细胞培养用或组织工程用支架的制作方法

本发明涉及支架，更详细地，涉及通过实现适合于所培养的细胞的迁移、增殖、分化的微环境来提高细胞的存活率，易于分离培养的细胞的细胞培养用或组织工程用支架。

背景技术：

最近，随着用于疾病治疗的培养细胞的利用扩大，对细胞培养的关注及研究正在增加。细胞培养是一项从生物体中取出细胞并将其在体外培养的技术，将培养的细胞分化成诸如皮肤、脏器、神经等多种身体组织来移植到人体，或者将其以分化之前的状态移植到人体，同时进行生着及分化，从而可用于多种疾病治疗。

有关这种细胞培养的领域为组织工程(tissueengineering)，是一门应用诸如细胞学、生命科学、工程学、医学等现有的科学领域的多学科科学，正在研究用于了解活体组织的结构和功能之间的相关性，用正常的组织代替、再生已损伤的组织或脏器的新融合技术。

在常规的细胞培养领域或利用其的组织工程领域中持续备受关注，研究或开发的课题之一是培养和分化细胞，并在具有细胞的状态下能够移植到人体的支架的有关材料、结构等的研究。即，为了观察特定物质对人体的影响，当通过培养或分化成与实际人体的细胞结构类似的三维结构的细胞群集来进行利用培养的细胞的对于特定物质的毒性反应实验时，可能适合作为更类似于实际的体外细胞毒性试验模型。并且，为了向人体组织移植培养的细胞，当移植培养或分化成与人体的实际组织类似的三维结构的细胞集合体或组织时，移植的细胞或组织可以充分发挥其功能和作用。

但是，迄今为止开发的细胞培养用支架中存在如下问题，即，细胞没有培养成类似于体内的结构，细胞的存活率不高，因此，由此培养的细胞不适合用作体外实验模型或移植用细胞。

由此继续开发一种可提供类似于体内的培养环境，每个细胞适当确保细胞培养中所需的空间，同时阻止在支架中培养细胞的过程中发生脱离的细胞，且细胞的存活率高及使细胞能够立体生长的支架。

技术实现要素：

技术问题

本发明是考虑到如上所述的问题而提出的，其目的在于，提供通过实现适合培养的细胞的迁移、增殖、分化的微环境来提高细胞增殖率及存活率的细胞培养用或组织工程用支架。

并且，本发明的再一目的在于，提供可以容易地去除支架而对培养于支架的细胞没有物理或化学刺激，从而易于回收培养的细胞的细胞培养用或组织工程用支架。

并且，本发明的另一目的在于，提供以具有培养的细胞的状态下能够移植到体内，从而实现更适合于细胞培养及组织工程的用途的支架。

并且，本发明的还有一目的在于，提供将培养的细胞的形状及结构培养成类似于实际动物体的细胞的形状及结构，以便更适合适用于体外实验模型或动物体内移植的支架。

并且，本发明的又一目的在于，提供将根据本发明的支架实现为使用于生物反应器、细胞培养容器、体内移植用试剂盒等细胞培养领域或组织工程领域中的各种产品。

解决问题的方案

为了解决如上所述的技术问题，本发明提供包括三维网状结构的纤维网，上述纤维网包含支撑纤维而形成。

根据本发明实施例，上述纤维网的平均孔径可以为0.05～10μm，气孔度可以为40～90％。

并且，上述支撑纤维的平均直径可以为100nm～3μm。

并且，上述纤维网的厚度可以为1～20μm，基重可以为1～30g/m²。

并且，上述纤维网可以包括多个支撑纤维，且可以满足下述条件(1)和条件(2)：(1)多个支撑纤维的直径分布中多个支撑纤维的直径分散系数(e)为8～25％，(2)纤维网的空气渗透度为1～40cfm。

并且，上述多个支撑纤维的直径分布中作为下述条件(3)，根据下述数学式1的值可以为1.5～6.8。

并且，上述多个支撑纤维的直径分布中作为下述条件(4)，根据下述数学式2的值可以为1.0～5.5。

并且，上述支撑纤维可包含选自由聚己内酯(polycaprolactone，pcl)、聚对二氧环己酮(polydioxanone，pdo)、左旋聚丙交酯(poly(l-lactide)、plla)、聚(外消旋-乳酸-羟基乙酸)共聚物(poly(dl-lactide-co-glycolide)，plga)、聚环氧乙烷(polyethyleneoxide，peo)、聚乳酸(polylacticacid，pla)及聚乙烯醇(polyvinylalcohol，pva)组成的组中的一种以上的生物降解性成分作为纤维形成成分。

并且，上述支撑纤维可包含选自由聚苯乙烯(polystyrene)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethyleneterephthalate，pet)、聚醚砜(polyethersulfone，pes)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，pvdf)、聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚酰胺、聚乙烯及聚环氧乙烷-聚环氧丙烷嵌段共聚物组成的组中的一种以上的非生物降解性成分作为纤维形成成分。

并且，本发明提供包括根据本发明的支架及内部具有上述支架的外壳的生物反应器(bioreactor)。

并且，本发明提供包括根据本发明的支架的细胞培养容器。

并且，本发明提供包括根据本发明的支架及培养在包括上述支架的纤维网外部及内部的空间的细胞集合体的体内移植用试剂盒。

根据iupac-iub命名法将使用于本发明的氨基酸序列缩写成如下述表1所示。

表1

以下，对本发明中使用的术语进行说明。

本发明的“细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)”是指作为包围细胞的外部的基质，占据细胞与细胞之间，主要具有由蛋白质和多糖组成的网状结构。

本发明的“模体”是包含氨基酸序列的肽，上述肽包含在对细胞的附着、迁移、分化等起到关键作用的细胞外基质内蛋白质、糖蛋白等，并与以贯通细胞膜的表面或膜的方式具有的受体可在结构上或功能上相互作用，包括所有从细胞中分离或者采用基因克隆(genecloning)技术人工生产的。

