透明皮肤试样的制作方法

本发明涉及能够通过光片显微镜(lightsheetmicroscope)来观察表皮紧下方组织的透明皮肤试样、其制造方法、以及皮肤切片的处理方法。

背景技术：

作为将组织进行3维解析的技术，一直以来进行了使用了荧光显微镜的技术，但在用荧光显微镜观察组织的情况下，需要将组织包埋，通过切片机制作经切削的薄切片。这样的方法虽然适于对细胞结构等微细结构进行3维解析，但是为了观察更大的组织结构，在试样的调制和褪色等方面产生问题。为了解决这样的问题，开发出将片状的激发光从试样侧面照射，来获得光学截面的光片显微镜，对生物体试样、生物体组织等更大的试样进行3维解析成为可能。使用光片显微镜时，适于斑马鱼、鳉鱼那样的透明度高的试样，另一方面，对于哺乳动物的生物体组织、组织切片那样的不透明试样，必须进行透明化处理。

近年来，开发出多种组织试样的透明化技术(专利文献1)。作为透明化技术，主要大致区分为使用了有机溶剂透明化剂的技术(非专利文献1)、和使用了水溶性透明化剂的技术(非专利文献2)，但分别在透明化的困难性、透明化试样的折射率、抗原性的维持方面具有课题。此外，在将人组织透明化的情况下，已知人组织中基质丰富，光散射性高，难以透明化。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2014-5231号公报

非专利文献

非专利文献1：cell(2014)vol.159,issue4,pp.896-910

非专利文献2：natureneuroscience(2015),vol.18,no.10,pp1518-1529

非专利文献3：cell(2014)vol.157,issue3,pp.726-39

非专利文献4：proceedingsoftheieeeconferenceoncomputervisionandpatternrecognitionworkshops:29-37

技术实现要素：

发明所要解决的课题

本发明人等尝试了人皮肤切片的透明化，结果发现下述课题：除了皮肤中的基质丰富存在所带来的透明化的困难性以外，还不能观察被透明化的皮肤试样的表皮紧下方。

用于解决课题的方法

因此，本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现表皮部分的透明化不充分(图1)。对从皮肤切片仅去除表皮部分的方法进行了研究，结果发现通过采用分散酶溶液的处理来除去表皮部分从而能够观察表皮紧下方的毛细血管结构，完成了本发明。

具体而言，本发明涉及一种透明皮肤试样，是能够通过光片显微镜来观察表皮紧下方组织的透明皮肤试样，其不伴有表皮，并维持了抗原性。

在其它的方案中，本发明也涉及从取得的皮肤切片制造透明皮肤试样的方法、和通过该制造方法制造的透明皮肤试样。

在进一步其它的方案中，本发明也涉及皮肤切片处理方法、和通过光片显微镜观察通过该处理方法进行了处理的皮肤试样的方法。

发明的效果

通过使用本发明的透明皮肤试样，能够观察表皮紧下方的结构。

附图说明

图1是对不进行表皮除去处理，进行透明化处理而取得的人皮肤试样，使用抗cd31抗体作为一抗，使用alexafluoro594标记抗羊igg抗体作为二抗，通过光片显微镜取得的三维图像。可以理解表皮紧下方的区域的结构不能可视化。

图2中图2(a)是不进行表皮除去处理，进行透明化处理而取得的透明的人皮肤试样切片的照片。在表皮侧残留不透明的层。图2(b)是进行表皮除去处理，接着进行透明化处理而取得的透明的人皮肤试样切片的照片。

图3是对进行表皮除去处理，接着进行透明化处理而取得的人皮肤试样，使用抗cd31抗体作为一抗，使用alexafluoro594标记抗羊igg抗体作为二抗，通过光片显微镜取得的三维图像。表皮紧下方的毛细血管的结构可以可视化。图3(a)是关于从人的背部取得的皮肤切片的图像，图3(b)是关于从人的面部取得的皮肤切片的图像。在背部，毛细血管采用环(loop)结构，另一方面，在面部，毛细血管采用随机结构，这方面是不同的。

