单细胞转录物测序的制作方法
本申请要求2016年7月14日提交的美国临时专利申请第62/362,425号和2017年2月24日提交的美国临时专利申请第62/463,487号的权益和优先权，出于全部目的，这两个申请均通过引用以其整体并入本文。
关于在联邦政府资助的研究和开发下完成的发明权利的声明
不适用。
领域
本文公开的主题一般涉及单细胞的分析领域。特别地，本主题涉及用于进行单细胞转录物测序的方法和组合物。
背景
对来自单个真核细胞的mrna进行测序的能力提供了关于细胞异质性范围和细胞身份性质的新信息。可以例如通过显微操作、激光显微切割、荧光激活细胞分选和在微流体装置中分离单细胞。已经开发了用于从单细胞mrna制备测序文库的方法。两类主要方法是全转录物和末端加标签。在全转录物方法中，每个文库包含从转录物的全长获得的片段；在末端加标签方法中，每个文库包含来自转录物仅一端的片段。全转录物文库提供了更多信息，但末端加标签在工作流程和定量方面提供了优势。测序数据的初步加工通常类似于大量mrna测序中使用的加工。
在确定编码由特定细胞产生的t细胞受体(tcr)或免疫球蛋白的rna序列的背景下，测序的单细胞转录物特别令人感兴趣。例如，每个t淋巴细胞表达结合抗原的tcr。抗原结合是免疫应答级联中的关键事件。每个tcr是由分别由tra和trb基因编码的α-链和β-链组成的异二聚体。通过在tra和trb基因座处发生的体细胞v(d)j重组产生抗原识别的多样性。在单细胞分辨率下，确定tra和trb的适当部分的序列充当t细胞祖先的独特标识符，因为表达相同tcrαβ对的任何两个t细胞可能来自共同的t细胞克隆。因为免疫球蛋白基因与tcr基因类似地组织并且也通过体细胞v(d)j重组产生多样性，所以免疫球蛋白的rna序列同样可以用于鉴定b细胞的祖先。
概述
本文考虑的多种实施方案可以包括，但不必限于以下实施方案中的一个或更多个：
实施方案1：一种制备用于来自细胞群体的rna的单细胞转录物测序的dna模板的方法，该方法包括：将来自该群体的细胞分配到单独的反应体积中，使得多个单独的反应体积各自包含单细胞，其中所述细胞在分配之前已经用固定剂处理，其中所述固定剂包括细胞透化固定剂，所述细胞透化固定剂使得能够以比不存在所述细胞透化固定剂时更高的效率从来源于单细胞的转录物产生dna模板；透化或破坏每个单独的反应体积中的每个细胞；从每个单独的反应体积中的rna逆转录cdna；并扩增cdna以产生dna模板，其中扩增掺入促进dna模板的dna测序的一种或更多种核苷酸序列。
实施方案2：实施方案1的方法，其中所述固定剂稳定细胞核和/或稳定rna。
实施方案3：实施方案1的方法，其中该方法包括用固定剂预先处理细胞。
实施方案4：实施方案1或3的方法，其中所述固定剂包括生物标志物和组织学防腐剂(bhp)。
实施方案5：实施方案1或3的方法，其中所述固定剂包括二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(dsp)。
实施方案6：实施方案1-5中任一项的方法，其中以dna模板的一个或更多个池从单独的反应体积中回收dna模板。
实施方案7：实施方案1-6中任一项的方法，其中在回收后进一步扩增dna模板。
实施方案8：实施方案1-7中任一项的方法，其中该方法另外包括使dna模板经受dna测序。
实施方案9：实施方案1-8中任一项的方法，其中该方法包括制备用于来自群体的t细胞受体或免疫球蛋白的rna的单细胞转录物测序的dna模板，其中：所述细胞包含t细胞或b细胞；并且dna模板分别由t细胞受体或免疫球蛋白的rna产生。
实施例10：实施方案9的方法，其中所述细胞是t细胞。
实施方案11：实施方案9的方法，其中所述细胞是b细胞。
实施方案12：实施方案10或11的方法，其中所述细胞是激活的。