本发明的“三维细胞群集”(3dimensioncellcluster)是指细胞以三维聚集的形状，是指通过诸如钙黏着蛋白(cadherin)及联接蛋白(connexin)等缝隙连接(gapjunction)蛋白质的表达来起到细胞-细胞相互作用的类似于生物组织的人工组成的细胞群集。与二维培养细胞相比，三维细胞群集包括多层的细胞，二维培养细胞为单层细胞，三维细胞群集的每单位面积的细胞数量多于二维培养细胞。

发明的效果

根据本发明，在支架实现适合于所培养的细胞的迁移、增殖、分化的微环境，从而可提高细胞增值率及存活率。并且，可以容易地去除支架而对支架培养的细胞没有物理或化学刺激，从而易于回收培养的细胞，且能够以具有培养的细胞的状态下进行体内移植。

进一步地，可以将培养的细胞的形状及结构培养成类似于实际动物体细胞的形状及结构，以便更适合适用于体外(invitro)实验模型或动物体内移植。

与此同时，将根据本发明一实施例的支架改性成有助于细胞培养或分化的物质，从而可进一步提高细胞增殖及存活，且能够容易地实现所培养的细胞呈立体形状。由此非常适合作为细胞培养领域及组织工程领域的用途，可广泛应用于本领域的各种产品。

附图说明

图1为包括在根据本发明一实施例的支架的纤维网的剖面图及部分放大图。

图2为对于包括在本发明一实施例的支撑纤维的长轴方向的部分放大剖视图，图2a至图2d为包括在支撑纤维的内部或外部的粘结性生理活性成分和/或非粘结性生理活性成分的布置的多种实施例的图。

图3为示出包括在本发明一实施例的支撑纤维及其表面的粘结性生理活性成分及非粘结性生理活性成分，图3a为示出在将粘结性生理活性成分置于支撑纤维的一部分表面后，将非粘结性生理活性成分固定到上述粘结性生理活性成分的情况的部分立体图，图3b为示出在支撑纤维表面上涂布粘结性生理活性成分，在涂布的粘结性生理活性成分上涂布非粘结性生理活性成分的情况的剖面图。

图4为按直径的支撑纤维累积数量示出包括在本发明一实施例的多个支撑纤维的纤径分布的曲线图。

图5至图7为包括在本发明的一实施例的纤维网的扫描电子显微镜(sem)照片。

图8及图9为示出在根据本发明一实施例的细胞培养用支架上培养一天的成纤维细胞扫描电子显微镜照片。

具体实施方式

最佳实施方式

以下，参照附图，对本发明的实施例进行详细说明，以使本发明所属技术领域的普通技术人员能够容易实施。本发明可由多种不同形态实现，并不限定于在此说明的实施例。为了明确说明本发明，在附图中省略了与说明无关的部分，在整个说明书中，对于相同或类似的结构要素标记相同附图标记。

并且，附图中图示的一结构形状并不限定于附图中图示的形状。作为一例，作为如图2a所示的出生理活性成分，将用线来示出粘结性生理活性成分111b1、111b2的形状，但是，这是为了便于说明位于纤维外部或内部的粘结性生理活性成分的位置关系等，可能与实际粘结性生理活性成分的形状不同。并且，用线来表示粘结性生理活性成分的形状，从而如图2a所示，粘结性生理活性成分111b1与支撑纤维111的外部面隔开，但本发明并不限定于此，应理解为，本发明包括粘结性生理活性成分111b1不与支撑纤维111的外部面隔开，而部分涂布在外部面的情况。

如图1所示，根据本发明一实施例的支架具有包含支撑纤维111而形成的纤维网100。上述纤维网100可以利用至少一条支撑纤维来形成三维网状结构。具体地，由包含一条支撑纤维来形成的纤维网可通过多次折叠和排列或层叠一条支撑纤维来不定向形成三维网状结构。

或者，上述纤维网100包括多个支撑纤维，以使各个支撑纤维可通过独立地折叠和/或在没有定纤维长度方向的情况下各个通过排列或层叠来形成三维网状结构。此时，一条支撑纤维内的在互不相同的表面之间和/或互不相同的支撑纤维的表面之间可发生粘结或融合，由此，三维网状结构在结构上变得更加复杂，载入支架的细胞可在形成为三维网状结构的气孔内部迁移或增值，且有利于将细胞培养成具有立体形状或结构的细胞群集。

并且，为了增加在支架内部或外部培养的细胞的增值率及存活率，提供细胞的增殖所需的营养是很重要的，三维网状结构的纤维网通过形成非常复活、多样的含有养分的培养溶液的流路，来向位于支架内部的细胞易于提供养分，从而防止细胞凋亡且可提高细胞增殖。

优选地，上述纤维网100的平均孔径为细胞能够在纤维网内部的气孔中迁移、增殖的空间，直径可取决于所培养的细胞的具体种类，因此本发明对此并没有特别的限制。但是，优选地，上述平均孔径可以为0.05～50μm，更优选地，可以为0.05～10μm。若平均孔径小于0.05μm的情况下，则所培养的细胞在增殖过程中，可通过纤维网的外部面平面迁移及增殖，而不是从纤维网的内部空间迁移，因此，不能培养所需水平的具有立体形状的细胞群集。并且，即使细胞向纤维网的内部空间迁移，但是，由于培养溶液不能顺利地通过纤维网，因此，向内部空间迁移的细胞可能凋亡或增殖下降。并且，若平均孔径大于50μm的情况下，即使向纤维网的内部空间的细胞的迁移及培养溶液的渗透性优秀，但是所培养的细胞能够与通过纤维网的培养溶液一起脱离纤维网，与其一起脱离的培养细胞的增加难以培养成具有所需立体形状的细胞群集。