图4是对进行表皮除去处理，接着进行透明化处理而取得的人皮肤试样，使用抗cd31抗体与cy3标记抗αsma抗体作为一抗，使用alexafluoro488标记抗羊igg抗体作为二抗，通过光片显微镜取得的三维图像。图4(a)是关于从人的背部取得的皮肤切片的图像，图4(b)是关于从人的面部取得的皮肤切片的图像。α-sma是在平滑肌中被表达的蛋白质，cd31是在血管内皮细胞被表达的蛋白质。由图4a和b，显示出包围血管内皮细胞的平滑肌，在背部与面部的皮肤中，毛细血管的结构不同。背部的皮肤从上方观察毛细血管时往往看起来像点，另一方面，面部的皮肤的毛细血管即使从上方观察也看起来像形成网状。即，对于背部的皮肤，可以认为环状的毛细血管向上延伸，另一方面，面部的皮肤的毛细血管沿横向扩展，在这方面是不同的。

图5是关于进行表皮除去处理，并使用各种透明化处理方法进行了透明化的人皮肤试样，显示透明度的图。

图6中图6a是进行表皮除去处理，并使用各种透明化处理方法进行了透明化的人皮肤试样的照片。图6b是表示在各种透明化处理方法中进行了透明化的皮肤试样中的雾度率的图。

图7是关于眼梢的皮肤、皮下脂肪组织、和轮状肌肉成为一体的皮肤样品，分别显示cd31、与lyve1、脂滴包被蛋白(perilipin)、或抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的共标记图像。

图8是关于年轻的被检人群、与老龄的被检人群的面颊、眼梢和背部来源的进行了表皮除去的皮肤试样，将血管用cd31抗体可视化了的图像。

图9是测定被可视化的血管的体积、直径和分支数，在年轻的被检人群、与老龄的被检人群中进行了比较的图。

具体实施方式

本发明涉及一种透明皮肤试样，是能够通过光片显微镜来观察表皮紧下方组织的透明皮肤试样，其不伴有表皮，并维持了抗原性。

在本发明中，皮肤试样可以为由任意动物种取得的皮肤试样，也可以为通过三维培养技术而培养的培养皮肤组织。作为动物种，可举出任意的哺乳动物，例如人、猪、马、牛、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、猴、黑猩猩等，不限定于此。从有益于美容的观点考虑，皮肤试样优选由人取得。皮肤试样的取得位置可以为任意位置，可举出例如脸部、腕部、腹部、臀部等。此外，从对存在暗沉、肌肤粗糙、斑、皱纹、皮肤炎等皮肤问题的皮肤区域中的结构进行解析的观点考虑，可以从存在皮肤问题的皮肤区域取得皮肤试样。

所谓“透明”，只要是能够通过光片显微镜观察的透明度，就可以为任意透明度。从能够通过光片显微镜观察的观点考虑，所谓透明，是指波长380nm～780nm的光线可以透射，优选为波长450nm～750nm，更优选为波长490nm～650nm的光线可以透射。“能够通过光片显微镜来观察表皮紧下方组织的透明”皮肤试样并不意图为仅供于光片显微镜的试样，只要是具有上述透明性的皮肤试样，当然也能够用通常的荧光显微镜、共聚焦显微镜等观察。透明性可以通过任意指标来确定，例如可以使用下述式子所示的平行光线透射率。

tp＝(tt-(1-s1)×α)/s1-td/s1

{式中，

td为扩散透射率，

tt为全光线透射率，

s1为皮肤组织的面积率，

α为盖玻片的全光线透射率(0.77)，

tp为皮肤组织的平行光线透射率}

在计算上述平行光线透射率的情况下，为10％～100％。关于扩散透射率、全光线透射率、和平行光线透射率，可以通过使用雾度计(hazemeter)来计算。更具体而言，可以使用村上色彩技术研究所制的hr-100制品来确定。从通过光片显微镜观察表皮紧下方组织的观点考虑，平行光线透射率的下限优选为20％以上，更优选为25％以上。从使用focus法的观点考虑，透明度优选为30％以上。从使用idisco法的观点考虑，优选为40％以上的透明度，进一步优选为45％以上。上限没有特别特定，作为能够实现的数值范围，可举出例如为90％以下，更优选为80％以下，进一步优选为60％以下。