实施方案13：实施方案1-9中任一项的方法，其中所述单独的反应体积包含微流体装置中的单独的捕获位点。
实施方案14：实施方案13的方法，包括向每个捕获位点提供逆转录试剂，其中逆转录试剂包含：第一逆转录(rt)引物，所述第一逆转录(rt)引物具有对编码t细胞受体或免疫球蛋白的第一链的rna的恒定区段(cs)特异性的部分，该t细胞受体或免疫球蛋白还包括第二链；第二逆转录(rt)引物，所述第二逆转录(rt)引物具有分别对编码t细胞受体或免疫球蛋白的第二链的rna的恒定区段(cs)特异性的部分；其中第一和第二rt引物各自另外包含第一核苷酸标签，所述第一核苷酸标签包括用于第一dna测序引物的第一引物结合位点，第一核苷酸标签在cs特异性部分的5'；和第一条形码引物，所述第一条形码引物自3'至5'包括对第一引物结合位点特异性的部分、第一条形码核苷酸序列和第一测序衔接子。
实施方案15：实施方案14的方法，其中第一条形码引物另外包含形成茎-双链体的核苷酸序列，由此第一条形码引物在逆转录期间具有发夹构型，且在扩增期间具有线性构型。
实施方案16：实施方案15的方法，其中在透化或破坏每个单独的反应体积中的每个细胞之前，将第一条形码引物提供给每个捕获位点。
实施方案17：实施方案15或16的方法，其中所述逆转录试剂另外包含第二条形码引物，所述第二条形码引物自3'至5'包含对第二dna测序引物的第二引物结合位点特异性的部分、第二条形码核苷酸序列和第二测序衔接子。
实施方案18：实施方案17的方法，其中向每个捕获位点提供第二条形码引物以及透化或破坏每个单独反应体积中的每个细胞的一种或更多种试剂。
实施方案19：实施方案17或18的方法，其中第二条形码引物另外包含形成茎-双链体的核苷酸序列，由此第二条形码引物在逆转录期间具有发夹构型并且在扩增期间具有线性构型。
实施例20：实施方案15-19中任一项的方法，包括向每个捕获位点提供扩增试剂，其中扩增试剂与逆转录试剂分开提供，并且扩增试剂包含：多个第一扩增引物，每个第一扩增引物具有对编码t细胞受体或免疫球蛋白的第一链的rna的不同可变区段(vs)特异性的部分；多个第二扩增引物，每个第二扩增引物具有对编码t细胞受体或免疫球蛋白的第二链的rna的不同可变区段(vs)特异性的部分；其中第一和第二扩增引物各自另外包含第二核苷酸标签，所述第二核苷酸标签包括第二引物结合位点，该第二核苷酸标签在vs特异性部分的5'；其中第一和第二扩增引物各自包含形成茎-双链体的核苷酸序列，并且其中第一和第二扩增引物各自在扩增期间具有线性构型。
实施方案21：实施方案1-20中任一项的方法，其中所述扩增cdna以产生dna模板包括聚合酶链式反应(pcr)，所述聚合酶链式反应(pcr)包括变性、退火和延伸的多个循环，其中pcr包括降低反应温度以便在两个或更多个pcr循环后使反应体积再水化。
实施方案22：实施方案21的方法，其中第一和第二扩增引物中的每一个在再水化期间具有发夹构型，并且在变性、退火和延伸期间具有线性构型。
实施方案23：实施方案14-22中任一项的方法，其中所述逆转录试剂另外包含第三逆转录(rt)引物，所述第三逆转录(rt)引物具有寡-dt序列和包含所述第一引物结合位点的第三核苷酸标签，所述第三核苷酸标签在寡-dt序列的5'。
实施方案24：实施方案23的方法，其中第三rt引物另外包含寡-dt序列和第一引物结合位点之间的独特分子标识符(umi)。
实施方案25：实施方案20-24中任一项的方法，其中扩增试剂包含第三扩增引物，所述第三扩增引物包含对特定靶rna特异性的部分和包含第二引物结合位点的第二核苷酸标签，第二核苷酸标签在靶特异性部分的5'，其中第三扩增引物包括形成茎-双链体的核苷酸序列，其中第三扩增引物在扩增期间具有线性构型。