并且，上述纤维网100的气孔度可以为40～90％，更加易于形成通过由此向纤维网内部迁移及增殖的细胞的立体形状的细胞群集，具有能够将培养溶液装入纤维网内部气孔或者提高培养溶液的渗透性的优点。若气孔度小于40％的情况下，难以形成立体形状的细胞群集，且有可能导致向纤维网内部迁移及增殖的细胞的凋亡。并且，若气孔度大于90％的情况下，支架的机械强度变弱，细胞培养中的支架可能崩塌。

并且，上述纤维网100的平均厚度可以为1～100μm，优选地为1～50μm，更优选地可以为1～20μm。并且，上述纤维网100的基重可以为0.1～30g/m²。若纤维网的厚度小于1μm和/或基重大于30g/m²的情况下，纤维网内部空间变窄或整体体积减少，因此可能难以培养具有立体形状的细胞群集和/或可通过支架来获得的细胞群集的量少。并且，若纤维网的厚度小于1μm和/或基重小于0.1g/m²的情况下，可能支架的机械强度下降。并且，若纤维网的厚度大于100μm的情况下，培养溶液向纤维网厚度方向的移动性下降，由此在纤维网内部培养的细胞的增殖下降，且可存在凋亡的隐患。

并且，形成所述的纤维网100的支撑纤维111为纤维形成成分，只要是可实现纤维形状的公知的高分子化合物，就不受限制地使用，作为一例，包含生物降解性成分或非生物降解性成分。在用生物降解性成分作为支架的材质的情况下，无需单独分离在支架上培养或增殖或分化的细胞，可将支架和细胞同时移植体内，移植的支架能够有助于使移植后培养细胞能够更加稳定地生着在体内，经一段时间后，可在体内自然分解，由于不需要将支架移植后进行去除的额外的手术或治疗，因此可大大提高治疗便利性。并且，生物降解性成分的材质由于其亲水性对水的分解性高，在利用这一点分离回收通过融化支架培养的细胞的工序中，可用于融化支架的溶液的水对细胞几乎没有刺激，因此具有对培养的细胞几乎没有物理化学损伤的优点。

并且，在用非生物降解性成分作为支架的材质的情况下，相对于生物降解性支撑纤维，机械强度更优秀，因此能够稳定地培养细胞。并且，可通过细胞培养过程中施加的与支架相接触的培养溶液等来防止支架的机械强度变弱，因此能够更稳定地培养细胞。与此同时，相对于非生物降解性成分，生物降解性成分很难通过电纺丝等来形成具有所需结构的纤维网，因此在取出及稳定的纺丝性方面，非生物降解性成分更有利，因此能够更容易地制备实现所需孔径、气孔度等的纤维网。

在上述支撑纤维111包含生物降解性纤维形成成分的情况下，通常，只要是具有生物降解性特性并最小化细胞毒性的公知为生物适合性成分的化合物，就不受限制地使用。并且，根据本发明一实施例，上述支撑纤维具有纳米大小的直径，为此，上述支撑纤维可通过电纺丝来制备，在此情况下，优选地生物降解性纤维形成成分使用还具有适合于电纺丝的特性的化合物。作为对此的一例，生物降解性纤维形成成分可包含选自由聚己内酯、聚对二氧环己酮、左旋聚丙交酯、聚(外消旋-乳酸-羟基乙酸)共聚物、聚环氧乙烷、聚乳酸及聚乙烯醇组成的组中的一种以上，但并不限定于此。

并且，在上述支撑纤维111包含非生物降解性纤维形成成分的情况下，通常，只要是具有非生物降解性特性并最小化细胞毒性的公知为生物适合性成分的化合物，就不受限制地使用。并且，根据本发明的一实施例，上述非生物降解性支撑纤维应具有纳米大小的直径，为此，上述支撑纤维可通过电纺丝来制备，在此情况下，优选地，上述非生物降解性纤维形成成分使用还具有适合于电纺丝的特性的化合物。作为对此的一例，非生物降解性纤维形成成分可包含选自由聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、聚二甲基硅氧烷、聚酰胺、聚乙烯及聚环氧乙烷-聚环氧丙烷嵌段共聚物组成的组中的一种以上作为纤维形成成分，但并不限定于此。

并且，上述支撑纤维的直径可取决于实现考虑到根据所需培养细胞种类的细胞大小的孔径、气孔度、基重等，因此本发明对此没有特别限制。作为一例，上述支撑纤维的平均直径可以为10nm～100μm，优选地可以为100nm～50μm，更优选地为100nm～10μm，更加优选地可以为100nm～3μm。若支撑纤维的平均直径小于10nm的情况下，纤维网的机械强度可能显著下降，在平均直径大于100μm的情况下，可能难以制备具有所需水平的气孔度、支撑纤维的表面积的纤维网。

另一方面，为了立体培养细胞，细胞不仅在支架的表面，而且渗透及培养在支架的内部空间，最终渗透及培养在内部空间的细胞和在表面上培养的细胞之间相接触，从而可形成三维的细胞群集。但是，即使在表面培养的细胞，可通过细胞培养用(或组织工程用)支架的表面形态学来诱导细胞的立体培养。作为一例，细胞培养用支架表面的形态学不平坦，表面粗糙度可能会很大，以使变得凹凸不平。细胞支架的表面形状为凹凸不平是指，例如，包括多个凹部和/或凸部，除了细胞的立体生长效果之外，细胞能够更容易且牢固放置在凸部之间的空间或凹部的槽中，因此具有能够显著减少从细胞支架脱离的细胞的数量。

为了实现如上所述的具有用于提高细胞的立体生长及播种的细胞的放置性的形态学的表面的细胞培养用支架，根据本发明优选的一实施例，上述纤维网包含多个生物降解性支撑纤维，可满足下述条件(1)和条件(2)。