皮肤试样的透明化可以通过进行已知的透明化处理，例如非专利文献1～2所记载的透明化处理来实现。透明化处理通过使皮肤试样与透明化剂接触来进行。作为透明化剂，可举出有机溶剂透明化剂与水溶性透明化剂，作为有机溶剂透明化剂的例子，可举出idisco、babb等，作为水溶性透明化剂，可举出clarity、cubic、scale/s、focusclear等。这些透明化剂可以基于通用办法来使用(非专利文献1～2)。通常，透明化处理对进行了固定处理和抗体标记处理的皮肤试样进行，但也可以在透明化处理的过程中进行标记处理。

在使用了idisco法作为透明化处理的情况下，本发明的透明皮肤试样的制造方法包含以下工序：

使皮肤切片与表皮除去用的酶溶液接触的工序，

使该皮肤切片与固定溶液接触而固定的工序，

与包含叠氮化钠的溶液接触的工序，

与甲醇溶液接触的工序，

与二氯甲烷溶液接触的工序，

与苄基醚溶液固定的工序。

可以进一步包含与包含抗体的溶液接触的标记工序。标记工序能够在与包含叠氮化钠的溶液接触的工序之后进行。

在使用了babb法作为透明化处理的情况下，本发明的透明皮肤试样的制造方法包含以下工序：

使皮肤切片与表皮除去用的酶溶液接触的工序，

使该皮肤切片与甲醇溶液接触而固定的工序，

与babb溶液(苄醇和苯甲酸苄酯的混合溶液)接触的工序。

可以进一步包含与包含抗体的溶液接触的标记工序。标记工序能够在与甲醇溶液接触的工序之后进行。

甲醇溶液可以从稀甲醇溶液(例如33％)到100％甲醇依次置换。

在使用了cubic法作为透明化处理的情况下，本发明的透明皮肤试样的制造方法包含以下工序：

使皮肤切片与表皮除去用的酶溶液接触的工序，

使该皮肤切片与固定溶液接触而固定的工序，

与包含氨基醇、表面活性剂、和脲的cubic-1溶液接触的工序，

与包含氨基醇、表面活性剂、和糖类的cubic-2溶液接触的工序。

可以进一步包含与包含抗体的溶液接触的标记工序。标记工序能够在与cubic-1溶液的接触工序之后进行。作为cubic-1所使用的氨基醇，可举出n,n,n’,n’-四(2-羟基丙基)乙二胺，作为表面活性剂，可举出tritonx-100。作为cubic-2溶液所使用的氨基醇，可举出2,2’,2”-氮川三乙醇(2,2’,2”-nitrilotriethanol)，作为表面活性剂，可举出tritonx-100，作为糖类，可举出蔗糖。

在使用了scale/s法或focusclear法作为透明化处理的情况下，本发明的透明皮肤试样的制造方法包含以下工序：

使皮肤切片与表皮除去用的酶溶液接触的工序，

使该皮肤切片与固定溶液接触而固定的工序，

与scale/s溶液或focusclear溶液接触的工序。

可以进一步包含与包含抗体的溶液接触的标记工序。标记工序能够在固定工序后进行。

所谓不伴有表皮的皮肤试样，是指表皮通过物理处理、化学处理、或酶处理而被除去的试样。表皮存在于皮肤的最外层，从最外层起由角质层、颗粒层、棘层、和基底层构成，通过表皮基底膜而与真皮隔开。并不意图限定于理论，但可知由于表皮包含使透明化困难的黑素细胞、折射率高的角质层，因此难以通过透明化处理而透明化，因此对于包含表皮的透明皮肤试样，不能观察表皮紧下方的结构(图1)。所谓不伴有表皮的皮肤试样，只要是实质上不伴有表皮即可。所谓实质上不伴有表皮，是指只要能够实现作为本发明的目的的通过光片显微镜来观察表皮紧下方组织，就可以包含某程度的表皮的细胞，只要是光片显微镜的激光透射性的表皮，就可以包含于皮肤试样。此外，皮肤试样可以与皮肤一起包含存在于真皮层的进一步深部的皮下脂肪组织、肌肉组织。

