量后，利用互补脱氧核糖核酸合成试剂盒(韩国intron公司)合成互补脱氧核糖核酸，并利用聚合酶链式反应预混合物(韩国intron公司)及msh同源盒2引物进行聚合酶链式反应后，在5％的琼脂糖凝胶中进行电泳，来在各个样品处理条件下，比较上述生长因子的信使核糖核酸的表达程度，并在图5示出其结果。表3序列号引物的命名序列表(5’-3’)7msx2_faacacaagaccaaccggaag8msx2_rgcagccattttcagcttttc如从图5可确认，确认了通过由序列1的氨基酸序列组成的肽处理，在人毛囊毛乳头细胞中，作为对毛干(hairshaft)的伸长(elongation)产生影响的因子的msh同源盒2的表达增加。实施例6：转化生长因子-β1的逆转录-聚合酶链反应将人毛囊真皮乳头细胞以4×105细胞/孔的密度接种在6孔板后，培养过夜。更换为无血清培养基后，通过处理肽来培养24小时，并回收细胞来分离了核糖核酸。进行核糖核酸定量后，利用互补脱氧核糖核酸合成试剂盒(韩国intron公司)合成互补脱氧核糖核酸，并利用聚合酶链式反应预混合物(韩国intron公司)及转化生长因子-β1引物进行聚合酶链式反应后，在5％的琼脂糖凝胶中进行电泳，来在各个样品处理条件下，比较上述生长因子的信使核糖核酸的表达程度，并在图6a及图6b示出其结果。表4如从图6a及图6b可确认，确认了通过由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽处理，在人毛囊毛乳头细胞中，作为毛发生长抑制因子之一的转化生长因子-β1的表达被抑制。实施例7：b细胞淋巴瘤-2/b细胞淋巴瘤-2相关x蛋白的免疫印迹将人毛囊真皮乳头细胞以4×105细胞/孔的密度接种在6孔板后，培养过夜。更换为无血清培养基后，通过处理肽来培养24小时，并回收细胞，来准备细胞溶解物。利用b细胞淋巴瘤-2及b细胞淋巴瘤-2相关x蛋白抗体(美国桑塔克鲁兹生物技术公司)进行免疫印迹，来比较蛋白表达形态，并在图7a及图7b示出其结果。如从图7a及图7b可确认，确认了通过由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽处理，在人毛囊毛乳头细胞中作为抗细胞凋亡蛋白质的b细胞淋巴瘤-2的表达增加，且作为与细胞凋亡相关蛋白质的b细胞淋巴瘤-2相关x蛋白的表达减少。实施例8：ha3-ⅱ及角蛋白-14的逆转录-聚合酶链反应将人毛囊真皮乳头细胞以5×105细胞/孔的密度接种在6孔板后，培养过夜。更换为无血清培养基后，通过处理肽来培养24小时，并回收细胞来分离了核糖核酸。进行核糖核酸定量后，利用互补脱氧核糖核酸合成试剂盒(韩国intron公司)合成互补脱氧核糖核酸，并利用聚合酶链式反应预混合物(韩国intron公司)及ha3-ⅱ角蛋白-14引物进行聚合酶链式反应后，在5％的琼脂糖凝胶中进行电泳，来在各个样品处理条件下，比较上述生长因子的信使核糖核酸的表达程度，并在图8a及图8b示出其结果。表5序列号引物的命名序列表(5’-3’)11ha3-ⅱ_fgagaagtatagcagtaagacag12ha3-ⅱ_rcaagaggaaagtttattaggc13角蛋白-14_fccacctttcatcttcccaattctc14角蛋白-14_rgtgcggatctggcggttg如从图8a可确认，确认了通过由序列1的氨基酸序列组成的肽处理，在人毛囊毛乳头细胞中，作为毛发生长相关因子的ha3-ⅱ、角蛋白-14的信使核糖核酸的表达增加。如从图8b可确认，确认了通过由序列1的氨基酸序列组成的肽处理，在人毛囊毛乳头细胞中，角蛋白-14的信使核糖核酸的表达增加。实施例9：dickkopfwnt信号通路抑制剂1的逆转录-聚合酶链反应将人毛囊真皮乳头细胞以5×106细胞/孔的密度接种在6孔板后，培养过夜。更换为无血清培养基后，通过处理肽来培养24小时，并回收细胞，来分离核糖核酸。进行核糖核酸定量后，利用互补脱氧核糖核酸合成试剂盒(韩国intron公司)合成互补脱氧核糖核酸，并利用聚合酶链式反应预混合物(韩国intron公司)及dickkopfwnt信号通路抑制剂1的引物进行聚合酶链式反应后，在5％的琼脂糖凝胶中进行电泳，来在各个样品处理条件下，比较上述生长因子的信使核糖核酸的表达程度，并在图9a及图9b示出其结果。表6如从图9a及图9b可确认，通过由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽处理，在人毛囊毛乳头细胞中，通过双氢睾酮处理增加的作为毛发生长阻滞相关因子的dickkopfwnt信号通路抑制剂1的蛋白的表达减少。实施例10：dickkopfwnt信号通路抑制剂1的免疫印迹将人毛囊真皮乳头细胞以4×105细胞/孔的密度接种在6孔板后，培养过夜。更换为无血清培养基后，通过处理肽来培养24小时，并回收细胞，来准备细胞溶解物。