首先，作为条件(1)，多个支撑纤维的直径分散系数(e)可以为8～25％。当上述直径分散系数(e)在以多个支撑纤维的直径为基准的分布图中规定的平均直径时，相对于上述平均直径，能够判断多个支撑纤维分布多近或多远的参数，可利用下述数学式3来计算。

数学式3：

根据上述数学式3的直径分散系数(％)为0％是指标准偏差为0，是指包含在纤维网的多个支撑纤维的直径均与平均直径一致。因此，于此相反，直径分散系数越大，是指包含在纤维网的多个支撑纤维中，具有比平均直径更大的直径和/或更小的直径的支撑纤维的数量增加。

在根据本发明的一实施例的支架中，在规定的平均直径下根据条件(1)的多个生物降解性支撑纤维的直径的分散系数满足8～25％，因此如上所述，可能更容易实现具有凹凸不平的表面形态学的细胞培养用支架，如布置多个凹部和/或凸部。但是，在分散系数过大的情况下，相对于厚度，基重的增加可能很大，由此平均孔径和空气渗透可能大大减少，细胞培养液难以流入支架的内部或者难以进行交换，从而可能在支架内部难以培养细胞，因此细胞培养效率可能减少。若对于直径的分散系数小于8％的情况下，支架直径的均匀性增加，因此有利于表达平滑的表面形态学，孔径的均匀性也增加，但是不能培养所需水平的立体细胞群集，例如播种的细胞没有立体生长，而是沿着表面二维培养或支撑纤维的平均直径大时，形成平均孔径大的气孔结构，存在播种的细胞脱离的隐患等。并且，若对于直径的分散系数大于25％的情况下，在平均直径较小的支架中，对支架直径的不均匀性增加，因此支架的平均孔径非常小，由此可能很难进行细胞培养液的支架内部流入或交换，且细胞有可能沿着表面培养，而不是三维培养。

接着，作为条件(2)，纤维网的空气渗透度可以为1～40cfm。在细胞培养用支架中立体生长细胞的重要要素之一为能否持续不断地提供细胞培养所需的物质。若细胞在细胞培养用支架表面立体生长时，在放置在与支架相邻的多个细胞或者渗入细胞培养用支架内部并放置培养的细胞的情况下，相对于位于细胞群集的暴露的部分的细胞或者位于细胞培养用支架表面上的细胞，可能很难与细胞培养液顺利进行接触。并且，所述的支撑纤维的材质为生物降解性成分的情况下，生物降解性成分可与水分等持续相接触而被分解。但是，在水分等很难向支架内部移动的情况下，生物降解性成分的分解被延迟，可能难以从支架分离由此培养的三维形状的细胞群集。

因此，为了防止此，上述纤维网的空气渗透度可以为1～40cfm。若空气渗透度小于1.0cfm的情况下，细胞可能难以渗入支架内部，细胞培养液或能够溶解生物降解性成分的成分也可能不顺顺利地通过。并且，若空气渗透度大于40cfm的情况下，可实现纤维网的机械强度显著低或者支撑纤维的细度的直径和厚度显著大的纤维网，从而支架的重量变大，可能难以适用于有限的小体积的培养器中，由于播种的细胞发生脱离，可能难以培养所需量。

并且，更优选地，上述纤维网100还可满足条件(3)和/或条件(4)。

首先，作为根据本发明的条件(3)，多个生物降解性支撑纤维的直径分布中根据下述数学式1的值可以为1.5～6.8，由此播种于纤维网100的细胞可能更容易渗透到纤维网的内部空间，更加容易实现由所述的支架表面形态学不平坦的表面形成的纤维网，从而更加适合于立体细胞群集的培养。

在上述数学式1中，第a四分位数是指按直径大小排列包含在纤维网的多个生物降解性支撑纤维后，将相当于总度数的总生物降解性支撑纤维数量4等分的第a/4个支撑纤维的直径，第一四分位数是指与直径分布图中总支撑纤维数量的第1/4相对应的支撑纤维的直径，第三四分位数是指与直径分布图中总支撑纤维数量的第3/4相对应的支撑纤维的直径。作为一例，当支撑纤维数为15时，第一四分位数的位置是指直径第四大的支撑纤维，第一四分位数是指此时的支撑纤维的直径。另一方面，当支撑纤维的总数量为偶数，作为一例，20个时，第一四分位数位置为对应于第五支撑纤维与第六支撑纤维之间的位置，第一四分位数由第五支撑纤维和第六支撑纤维的平均计算。

对于包含在纤维网的多个支撑纤维的第一四分位数、第三四分位数及最大直径值的根据数学式1的值满足1.5～6.8，播种的细胞渗入支架表面与支架内部，因此能够易于实现不平坦的支架表面形态学，由此能够适合于立体细胞群集的培养。若根据数学式1的值小于1.5的情况下，可能难以培养所需的三维细胞群集，例如，存在播种的细胞在细胞培养用支架表面上二维培养的隐患。并且，若根据数学式1的值大于6.8的情况下，支撑纤维的直径分布非常广泛，由此可能难以实现所需规定孔径的支架，由于支架中可能存在巨大气孔，可能难以培养所需的三维细胞群集，例如，存在播种的细胞容易从支架向外部脱离的隐患。其中，上述巨大气孔是指具有相对于播种的细胞的直径大10倍的直径的气孔。

并且，作为根据本发明的条件(4)，在多个支撑纤维的直径分布中，根据下述数学式2的值可以为1.0～5.5，由此播种于纤维网100的细胞能够更容易渗入纤维网的内部空间，可以更容易地实现由所述的支架表面形态学不平坦的表面形成的纤维网，从而更加适合于立体细胞群集的培养。