作为用于除去表皮的物理处理，可举出热处理、使用了解剖刀、镊子等的剥离处理，在目视下或显微镜下，除去表皮区域。作为酶处理，可举出采用蛋白质分解酶的处理。作为蛋白质分解酶，可以为非特异性酶、特异性酶中的任一种，在分离表皮细胞的目的下，可使用分散酶、胰蛋白酶等。表皮与真皮的边界具有被称为乳头层的镶嵌结构，因此从效率好地除去表皮的观点考虑，优选为酶处理。如果通过酶处理来除去表皮，则能够取得在维持乳头结构同时除去了表皮的皮肤试样。此外对于热处理等物理处理，真皮的蛋白的抗原性丧失，因此从抗原性维持的观点考虑，酶处理也适合。

所谓维持了抗原性的皮肤试样，是指对应的抗体能够与皮肤试样中包含的各种蛋白质的表位部分特异性结合的皮肤试样。维持了抗原性的皮肤试样并不意图一定维持全部抗原性。原来的免疫染色的领域中，通常在固定处理等处理期间一部分抗原性丧失，即使是对精制蛋白质、表位具有特异性结合性的抗体，也不一定在固定试样中发生特异性结合。因此，在本发明中所谓“维持了抗原性”，是指至少1种、或1种以上抗体具有特异性而具有对表位的结合性。在透明化处理在抗体处理后进行的情况下，透明皮肤试样包含与靶抗原结合的标记抗体。并不意图限定于以下例子，作为一例，优选维持针对选自cd31、lyve1、脂滴包被蛋白和抗肌萎缩蛋白中的至少1种蛋白质的抗原性。从将皮肤紧下方的脉管可视化的观点考虑，优选维持针对cd31、lyve1的抗原性。

通过将透明皮肤试样供于光片显微镜，使皮肤试样中的特定蛋白质用抗体识别，从而可以可视化。此外，通过使用针对皮肤所包含的任意结构中特异性表达的蛋白质的抗体，可以观察皮肤所包含的任意结构。作为皮肤的结构，可举出细胞外基质、淋巴管、静脉、动脉、毛细血管、神经、汗腺、皮脂腺、细胞成分例如肥大细胞、浆细胞、成纤维细胞、朗格汉斯细胞((langerhan-cell)、梅克尔细胞(merkelcell)、血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞、神经细胞、汗腺细胞等，但并不意图限定于此。例如，在将血管可视化的情况下，可使用针对血管的细胞中特异性表达的蛋白质、cd31、vwf、cd34等的抗体。在将细胞外基质可视化的情况下，可使用针对胶原、弹性蛋白、αsma、纤连蛋白等的抗体。在将神经可视化的情况下，可以使用针对pgp9.5等的抗体。在将淋巴管可视化的情况下，可使用针对lyve-1、podoplanin等的抗体。这些抗体可以单独使用，也可以组合使用。

为了观察透明皮肤试样而使用的抗体可以为从任意动物种取得的抗体，此外也可以为噬菌体展示法等基因工程上制作的抗体。作为动物种，可举出小鼠、人、大鼠、兔、山羊、骆驼、驴等，通过对这些动物导入抗原，可以取得抗体。抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。可以为作为这些抗体的组合的嵌合抗体。代替抗体，也可以使用具有结合性的抗体片段。作为抗体的片段的例子，可举出fab片段、fv片段、f(ab’)2片段、fab’片段、或scfv。

也可以对与抗原直接结合的抗体本身附上能够通过光片显微镜观察的标记，也可以对针对与抗原直接结合的抗体的二次以后的抗体附上标记。被附上的标记优选为荧光显微镜所使用的任意荧光标记，使用例如若丹明、荧光素、cy色素、alexa等任意荧光标记。通过使用与多个抗原分别结合的抗体，作为将各抗体区分开结合的二抗，使用附有不同标记的抗体，也可以将多个抗原同时或连续可视化。