实施方案26：实施方案14的方法，包括向每个捕获位点提供扩增试剂，其中扩增试剂与逆转录试剂分开提供，并且扩增试剂包含：多个第一扩增引物，每个第一扩增引物具有对编码t细胞受体或免疫球蛋白的第一链的rna的不同可变区段(vs)特异性的部分；多个第二扩增引物，每个第二扩增引物具有分别对编码t细胞受体或免疫球蛋白的第二链的rna的不同可变区段(vs)特异性的部分；其中第一和第二扩增引物各自另外包含第二核苷酸标签，所述第二核苷酸标签包括用于第二dna测序引物的第二引物结合位点，第二核苷酸标签在vs特异性部分的5'；和第二条形码引物，所述第二条形码引物自3’至5’包括对第二引物结合位点特异性的部分、第二条形码核苷酸序列和第二测序衔接子。
实施方案27：实施方案26的方法，其中逆转录试剂另外包含第三逆转录(rt)引物，所述第三逆转录(rt)引物具有寡-dt序列和包含第一引物结合位点的第三核苷酸标签，第三核苷酸标签在寡-dt序列的5'。
实施方案28：实施方案27的方法，其中第三rt引物另外包含寡-dt序列和第一引物结合位点之间的独特分子标识符(umi)。
实施方案29：实施方案26-28中任一项的方法，其中扩增试剂包含第三扩增引物，所述第三扩增引物包含对特定靶rna特异性的部分和包括第二引物结合位点的第二核苷酸标签，第二核苷酸标签在靶特异性部分的5'。
实施方案30：实施方案29的方法，其中第三扩增引物的靶特异性部分包括不与靶rna退火的插入物，其中插入物侧翼为5'锚序列和3'诱饵序列，两者都与靶rna退火。
实施方案31：实施方案14的方法，其中逆转录试剂另外包含5'寡核苷酸，所述5'寡核苷酸自5’至3’包含第二引物结合位点和寡-ribog序列。
实施方案32：实施方案31的方法，其中5'寡核苷酸另外包含第二引物结合位点和寡-ribog序列之间的独特分子标识符(umi)。
实施方案33：实施方案32的方法，包括向每个捕获位点提供扩增试剂，其中扩增试剂与逆转录试剂分开提供，并且扩增试剂包含第二条形码引物，所述第二条形码引物自3’至5’包括对第二引物结合位点特异性的部分、第二条形码核苷酸序列和第二测序衔接子。
实施方案34：实施方案14-33中任一项的方法，其中该方法产生用于t细胞受体链的dna模板。
实施方案35：实施方案14-33中任一项的方法，其中该方法产生用于免疫球蛋白链的dna模板。
实施例36：实施方案13-26的方法，其中所述微流体装置是包括以下的矩阵型微流体装置：以r行和c列的矩阵排列的捕获位点，其中r和c是大于1的整数，并且其中在将细胞分配到捕获位点后，捕获位点可以被彼此流体隔离；一组r个第一输入线，所述一组r个第一输入线被配置成将第一试剂递送到特定行中的捕获位点；一组c个第二输入线，所述一组c个第二输入线被配置成将第二试剂递送到特定列中的捕获位点，其中所述递送与递送第一试剂分开，其中，在反应后，可以从微流体装置在来自各行或各列的反应产物的池中回收反应产物。
实施例37：实施方案36的方法，其中：通过第一输入线向每个捕获位点提供逆转录试剂，并通过第二输入线向将每个捕获位点提供扩增试剂；或者，通过第二输入线向每个捕获位点提供逆转录试剂，并且通过第一输入线向每个捕获位点提供扩增试剂。
实施方案38：实施方案37的方法，其中：提供给第一输入线的每个条形码引物包括条形码核苷酸序列，该条形码核苷酸序列不同于提供给所有其他第一输入线的其他条形码引物中的条形码核苷酸序列；提供给第二输入线的每个条形码引物包括条形码核苷酸序列，该条形码核苷酸序列不同于提供给所有其他第二输入线的其他条形码引物中的条形码核苷酸序列；并且在每个捕获位点处产生的每个dna模板包括以下结构：5'-(第二测序衔接子)-(第二条形码核苷酸序列)-(第二引物结合位点)-(vs)-(互补决定区)-(cs)-(反向互补第一引物结合位点)-(反向互补第一条形码核苷酸序列)-(反向互补第一测序衔接子)-3'，其中第一和第二条形码核苷酸序列一起，独特地标示产生dna模板处的捕获位点。