利用dickkopfwnt信号通路抑制剂1抗体(美国桑塔克鲁兹生物技术公司)进行免疫印迹，来比较蛋白表达形态，并在图10a及图10b示出其结果。如从图10a及图10b可确认，通过由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽处理，在人毛囊毛乳头细胞中，通过双氢睾酮处理增加的作为毛发生长阻滞相关因子的dickkopfwnt信号通路抑制剂1的蛋白的表达减少。实施例11：黑色素形成阵列在37℃的培养器下，在6-孔培养用平板中，将黑色素形成细胞(b16f10细胞株(cellline))培养24小时后，去除各个板的培养基，并更换为新的培养基后，按浓度处理本肽。培养72小时后去除培养液，并摘除细胞后，转移到1.5ml的管，来在13000rpm下进行3分钟的离心分析，并去除上清液，通过回收细胞聚合体，来观察黑色素。针对于细胞聚合体，放入每次150μl的2m的naoh，并在60℃的温度下，将细胞内黑色素溶解30分钟。针对于溶解在96-孔平板的各个孔而获得的上清液，以100μl的方式放入，来在490nm条件下测定吸光度，并在图11a及图11b示出其结果。如从图11a及图11b可确认，通过由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽处理，在黑色素细胞中黑色素的生成增加。实施例12：酪氨酸酶活性试验将黑素瘤细胞株(b16f10)在6-孔培养用平板中培养24小时，并按浓度处理肽来培养了72小时。将6-孔培养用平板放在冰上，并利用凉的磷酸盐缓冲液(pbs)清洗后，放入300μl的含有1％tritonx-100的0.1m的磷酸钠缓冲液(ph6.8，溶解缓冲液)，并将细胞收集到1.5ml的管，来将在-270℃的温度下进行速冻后解冻的反应重复5次来破坏细胞膜。在13000rpm下进行20分钟的离心分离后，将上清液收集到另一个1.5ml管中，并对这些试样的蛋白质进行定量。稀释至试样的蛋白质浓度相同，以3个孔的方式接种在96孔培养用平板上，并加入20μl的10mm的l-多巴(l-dopa)，在37℃的温度下培养1小时后，在475nm下测定了吸光度，并在图12a及图12b示出其结果。如从图12a及图12b可确认，通过由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽处理，黑色素细胞内的酪氨酸酶活性增加。实施例13：与黑色素生成相关的基因的逆转录-聚合酶链反应将黑色素形成细胞(b16f10细胞株)在6-孔培养用平板中培养24小时后，按浓度处理肽。提取培养72小时的细胞的核糖核酸后，制备了互补脱氧核糖核酸。利用作为参与黑色素形成的因子的与小眼畸形相关转录因子及酪氨酸酶相关的各个特异性引物进行聚合酶链式反应，来观察各个基因的表达变化，并在图13a及图13b示出其结果。表7序列号引物的命名序列表(5’-3’)17小眼畸形相关转录因子_fccagcctggcgatcatgtcat18小眼畸形相关转录因子_rggtctggacaggagttgctg19酪氨酸酶_f(tyrosinase_f)ggccagctttcaggcagagg20酪氨酸酶_r(tyrosinase_r)tggtgcttcatgggcaaaat21酪氨酸酶相关蛋白1_ftctgtgaaggtgtgcaggag22酪氨酸酶相关蛋白1_rccgaaacagagtggaaggtt如从图13a可确认，当对黑色素细胞处理由序列1的氨基酸序列组成的肽时，作为参与黑色素形成过程的转录因子的小眼畸形相关转录因子及作为酶的酪氨酸酶的信使核糖核酸的表达增加。如从图13b可确认，当对黑色素细胞处理由序列2的氨基酸序列组成的肽时，作为参与黑色素形成过程的转录因子的小眼畸形相关转录因子、作为酶的酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白1的信使核糖核酸的表达增加。实施例14：与黑色素生成相关的蛋白质免疫印迹将黑色素形成细胞(b16f10细胞株)在6-孔培养用平板中培养24小时后，按浓度处理本肽。培养72小时后，溶解细胞，并利用特异性抗体(2种均为美国桑塔克鲁兹生物技术公司(santacruzbiotechnology，usa))对作为参与黑色素形成的因子的小眼畸形相关转录因子及酪氨酸酶的表达通过免疫印迹确认，并在图14示出其结果。如从图14a及图14b可确认，当对黑色素细胞处理由序列1或序列2的氨基酸序列组成的肽时，作为参与黑色素形成过程的转录因子的小眼畸形相关转录因子及作为酶的酪氨酸酶的蛋白质表达增加。实施例5：与黑色素生成相关的蛋白质活性试验将黑色素形成细胞(b16f10细胞株)在6-孔培养用平板中培养24小时后，按浓度处理本肽。