除了用抗体进行的标记以外，或者代替用抗体进行的标记，可以对透明皮肤试样中的细胞进行细胞核染色，也可以使荧光蛋白质表达。作为细胞核染色试剂，可以使用公知的荧光试剂，可以使用例如dapi、碘化丙啶(pi)、hoechst33342等。细胞核染色、抗体的荧光标记优选以具有能够分别区分开识别的荧光波长的方式进行选择。荧光蛋白质例如gfp等可以通过制作在所希望的启动子的下游导入了gfp、yfp的基因的转基因动物来利用，或者通过使载体局部地在动物中表达来利用。

本发明的其它方案中，本发明也涉及由皮肤切片制造透明皮肤试样的方法或皮肤切片的处理方法。皮肤切片可以使用预先取得的皮肤切片。这些方法可以以任意顺序包含以下工序：

使皮肤切片与表皮除去用的酶溶液接触而除去表皮的工序，

使皮肤切片与固定溶液接触而固定的工序，

使皮肤切片与透明化试剂接触而透明化的工序。

优选依次进行表皮除去工序、固定工序、然后透明化工序。在固定工序之后，可以进一步包含使皮肤切片与标记抗体溶液接触的标记化工序。在各工序前后，可以包含洗涤工序。本发明的进一步的方案也涉及通过由皮肤切片制造透明皮肤试样的方法制造的透明皮肤试样。

表皮除去工序例如能够通过在表皮除去用的酶溶液中，在室温、加温下或冷却下孵育数小时～数天来进行。从促进酶反应的观点考虑，优选为37℃附近，例如33℃～40℃。另一方面，从防止蛋白质改性的观点考虑，优选在冷却下孵育，例如在0℃～5℃，优选为4℃～5℃下孵育。从适当地除去表皮的观点考虑，优选例如在冷却下孵育1小时～2天，进一步优选孵育3小时～12小时。为了仅除去表皮，优选使皮肤切片的表皮侧对浸泡了酶溶液的纱布等支持体接触而孵育。最适当地，通过在浸泡了酶溶液的纱布等吸水性的支持体上，使皮肤切片的表皮为下侧进行载置来孵育。孵育条件能够根据试样的取得部位而不同，也能够根据试样取得部位的状态而变化。例如，对于粗糙的肌肤，皮肤阻挡功能降低，因此酶溶液的渗透快，能够选择弱的孵育条件，例如短时间和低温度的条件。在与酶溶液的接触后，通过使用镊子等将表皮从真皮剥离来除去表皮。

固定工序可以按照在免疫染色的领域中使用的通常方法来进行。作为固定溶液，可以使用低聚甲醛、甲醇等。作为一例，能够通过在4％低聚甲醛溶液中，浸泡皮肤切片，在室温或冷却下，孵育数分钟～数天来进行。对于固定后的试样，酶处理不易起效，因此优选在表皮除去工序之后，进行固定工序。

标记工序可以按照在免疫染色的领域中使用的通常方法进行。例如，对于被固定了的试样，也可以将针对靶抗原的抗体在一抗溶液中孵育，洗涤后，在针对一抗的被标记了的二抗的溶液中孵育。抗体的稀释率、孵育时间、温度可以根据所使用的抗体而适当选择。从避免褪色的观点考虑，期望与标记二抗溶液的孵育在暗处进行。期望标记工序后的处理和保存全部在暗处进行。

透明化工序可以通过在已知的透明化试剂的溶液中孵育试样来进行。作为透明化工序的一例，可举出采用idisco法(idisco:asimple,rapidmethodtoimmunolabellargetissuesamplesforvolumeimaging.cell159,896910,november6,2014)、cubic法、scale法、或focusclear法的处理。为了取得充分透明的试样，透明化试剂和孵育时间等可以适当选择。

经过标记工序而制作的透明皮肤试样供于光片显微镜、荧光显微镜下的观察。光片显微镜、荧光显微镜下的观察可以通过这些显微镜所通常使用的方法来进行。例如通过根据被付与了的标记来选择入射光，选择与激发光对应的过滤器，从而能够观察来自标记的激发光。