若根据数学式2的值小于1.0的情况下，有可能实现表面形态学平坦的纤维网，因此可能难以培养目的的三维细胞群集，例如，存在播种的细胞在细胞培养用支架表面上二维培养的隐患。并且，若根据数学式2的值大于5.5的情况下，支撑纤维中直径最小的支撑纤维与对应于第一四分位数位置的支撑纤维之间的直径范围变广，因此直径小的支撑纤维的比率可能变高，由此孔径小的气孔比率变高，因而可能难以培养目的的三维细胞群集，例如，播种的细胞难以渗入细胞培养用支架内部并培养播种的细胞。

并且，在以同时满足所述的条件(3)和条件(4)的方式实现细胞培养用支架的情况下，具有如下优点，即，可向细胞的纤维网内部迁移、增殖，由于表面形态学的非平坦化，在细胞表面和内部同时立体培养细胞的同时，培养溶液的渗透性增加，促进在内部增殖的多个细胞的培养并可防止细胞凋亡。

另一方面，所述的纤维网100还可包含固定于支撑纤维表面的至少一部分的生理活性成分。此时，至少一部分生物降解性支撑纤维是指包括一条支撑纤维中的一部分和/或多条支撑纤维中的一部分。

最近研究的细胞培养技术为正在向在体外实现实际体内的细胞之间环境的方向进行研究，为了使细胞培养环境与体内的细胞环境类似，将体内细胞外基质(ecm)中的各种成分在体外培养时，处于将上述各种成分包含在培养溶液来适用的趋势。但是，在培养溶液中加入能够促进细胞培养的物质的情况下，在培养的细胞中持续暴露上述物质是有限的，为了持续暴露，应增加培养溶液中的上述物质的含量，但是这在费用的增加、增殖效率方面存在问题。因此，在根据本发明一实施例中包含的纤维网的支撑纤维的表面上，以固定生理活性成分的状态下提供于支架，在位于由支撑纤维状或支撑纤维包围的空间内的培养细胞中，持续并扩增通过生理活性成分的附着稳定化、细胞刺激及由此的细胞内信号传递，具有能够进一步对细胞增殖进行加速化的优点。

上述生理活性成分可以为诱导细胞的附着、迁移、生长、增殖及分化中的一种以上的成分。

首先，作为提高生理活性成分中细胞的附着的成分的粘结性生理活性成分具有如下功能，即，通过在初期将培养细胞固定于细胞支架上来防止载入培养溶液的细胞悬浮的功能，和/或将参与细胞的迁移、生长、增殖及分化等的非粘结性生理活性成分固定于支撑纤维上，以防止非粘结性生理活性成分在支撑纤维上培养细胞的过程中从支撑纤维脱离的功能。作为上述粘结性生理活性成分，只要是具有常规的生物适合性且不引起细胞毒性的公知的粘结性生理活性成分，就不受限制地使用，优选地，可包含选自由序列1至序列7的氨基酸序列重复1次至20次形成的蛋白质及由这些蛋白质中至少两个融合而成的蛋白质组成的组中的一种以上，由此细胞毒性显著下降，对非粘结性生理活性成分的粘结力优秀，同时细胞培养中粘结性生理活性成分溶解于培养溶液，因此具有可防止固定的非粘结性生理活性成分的脱离或者细胞的单离的优点。

另一方面，在上述粘结性生理活性成分中，如图2a所示，由第一纤维形成成分111a形成的第一支撑纤维111的表面可固定有一粘结性生理活性成分111b1，此时，上述一粘结性生理活性成分111b1中的一部分位于支撑纤维内部，剩余部分位于纤维外部，从而固定于支撑纤维表面。或者，如图3a所示，第五支撑纤维115的内部中没有粘结性生理活性成分，外部面一区域中可固定有粘结性生理活性成分115b。或者，如图3b所示，还可涂布所有第六支撑纤维116的外部面。

其次，在可设于纤维网的生理活性成分中，作为直接或间接诱导细胞的迁移、生长、增殖及分化中的一种以上，以使能够促进细胞培养的非粘结性生理活性成分，只要是用于表达这种功能的公知的物质，就不受限制地使用。作为一例，上述生理活性成分可包含选自由单胺、氨基酸、肽、糖类、脂质、蛋白质、糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、黏多糖及核酸组成的组中的一种以上的化合物及细胞中的一种以上。此时，作为一例，单胺包含含有诸如儿茶酚胺、吲哚胺等伯胺的化合物。并且，上述肽包含寡肽，上述蛋白质包含多肽，作为一例，可以为纤维连接蛋白等。上述糖类可包含单糖类、多糖类、低聚糖及碳水化合物。并且，作为一例，上述脂质可以为类固醇激素。

另一方面，上述生理活性成分可包含模体。上述模体可以为包含规定的氨基酸序列的天然肽或重组肽，上述氨基酸序列包含在选自生长因子(growthfactor)或细胞外基质(extracellularmatrix)中所包含的蛋白质、糖蛋白及蛋白多糖中的一种以上。具体地，上述模体可包含选自由肾上腺髓质素(adrenomedullin)、促血管新生蛋白因子(angiopoietin)、骨成型蛋白质(bmp)、脑源性神经营养因子(bdnf)、表皮生长因子(egf)、红细胞生成素(erythropoietin)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor)、神经胶质源神经营养因子(gdnf)、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor，g-csf)、粒巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolony-stimulatingfactor，gm-csf)、生长分化因子-9(growthdifferentiationfactor-9，gdf9)、肝细胞生长因子(hgf)、肝癌衍生生长因子(hepatoma-derivedgrowthfactor，hdgf)、胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf)、角质化细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor，kgf)、促移行因子(migration-stimulatingfactor，msf)、肌骨素(myostatin，gdf-8)、神经生长因子(nervegrowthfactor，ngf)、血小板源生长因子(platelet-derivedgrowthfactor，pdgf)、促血小板生成素(thrombopoietin，tpo)、t-细胞生长因子(t-cellgrowthfactor，tcgf)、神经菌毛素、转化生长因子-α(tgf-α)、转化生长因子-β(tgf-β)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、血管内皮生长因子(vegf)、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6及il-7组成的组中的一种以上的生长因子(gf)中包含的规定氨基酸序列。或者，可包含透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、藻酸盐、纤维蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白，弹性蛋白、纤维连接蛋白、比特连蛋白、钙黏着蛋白及层粘连蛋白组成的组中的一种以上的细胞外基质(extracellularmatrix)中包含的规定的氨基酸的序列。并且，上述模体还可包含所有癌生长因子的规定的氨基酸系列及上述细胞外基质中包含的规定的氨基酸序列。更优选地，上述模体可包含选自包含系列8至序列28的氨基酸序列而成的蛋白质及由至少两个这些蛋白质融合而成的蛋白质组成的组中的一种以上，但并不限定于此。