实施例39：实施方案14-38中的任一项的方法，其中：第一rt引物的cs特异性部分包括不与编码t细胞受体或免疫球蛋白的第一链的rna的cs退火的插入物；和/或第二rt引物的cs特异性部分包括不与编码t细胞受体或免疫球蛋白的第二链的rna的cs退火的插入物；其中插入物的侧翼是5'锚序列和3'诱饵序列，两者都与cs退火。
实施方案40：实施方案26-39中的任一项的方法，其中：多个第一扩增引物的vs特异性部分包括不与编码t细胞受体或免疫球蛋白的第一链的rna的vs退火的插入物；和/或多个第二扩增引物的vs特异性部分包括不与编码t细胞受体或免疫球蛋白的第二链的rna的vs退火的插入物；其中插入物的侧翼是5'锚序列和3'诱饵序列，两者都与vs退火。
实施方案41：实施方案40的方法，其中第一和第二rt引物不包含不与rna的cs退火的插入物。
实施方案42：实施方案1-40中任一项的方法，其中该方法包括制备用于单细胞转录物组测序的dna模板。
实施方案43：实施方案1-42中任一项的方法，其中该方法包括制备用于多于一种特定靶rna的单细胞转录物测序的dna模板。
实施方案44：实施方案43的方法，其中逆转录试剂另外包含第三逆转录(rt)引物，所述第三逆转录(rt)引物具有对特定靶rna特异性的部分和包含用于第一dna测序引物的第一引物结合位点的第三核苷酸标签，第三核苷酸标签在靶特异性部分的5'。
实施方案45：实施方案44的方法，其中第三rt引物的靶特异性部分包括不与特定靶rna退火的插入物，其中插入物侧翼为5'锚序列和3'诱饵序列，两者都与靶rna退火。
实施方案46：实施方案1-26和36-45中任一项的方法，其中所述逆转录试剂另外包含5'寡核苷酸，所述5'寡核苷酸自5’至3’包含用于所述第二dna测序引物的第二引物结合位点和寡-ribog序列。
实施方案47：实施方案46的方法，其中5'寡核苷酸另外包含第二引物结合位点和寡-ribog序列之间的独特分子标识符(umi)。
实施方案48：实施方案9-47中任一项的方法，其中该方法包括确定，t细胞受体或免疫球蛋白序列存在于具有特定表型的细胞中。
实施方案49：用于从编码t细胞受体或免疫球蛋白链的rna产生dna模板的引物组合，该引物组合包括：第一逆转录(rt)引物，所述第一逆转录(rt)引物具有对编码t细胞受体或免疫球蛋白的第一链的rna的恒定区段(cs)特异性的部分，该t细胞受体或免疫球蛋白还包括第二链；第二逆转录(rt)引物，所述第二逆转录(rt)引物具有分别对编码t细胞受体或免疫球蛋白的第二链的rna的恒定区段(cs)特异性的部分；其中第一和第二rt引物各自另外包含第一核苷酸标签，所述第一核苷酸标签包括用于第一dna测序引物的第一引物结合位点，第一核苷酸标签在cs特异性部分的5'；和第一条形码引物，所述第一条形码引物自3’至5’包括对第一引物结合位点特异性的部分、第一条形码核苷酸序列和第一测序衔接子；多个第一扩增引物，每个第一扩增引物具有对编码t细胞受体或免疫球蛋白的第一链的rna的不同可变区段(vs)特异性的部分；多个第二扩增引物，每个第二扩增引物具有分别对编码t细胞受体或免疫球蛋白的第二链的rna的不同可变区段(vs)特异性的部分；其中第一和第二扩增引物各自另外包含第二核苷酸标签，所述第二核苷酸标签包括用于第二dna测序引物的第二引物结合位点，第二核苷酸标签在vs特异性部分的5'；和第二条形码引物，所述第二条形码引物自3’至5’包括对第二引物结合位点特异性的部分、第二条形码核苷酸序列和第二测序衔接子。
实施方案50：实施方案49的引物组合，其中第一条形码引物包括形成茎-双链体的核苷酸序列，由此第一条形码引物在用于逆转录时具有发夹构型，并且当用于扩增时具有线性构型。