培养72小时后，溶解细胞，并利用特异性抗体(美国细胞信号技术(cellsignalingtechnology，usa))对作为参与黑色素形成的信号传递物质的环磷腺苷效应元件结合蛋白的磷酸化程度通过免疫印迹进行确认。如从图15可确认，当对黑色素细胞处理由序列2的氨基酸序列组成的肽时，作为参与黑色素形成过程的因子的磷腺苷效应元件结合蛋白的磷酸化水平增加。以上，详细说明了本发明的特定部分，但可以明确的是，对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，这些具体说明只属于一个优选实例，本发明的范围不局限于此。因此，本发明的实质性范围由所附的发明要求保护范围和其等同技术方案来定义。产业上的可利用性本发明涉及呈现生发促进活性和/或黑色素生成促进活性的肽、包含上述肽作为有效成分的脱发防止和/或改善用组合物、包含上述肽作为有效成分的生发和/或育发促进用组合物、上述肽的脱发防止和/或改善用途、上述肽的生发和/或育发促进用途、包含上述肽作为有效成分的黑色素减退症的预防和/或治疗用药剂学组合物、包含上述肽作为有效成分的黑色素减退症的预防和/或改善用化妆品组合物及上述肽的黑色素减退症的预防、改善和/或治疗用途。序列表<110>caregenco.,ltd.<120>呈现生发和/或育发促进活性的肽及其的用途<130>pp170017<160>22<170>kopatentin2.0<210>1<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>肽1<400>1trplystrpargseralaaspthrleu15<210>2<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>肽2<400>2lystrplysargseralaaspthrleu15<210>3<211>22<212>dna<213>kgf正向引物<400>3tctgtcgaacacagtggtacct22<210>4<211>23<212>dna<213>kgf反向引物<400>4gtgtgtccatttagctgatgcat23<210>5<211>21<212>dna<213>vegf正向引物<400>5ccatgaactttctgctgtctt21<210>6<211>21<212>dna<213>vegf反向引物<400>6tcgatcgttctgtatcagtct21<210>7<211>20<212>dna<213>msx2正向引物<400>7aacacaagaccaaccggaag20<210>8<211>20<212>dna<213>msx2反向引物<400>8gcagccattttcagcttttc20<210>9<211>21<212>dna<213>tgf-β1正向引物<400>9gccctggataccaactattgc21<210>10<211>21<212>dna<213>tgf-β1反向引物<400>10tcagcacttgcaggagtagcg21<210>11<211>22<212>dna<213>ha3-ii正向引物<400>11cagaagtatagcagtaagacag22<210>12<211>21<212>dna<213>ha3-ii反向引物<400>12caagaggaaagtttattaggc21<210>13<211>24<212>dna<213>角蛋白-14正向引物<400>13ccacctttcatcttcccaattctc24<210>14<211>18<212>dna<213>角蛋白-14反向引物<400>14gtgcggatctggcggttg18<210>15<211>20<212>dna<213>dkk-1正向引物<400>15tgatgagtactgcgctagtc20<210>16<211>20<212>dna<213>dkk-1反向引物<400>16ctcctatgcttggtacacac20<210>17<211>21<212>dna<213>mitf正向引物<400>17ccagcctggcgatcatgtcat21<210>18<211>20<212>dna<213>mitf反向引物<400>18ggtctggacaggagttgctg20<210>19<211>20<212>dna<213>酪氨酸酶正向引物<400>19ggccagctttcaggcagagg20<210>20<211>20<212>dna<213>酪氨酸酶反向引物<400>20tggtgcttcatgggcaaaat20<210>21<211>20<212>dna<213>trp1正向引物<400>21tctgtgaaggtgtgcaggag20<210>22<211>20<212>dna<213>trp1反向引物<400>22ccgaaacagagtggaaggtt20当前第1页12