另一方面，还可将上述模体共价结合到所述的粘结成分来实现一体。作为一例，在上述粘结成分为蛋白质的情况下，可将上述模体直接共价结合在多肽的n-末端和/或c-末端，或者可介于异类的肽或多肽来共价结合，在此情况下，生理活性成分能够更牢固地附着在支撑纤维，并可最小化生理活性成分的细胞培养中的脱离。

如图2b所示，所述的生理活性成分可固定于支撑纤维表面，以使在由第二纤维形成成分112b形成的第二支撑纤维112的表面中，一部分生理活性成分112c位于支撑纤维内部，剩余部分位于纤维外部。并且，如图2c及2d所示，生理活性成分113c1、113c2、114c1可通过介入固定于由纤维形成成分113a、114a形成的支撑纤维113、114的表面的粘结性生理活性成分113b、114b1来固定于支撑纤维113、114。

并且，如图3a所示，在上述生理活性成分中，第五支撑纤维115的内部中没有粘结性生理活性成分或生理活性成分，可通过固定于外部面一区域的粘结性生理活性成分115b，生理活性成分115c1、115c2可固定于支撑纤维115外部面的一部分。或者，如图3b所示，还可具有生理活性成分116c，以使涂布所有涂布在整个第六支撑纤维116的外部面涂布的粘结性生理活性成分116b。

另一方面，如图2a至图2d所示，支撑纤维111、112、113、114内部还可包含粘结性生理活性成分111b2、112b2、114b2和/或非粘结性生理活性成分112c2。在纤维内部包含粘结性成分和/或非粘结性生理活性成分的支撑纤维可以为如后述的支撑纤维的一制备例，在用于制备成支撑纤维的纺丝溶液中以生物降解性纤维形成成分与粘结性生理活性成分和/或非粘结性生理活性成分混合在一起的状态下纺丝来制备成支撑纤维的情况。在从纺丝步骤开始包含粘结性生理活性成分的情况下，使粘结性生理活性成分111b1、112b1、113b1、114b1的一部分位于支撑纤维111、112、113、114内部，从而可最小化粘结性生理活性成分111b1、112b1、113b1、114b1从支撑纤维脱离。并且，从图2b中可以确认，在从纺丝步骤开始包含非粘结性生理活性成分的情况下，具有可将非粘结性生理活性成分112c1固定于支撑纤维112，而无需额外的粘结性生理活性成分的优点。

根据本发明一实施例的细胞培养用或组织工程用支架可包含单层的所述纤维网100或者可以为层叠有多个的层叠层。并且，在任何一面还可具有用于将支架附着于培养容器的粘结层等常规的细胞培养用/组织工程用支架中的功能层。

可通过后述的制备方法来制备包含所述的纤维网的支架。但是，本发明并不限定于后述的制备方法。

根据本发明一实施例的支架可通过如下步骤来制备，上述步骤包括：步骤(1)，制备包含纤维形成成分的纺丝溶液；以及步骤(2)，通过电纺丝上述纺丝溶液来制备累积支撑纤维而成的纤维网。

首先，在上述步骤(1)中的纺丝溶液可包含除了纤维形成成分之外的溶剂。

上述溶剂使用于常规的电纺丝溶液的制备，只要可溶解所述的生物降解性或非生物降解性纤维形成成分，就不受限制地使用。并且，在后述的步骤(2)为干式纺丝的情况下，优选地选择可容易气化的溶剂。具体地，上述溶剂根据所选择的生物降解性化合物的种类可选择不同种类的溶剂，因此，本发明对具体种类并没有特别限制。作为一例，上述溶剂可使用选自由碳酸二乙酯(diethylcarbonate，dec)、碳酸二甲酯(dimethylcarbonate，dmc)、碳酸甲乙酯(ethylmethylcarbonate，emc)、碳酸亚丙酯(propylenecarbonate，pc)、水、醋酸(aceticacid)、甲酸(formicacid)、二甲基甲酰胺(dmf)、氯仿(chloroform)、二氯甲烷(dichloromethane)、丙酮(acetone)、1，1，1，3，3，3-六氟代-2-丙醇(1，1，1，3，3，3-hexafluoro-2-propanol，hfip)及异丙醇(isopropylalchol)组成的组中的一种以上。

上述纺丝溶液可混合纤维形成成分及溶剂，以使粘度为50～3000cps。若纺丝溶液的粘度小于50cps，则由于纺丝溶液的流动性高，从纺丝装置的喷嘴喷射出液滴，因此难以制备纤维网，若纺丝溶液的粘度大于3000cps，则由于纺丝溶液的流动性低，因此纺丝性可能下降。

并且，上述纺丝溶液还可包含常规的细胞培养用支架或组织工程用支架这种的添加剂，作为一例，上述添加剂可以为亲水性提高成分，例如非离子表面活性剂。除此之外的上述添加剂根据目的可选择公知的添加剂，因此本发明省略对此的说明。