实施方案51：实施方案49或50的引物组合，其中第二条形码引物包括形成茎-双链体的核苷酸序列，由此第二条形码引物在用于逆转录时具有发夹构型，并且当用于扩增时具有线性构型。
实施方案52：实施方案49-51中任一项的引物组合，其中第一和第二扩增引物各自包含形成茎-双链体的核苷酸序列，由此第一和第二扩增引物在用于扩增时各自具有线性构型。
实施方案53：实施方案49-52中任一项的引物组合，另外包含第三逆转录(rt)引物，所述第三逆转录(rt)引物具有寡-dt序列和包含第一引物结合位点的第三核苷酸标签，第三核苷酸标签在寡-dt序列的5'。
实施方案54：实施方案53的引物组合，其中第三rt引物另外包含寡-dt序列和第一结合位点之间的独特分子标识符(umi)。
实施方案55：实施方案49-54中任一项的引物组合，另外包含第三扩增引物，所述第三扩增引物包含对特定靶rna特异性的部分和包含第二引物结合位点的第二核苷酸标签，第二核苷酸标签在靶特异性部分的5'，其中第三扩增引物包括形成茎-双链体的核苷酸序列，由此第三扩增引物在扩增期间具有线性构型。
实施方案56：实施方案49的引物组合，其中：第一rt引物的cs特异性部分包括不与编码t细胞受体或免疫球蛋白的第一链的rna的cs退火的插入物；和/或第二rt引物的cs特异性部分包括不与编码t细胞受体或免疫球蛋白的第二链的rna的cs退火的插入物；其中插入物的侧翼是5'锚序列和3'诱饵序列，两者都与cs退火。
实施方案57：实施方案49或56的引物组合，其中：多个第一扩增引物的vs特异性部分包括不与编码t细胞受体或免疫球蛋白的第一链的rna的vs退火的插入物；和/或多个第二扩增引物的vs特异性部分包括不与编码t细胞受体或免疫球蛋白的第二链的rna的vs退火的插入物；其中插入物的侧翼是5'锚序列和3'诱饵序列，两者都与vs退火。
实施方案58：实施方案57的引物组合，其中第一和第二rt引物不包含不与rna的cs退火的插入物。
实施方案59：实施方案56-58中任一项的引物组合，另外包含第三逆转录(rt)引物，所述第三逆转录(rt)引物具有寡-dt序列和包含第一引物结合位点的第三核苷酸标签，第三核苷酸标签在寡-dt序列的5'。
实施方案60：实施方案59的引物组合，其中第三rt引物另外包含寡-dt序列和第一dna测序引物的结合位点之间的独特分子标识符(umi)。
实施方案61：实施方案59或60的引物组合，另外包含第三扩增引物，所述第三扩增引物包含对特定靶rna特异性的部分、包括第二引物结合位点的第二核苷酸标签，第二核苷酸标签在靶特异性部分的5'。
实施方案62：实施方案61的引物组合，其中第三扩增引物的靶特异性部分包括不与靶rna退火的插入物，其中插入物侧翼为5'锚序列和3'诱饵序列，两者都与靶rna退火。
实施方案63：实施方案49-58中任一项的引物组合，其中引物组合另外包含第三逆转录(rt)引物，所述第三逆转录(rt)引物具有对特定靶rna特异性的部分和包含第一引物结合位点的第三核苷酸标签，第三核苷酸标签在靶特异性部分的5'。
实施方案64：实施方案63的引物组合，其中第三rt引物的靶特异性部分包括不与特定靶rna退火的插入物，其中插入物侧翼为5'锚序列和3'诱饵序列，两者都与靶rna退火。
实施方案65：实施方案63或64的引物组合，其中引物组合另外包含5'寡核苷酸，所述5'寡核苷酸自5’至3’包含第二引物结合位点和寡-ribog序列。
实施方案66：实施方案65的引物组合，其中5'寡核苷酸另外包含第二dna测序引物的结合位点和寡-ribog序列之间的独特分子标识符(umi)。