通过使用本发明的透明皮肤试样，可以观察皮肤内部的微细结构，由此累积认识皮肤内部结构。通过细致地观察皮肤的问题例如肌肤粗糙、斑、皱纹、黄褐斑、痤疮等皮肤区域中的皮肤内部结构，从而能够有益于其原因、改善/治疗法的开发。本发明虽然需要使用侵袭性地取得的皮肤切片，但是该光片显微镜、荧光显微镜下的观察方法优异，是与现在进行了开发的非侵袭性的皮肤内部结构的观察方法无法比较的程度，此外该可视化对象的结构也明确。因此，在采用期待将来利用的侵袭性方法的皮肤内部结构的观察之前，使得对皮肤内部结构的数据和认识的累积成为可能。

在本说明书中提及的全部文献的整体通过引用而并入到本说明书中。

以下说明的本发明的实施例以仅仅例示作为目的，并不限定本发明的技术范围。本发明的技术范围不仅仅限定于权利要求书的范围的记载。以不超出本发明的宗旨作为条件，可以进行本发明的变更例如本发明的构成要件的追加、删除和替换。

实施例

酶处理工序

将分散酶(roche)(38u/vial)用milliq水38ml溶解。在培养皿中铺上无尘纸并浸泡分散酶。使0.5mm见方的人皮肤切片的表皮侧向下，浸泡于分散酶，在4℃下孵育一晚。次日，使用镊子剥落角质层。

使用了cubic的透明化处理

将5mm见方的人皮肤切片浸渍在4％低聚甲醛(pfa)中，以rotatorrt-50(taitec)使其旋转，在4℃下孵育一晚而固定。使被固定了的皮肤切片试样在cubic-1溶液中渗透1周。在cubic-1处理后，用pbs洗涤3次，在20％蔗糖溶液中在4℃下旋转一晚。然后，在o.c.tcompound(sakuraファインテック)中冷冻。解冻后，用pbs洗涤3次后，在一抗溶液中在37℃下渗透3天。用pbst(pbs+0.1％triton)洗涤3次后，在二抗溶液中在37℃下渗透一晚。用pbst(pbs+0.1％triton)洗涤3次后，用20％蔗糖浸泡一晚，放入到cubic-2溶液中，在4℃下孵育1周。cubic-1和cubic-2的组成如susakietal.,cell.2014apr24；157(3):726-39所记载的那样。具体而言，cubic-1溶液为包含n,n,n’,n’-四(2-羟基丙基)乙二胺、tritonx-100、和脲的溶液，cubic-2溶液为包含2,2’,2”-氮川三乙醇、tritonx-100、和蔗糖的溶液。

使用了scale或focusclear的透明化处理

将5mm见方的人皮肤切片在4％低聚甲醛(pfa)中在4℃下固定。固定后用pbs洗涤3次后，在一抗中在4℃下渗透7天，用pbst洗涤3天，用二抗在4℃下渗透7天。用pbst洗涤后，用focusclear(销售商：cedarlane)或scale(销售商：オリンパス社)在4℃下渗透7～14天。

使用了idisco的透明化处理

将5mm见方的皮肤样品用4％pfa固定。用pbs洗涤3次。在5％triton2.5％tween20的pbs溶液中振荡后，用pbs洗涤3次。然后，在permblocksolution(加入了0.5gbsa，50μltween20，300μl的5％叠氮化钠的pbs溶液50ml)中振荡。接着，在包含一次抗体的溶液中在37℃振荡3天，用pbst(0.1％tween20)洗涤3天。在包含二抗的溶液中在37℃振荡3天后，用pbst(0.1％tween20)洗涤3天。然后，用50％meoh浸泡振荡3小时，用70％meoh浸泡振荡3小时，用100％meoh浸泡振荡一晚。最后，用二氯甲烷(sigma)振荡15分钟×2次，在二苄基醚(sigma)中静置一晚。