另一方面，以所述的纺丝溶液为溶解有溶剂和纤维形成成分的溶液为基准进行了说明，但本发明并不限定于此，表明可以为熔融有纤维形成成分的溶液。

然后，作为步骤(2)，执行通过电纺丝上述纺丝溶液来制备纤维网的步骤。

上述步骤(2)可通过不同的电纺丝装置来执行，上述电纺丝装置可包括连接储存纺丝溶液的溶液灌、高电压发生器的多个纺丝喷嘴以多个列或多个行排列而成的纺丝包。另一方面，纺丝包的下部具有收集器，可收集所聚集有纺丝的支撑纤维的纤维垫，上述收集器还位于传送带上以还可收集依次形成的规定厚度的连续的纤维垫。此时，上述收集器中负载外部凝固液，从而可以使纺丝的支撑纤维固化，或者在没有外部凝固液的情况下纺丝的支撑纤维通过空气或额外的冷风固化，从而可被收集到收集器。

收集的支撑纤维垫可经后续用于气化残留溶剂、外部凝固液等的干燥工序，由此可制备纤维网。

上述制备的纤维网还可在表面进行等离子处理、利用多巴胺等成分来涂敷支撑纤维的表面等，以提高亲水性。

并且，制备的纤维网还可进行以特定方向延伸的工序，以调节孔径大小、形成支撑纤维的生物降解性成分的定向。并且，上述纤维网为了满足三维网状结构的细化、所需厚度、基重，还可执行施加热和/或压力的工序，上述工序可以为常规的压延工序。并且，制备的纤维网的一面，作为一例，还可执行在纤维网的边缘形成额外的粘结层的步骤，以使纤维网固定、附着于培养容器等。

另一方面，如本发明的一实施例，还包含粘结性生理活性成分和/或非粘结性生理活性成分的纤维网可通过第一方法来制备，即，在所述的步骤(1)的纺丝溶液制备步骤中，纺丝溶液中混合粘结性生理活性成分和/或非粘结性生理活性成分并通过纺丝来制备纤维网，以使从一开始支撑纤维中具有粘结性生理活性成分和/或非粘结性生理活性成分。可通过上述第一方法来制备包含如图2a至图2c所示的改性的支撑纤维的纤维网。

并且，作为第二方法，在所述的步骤(1)的纺丝溶液制备步骤中，在纺丝溶液中混合粘结性生理活性成分并通过纺丝来制备纤维网，以使从一开始支撑纤维中具有粘结性生理活性成分后，在纤维网处理其他种类的生理活性成分，从而可将上述另一种类的生理活性成分粘结在固定于支撑纤维的粘结性生理活性成分。可通过上述第二方法来制备包含如图2d所示的改性的支撑纤维的纤维网。此时，将上述生理活性成分处理在纤维网的方法可以为常规的方法，作为一例，可通过浸渍、喷射、电镀等方法。

并且，作为第三方法，如图3a或图3b所示，在通过所述的步骤(1)及步骤(2)制备的纤维网的表面处理粘结性生理活性成分来制备纤维网，上述纤维网包含在支撑纤维115、116外部面的至少一部分或整个外部面涂布粘结性生理活性成分115b、116b后，在涂布的粘结性生理活性成分上涂布非粘结性生理活性成分115c1、115c2、116c来改性的支撑纤维。

以上，包含所述的纤维网的支架包括在内部具有上述支架的外壳来可实现为生物反应器。上述生物反应器还可包含包含影响细胞增殖或分化的各种营养因子的培养溶液，以使增殖和/或细胞。上述培养溶液可以为生物反应器中包含的常规的溶液，因此本发明对此并没有特别限制。

并且，上述生物反应器还可具有使上述培养溶液流入外壳内部的流入口及向外部排出的排出口。或者，上述生物反应器可以为不具有连接外壳外部与内部的流入口或排出口的密封型外壳。并且，上述生物反应器还可包括常规的生物反应器具有的其他部件，本发明对此没有特别的限制。

并且，根据本发明的一实施例的支架可设置于常规的培养容器来实现为细胞培养容器。上述支架可附着培养容器内表面或者悬浮于培养容器内的培养溶液上。

并且，根据本发明一实施例的支架可通过包含包含在上述支架的纤维网的外部面及内部空间的区域上培养的细胞集合体来实现为体内移植用试剂盒。优选地，上述体内移植用试剂盒实现为由生物降解性成分形成的支架，在此情况下，向体内移植后，支架在体内自然分解而无需额外的支架去除手术，因此具有更加容易体内移植的优点。上述体内移植用试剂盒还可包含使免疫排斥反应最小化或者能够有助于细胞的生着的其他药物。此时，上述细胞集合体可包含选自由全能干细胞、万能干细胞、多能干细胞、寡能干细胞及单干细胞组成的组中的一种以上的干细胞以及选自由造血干细胞、肝细胞、纤维细胞、上皮细胞、间皮细胞、内皮细胞、肌细胞、神经细胞、免疫细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、血细胞及皮肤细胞组成的组中的分化细胞中的一种以上。

下述表2为表示根据在本发明中说明的序列编号的氨基酸序列的序列目录的表。

表2

具体实施方式

以下，通过实施例进一步详细说明本发明。对于本技术领域的技术人员而言，这些实施例仅用于例示本发明，本发明的范围不应被解释为限定于这些实施例是显而易见的。

实施例1

首先，为了制备纺丝溶液，在80℃的温度下利用磁棒将12g的聚偏二氟乙烯(阿科玛(arkema)公司，kynar761)作为纤维形成成分溶解于以70：30的重量比混合二甲基乙酰胺和丙酮的88g的混合溶剂中6小时，来制备混合溶液。利用电纺丝装置电纺丝上述所制备的纺丝溶液，作为电纺丝条件，施加电压为25kv、集电体与纺丝口的距离为25cm、排出量为0.05ml/hole，在rh65％30℃的环境下，实施电纺丝，获得了作为宽度为5.5μm、重量为5g/m²的纤维网的如下述表3所示的细胞培养用支架。形成上述纤维网的支撑纤维的平均直径为693.9nm，支撑纤维直径的标准偏差为86.0nm，支撑纤维中直径最小的纤维的直径为350.0nm，第一四分位数(q1)为644.0nm，第三四分位数(q3)为739.0nm，支撑纤维中直径最大的纤维的直径为1294.0nm。

实施例2～12

除了通过调节纺丝溶液中聚偏二氟乙烯成分的浓度之外，其余以与实施例1相同的方式制备来获得了包含在如下述表3或表4制备的纤维网的支撑纤维的直径分布如表3或表4所示的纤维网的细胞培养用支架。

实验例1

对于在实施例中制备的纤维网，评价下述物性，如下述表3所示。

1.纤维网中支撑纤维的直径分布

利用通过纤径分布程序(amogreentech开发)的方法测定的支撑纤维的直径分布，计算平均、标准偏差、第一四分位数(q1)、第三四分位数(q3)及所述的数学式1、数学式2。并且，通过实施例1至实施例3中测定的支撑纤维的直径分布，在图4中通过曲线图表示按直径的支撑纤维的累积数量。

2.纤维网的空气渗透度

空气渗透度利用textest仪器(textestinstruments)设备，将纤维网以38cm²大小的实验面积切割后，放置设备中，以125pa的实验压力吹入空气，从而测定通过的空气量，空气渗透度的单位为cfm(ft³/ft²/分钟)。

3.拍摄纤维网的扫描电子显微镜照片

拍摄根据实施例1至实施例3的纤维网的扫描电子显微镜照片，如图5至图7所示。

实验例2

以相同大小切割在实施例中制备的纤维网后，固定于细胞培养用孔板。在具有纤维网的孔板载入5×10⁴细胞/cm²的间充质干细胞(mesenchymalstemcells，msc)后，相对于总培养基重量，向混合500ml的kbs-3基础培养基(basalmedium)(b1001)与2ml的ksb-3补充剂(ksb-3supplyments)(s2901)的培养基中投入10％的胎牛曲血清(fetalbovineserum，fbs)，在包含有总培养基体积的1/100的青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)来制备的培养基中，在37℃的温度下增殖4天。

然后，利用细胞计数试剂盒8(cck-8)对培养的间充质干细胞(msc)进行染色后，利用可见光光谱仪(uv-visspectrometer)测定了吸光度。此时，对照(control)使用了在细胞培养皿(cellculturedish)中以相同的培养条件二维培养的细胞。

在通过实施例测定的吸光度中，以实施例1的吸光度为100％为基准，在下述表3或表4中相对示出剩余实施例的吸光度。

可以评价为吸光度越高细胞放置于细胞培养用支架后培养越好。

实验例3

以与实验例1相同的方式进行，准备具有纤维网的孔板。向准备的孔板载入成纤维细胞(hs27)后，在10％的完全培养基中在37℃下增殖4天。此时，10％完全培养基中，以1：1.5的体积比混合达尔伯克改良伊格尔培养基与ham'sf12培养基后，加入7体积百分比的胎牛曲血清(fetalbovineserum)、65u/ml的青霉素及65μg/ml的链霉素来制备。

然后，对于培养的成纤维细胞(hs27)，利用细胞计数试剂盒8(cck-8)进行染色后，利用可见光光谱仪测定吸光度。此时，对照使用了在细胞培养皿中以相同的培养条件二维培养的细胞。通过实施例测定的吸光度中，以实施例1的吸光度100％为基准，在下述表3或表4中相对示出剩余实施例的吸光度。

并且，在根据实施例2的细胞培养用支架播种成纤维细胞后，对于第一天增殖的成纤维细胞拍摄扫描电子显微镜照片，如图8(×500倍)和图9(×8000倍)所示。

表3

表4

可从上述表3及表4确认，实施例2表明，相对于实施例1，对成纤维细胞的相对吸光度显著增加，这是因为通过由平均直径小的支撑纤维实现，因此支架表面平滑程度大于实施例1，由此相对于干细胞，预期实现更适合于成纤维细胞的培养环境。

并且，可确认，实施例3表明，相对于实施例1，对于干细胞的相对吸光度显著增加，相对于实施例1，实施例3由平均直径大纤维实现，从而支架表面的平滑程度小于实施例1，预期由此实现更适合于干细胞的培养环境。

另一方面，在实施例1、实施例4至实施例6中，在利用平均直径类似的支撑纤维实现的支架的情况下，可确认在对于直径的分散系数脱离根据本发明的优选范围的实施例6的情况下，作为细胞播种后培养结果，相对于实施例1、实施例4、实施例5，相对吸光度大大减少，尤其对于干细胞大大减少。

并且，有关根据本发明的数学式1，观察实施例3、实施例9至实施例12，在实施例9的情况下，可确认相对于实施例3、实施例10，成纤维细胞的相对吸光度减少，尤其对于干细胞的相对吸光度减少。并且，可以确认，实施例12也一样，相对于实施例3、实施例11，对于成纤维细胞及干细胞的相对吸光度减少。

以上，对本发明的一实施例进行了说明，但本发明的思想并不限定于在本说明书中提出的实施例，理解本发明的思想的本技术领域的技术人员在相同的思想范围内，可根据结构要素的附加、变更、删除、添加等来易于提出其他实施例，但这也应属于本发明的思想范围内。

序列表

<110>阿莫生命科学有限公司

<120>细胞培养用或组织工程用支架

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15

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15

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<400>27

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1510