作为皮肤样品，使用了从面部取得的皮肤切片、与从背部取得的皮肤切片。调制出进行酶处理而除去了表皮的皮肤样品、与不进行酶处理而残留表皮的皮肤样品。对皮肤样品，通过idisco法进行透明化处理。将进行透明化处理后的试样示于图2中。作为一抗使用了用pbs进行了100倍稀释的抗cd31绵羊抗体(销售商：r&dsystems)，作为二抗使用了用pbs进行了200倍稀释的alexafluoro594标记抗绵羊igg抗体(销售商：invitrogen)。此外作为共染色，使用了用pbs进行了稀释的cy3标记抗αsma抗体(销售商：sigma)进行了染色。将被染色了的皮肤试样在光片显微镜(制造商カールツァイス社)中观察。在残留表皮的皮肤样品中，将cd31可视化了的照片示于图1中。关于除去了表皮的皮肤样品(从背部取得的皮肤切片与从面部取得的皮肤切片)，将cd31可视化了的照片示于图3(a)和图3(b)中。此外，关于除去了表皮的皮肤样品(从背部取得的皮肤切片与从面部取得的皮肤切片)，将cd31与αsma可视化，并构建了3维结构的照片示于图4(a)和(b)中。

透明度测定法

对于除去了角质层的皮肤组织，分别进行了cubic处理、focusclear处理、scale处理、和idisco处理。关于进行了透明处理的皮肤组织，参照tainakaetal.,cell.2014nov6；159(4):911-24对透明度测定进行改编而使用。利用雾度计(hazemeter)(公司名：制品编号：)，测定了人皮肤组织的td：扩散透射率tt：全光线透射率。由于皮肤组织未覆盖试验片全部，因此进行面积率(s1)的校正，算出了皮肤组织的平行光线透射率(tp)。具体而言，由下述式算出。

tp＝(tt―(1-s1)×α)/s1―td/s1

{式中，

td为扩散透射率，

tt为全光线透射率，

s1为皮肤组织的面积率，

α为盖玻片的全光线透射率(0.77)，

tp为皮肤组织的平行光线透射率}

将结果示于图5中。

此外，通过将扩散透射率除以全光线透射率而计算出雾度(％)。

人皮肤样品

从ilsbiollc(chestertown,md)或(gakugeidai-nishiguchiclinic)取得人皮肤样品。从ilsbio取得的亚洲人的脸部和背部的皮肤试样全部基于美国和国际伦理指南而取得。ilsbio实验方法受到卫生与公众服务认证机构审查委员会(healthandhumanservicesregisteredinstitutionalreviewboard(irb))承认。在收集之前取得了知情同意。

此外，由学艺大西口诊所，从日本人男性和女性的眼梢，取得了皮肤、轮状肌肉和皮下脂肪组织成为一体的皮肤样品。确认了这些对象未患有特应性皮炎、酒渣性皮炎。将全部样品迅速冷冻，然后供于组织学分析。包含人对象的全部方法受到资生堂全球创新中心的机构审查委员会承认，而且对全部对象取得了书面的知情同意。

将所得的皮肤样品供于上述酶处理工序，剥落了角质层。通过将角质层被剥落了的皮肤样品浸渍在4％低聚甲醛(pfa)中来固定。

透明化

将被固定了的脸部来源的皮肤样品供于cubic、focusclear、baab、和idisco法，进行了透明化。拍摄被透明化的皮肤样品(图6a)。对被透明化的皮肤样品，如上所述，测定光透射率，测定雾度(％)。将结果示于图6b中。

免疫标记

皮肤、轮状肌肉和皮下脂肪组织的多重标记

将被pfa溶液固定了的皮肤、轮状肌肉和皮下脂肪组织成为一体的皮肤样品用pbs洗涤，用pbs中的0.5％tritonx-100进行透过处理，接下来与pbs中的1％tritonx-100/0.5％tween-20孵育。在与封闭溶液孵育3天后，将试样与封闭溶液中的一抗在37℃下孵育3天。这里，使用了针对cd31的抗多克隆绵羊抗体((r&dsystems,minneapolis,mn)、针对lyve-1的多克隆兔抗体(angiobio,sandiego,ca)、针对脂滴包被蛋白的多克隆豚鼠抗体(progen,heidelberg,germany)、或针对抗肌萎缩蛋白的多克隆兔抗体(santacruzbiotechnology,dallas,texas)作为一抗。这里，获得了用抗cd31抗体与抗lyve1抗体进行了共标记的皮肤样品、用抗cd31抗体与抗脂滴包被蛋白抗体进行了共标记的皮肤样品、和用抗cd31抗体与抗抗肌萎缩蛋白抗体进行了共标记的皮肤样品。将这些进行了共标记的皮肤样品用pbs-t洗涤二天，进而接下来以稀释于封闭溶液的alexafluoro594标记抗绵羊igg抗体(销售商：invitrogen)、和alexafluoro488标记抗兔igg抗体或alexafluoro488标记抗豚鼠igg抗体作为二抗，在37℃下孵育3天，从而进行了多重标记。

关于面颊、眼梢、和背部来源的皮肤样品的cd31的单标记

将被pfa溶液固定了的面颊、眼梢、和背部来源的皮肤样品用pbs洗涤，用pbs中的0.5％tritonx-100进行透过处理，接下来与pbs中的1％tritonx-100/0.5％tween-20孵育。在与封闭溶液孵育3天后，将试样与封闭溶液中的一抗在37℃下孵育3天。这里，使用了针对cd31的抗多克隆绵羊抗体((r&dsystems,minneapolis,mn)作为一抗。将试样用pbs-t洗涤二天，进而接下来以稀释于封闭溶液的alexafluoro594标记抗绵羊igg抗体(销售商：invitrogen)作为二抗，在37℃下孵育3天从而进行了单标记。

将免疫标记后的样品如上所述供于idisco法，进行了透明化。将被透明化了的皮肤样品供于显微镜和成像分析。

显微镜和成像分析

关于进行了免疫标记的皮肤样品，使用光片荧光显微镜(lightsheetmicroscopyz.1,carlzeiss,germany)取得了图像。使用软件zen(carlzeiss)进行了最大投影。将imaris软件(bitplane,concord,ma)用于3d用。关于用抗cd31抗体与抗lyve1抗体进行了共标记的皮肤样品的皮肤的区域，将cd31与lyve1分别可视化而取得了3维图像；关于用抗cd31抗体与抗脂滴包被蛋白抗体进行了共标记的皮肤样品的皮下组织的区域，将cd31与脂滴包被蛋白(perilipin)分别可视化而取得了3维图像；关于用抗cd31抗体与抗抗肌萎缩蛋白抗体(dystrophin)进行了共标记的皮肤样品的肌肉层的区域，将cd31与抗肌萎缩蛋白分别可视化而取得了3维图像(图7)。

将面颊、眼梢和背部的皮肤分成2个年龄群，即“年轻的群(关于面颊的皮肤，平均年龄20.8±4.8岁，年龄范围18～29岁，n＝4；关于眼梢的皮肤，平均年龄20.5±5.4岁，年龄范围12～27岁，n＝4；关于背部的皮肤，平均年龄19.3±6.4岁，年龄范围18～20岁，n＝3)”，以及“年老的群(关于面颊的皮肤，平均年龄46.3±2.2岁，年龄范围45-50岁；关于眼梢的皮肤，平均年龄51.3±9.7岁，年龄范围35-61岁，n＝4：关于背部的皮肤，平均年龄44.3±4.1岁，年龄范围39-49岁，n＝3”。将这些对象的面颊、眼梢、背部的皮肤中的血管通过使用了上述抗cd31抗体的标记可视化而进行了拍摄(图8)。如已经报导(非专利文献4：biser,satoi,kajiyak,etal.(2016)3dstructuremodelingofdensecapillariesbymulti-objectstracking.proceedingsoftheieeeconferenceoncomputervisionandpatternrecognitionworkshops:29-37)那样进行形态3维分析，从图像测定了血管的体积、尺寸和毛细血管的分支数(图9)。

统计分析

将全部统计由平均±sd表示。使用anova，接着使用posthock检验，进行了统计分析。为了评价对照群、与多个群的比较中的统计上的显著性差异，使用了tukey检验、接下来bartlett检验。使p<0.05为显著性差异。