实施方案67：用于从编码t细胞受体或免疫球蛋白链的rna产生dna模板的引物组合，该引物组合包括：第一逆转录(rt)引物，所述第一逆转录(rt)引物具有对编码t细胞受体或免疫球蛋白的第一链的rna的恒定区段(cs)特异性的部分，该t细胞受体或免疫球蛋白还包括第二链；第二逆转录(rt)引物，所述第二逆转录(rt)引物具有分别对编码t细胞受体或免疫球蛋白的第二链的rna的恒定区段(cs)特异性的部分；其中第一和第二rt引物各自另外包含第一核苷酸标签，第一核苷酸标签包括用于第一dna测序引物的第一引物结合位点，第一核苷酸标签在cs特异性部分的5'；和第一条形码引物，所述第一条形码引物自3’至5’包括对第一引物结合位点特异性的部分、第一条形码核苷酸序列和第一测序衔接子；5'寡核苷酸，自5’至3’包括用于第二dna测序引物的第二引物结合位点、独特分子标识符(umi)和寡-ribog序列；和第二条形码引物，所述第二条形码引物自3’至5’包括对第二引物结合位点特异性的部分、第二条形码核苷酸序列和第二测序衔接子。
实施方案68：实施方案67的引物组合，其中：第一rt引物的cs特异性部分包括不与编码t细胞受体或免疫球蛋白的第一链的rna的cs退火的插入物；和/或第二rt引物的cs特异性部分包括不与编码t细胞受体或免疫球蛋白的第二链的rna的cs退火的插入物；其中插入物的侧翼是5'锚序列和3'诱饵序列，两者都与cs退火。
实施方案69：实施方案67或68的引物组合，其中所述组合另外包含第三逆转录(rt)引物，所述第三逆转录(rt)引物具有对特定靶rna特异性的部分和包含第一引物结合位点的第三核苷酸标签，第三核苷酸标签在靶特异性部分的5'。
实施方案70：实施方案69的引物组合，其中第三rt引物的靶特异性部分包括不与特定靶rna退火的插入物，其中插入物侧翼为5'锚序列和3'诱饵序列，两者都与靶rna退火。
实施方案71：实施方案49-70中任一项的引物组合，其中所述引物组合适于产生用于t细胞受体链的dna模板。
实施方案72：实施方案49-70中任一项的引物组合，其中所述引物组合适于产生用于免疫球蛋白链的dna模板。
实施方案73：一种试剂盒，所述试剂盒包括实施方案49-72中任一项的引物组合和矩阵型微流体装置，所述矩阵型微流体装置包括：以r行和c列的矩阵排列的捕获位点，其中r和c是大于1的整数，并且其中在将细胞分配到捕获位点后，捕获位点可以被彼此流体隔离；一组r个第一输入线，所述一组r个第一输入线被配置成递送第一试剂到特定行中的捕获位点；一组c个第二输入线，所述一组c个第二输入线被配置成将第二试剂递送到特定列中的捕获位点，其中所述递送与递送第一试剂分开，其中，在反应后，可以从微流体装置在来自各行或各列的反应产物的池中回收反应产物。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅着色绘制的图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将依请求和支付必要费用后由主管局(office)提供。
图1a-d：在(1a)中示意性地示出了示例性矩阵型微流体装置。(1b)示出了通过r个不同的第一输入线向捕获位点递送r个不同的条形码。(1c)示出了通过c个不同输入线向捕获位点递送c个不同条形码。(1d)说明，在进行反应后，可以例如通过将收集中的流体施加到c个第二输入线将反应产物从输入线的一个末端的出口推出，而将每个列的反应产物收集成一个池。
图2：在图1中示意性显示的示例性矩阵型微流体装置的照片。
图3a-3d：编码t细胞受体的α和β链的基因(分别为tra和trb)结构的示意图。(3a)产生编码tcrα链的基因的体细胞重组。(3b)产生编码tcrβ链的基因的体细胞重组。(3c)体细胞重组后tcrα链基因中的互补决定区(cdr)的细节；n表示插入cdr3中的非模板化核苷酸。(3d)体细胞重组后tcrβ链基因中的cdr的细节。
图4a-4b：(4a)在单细胞tcr转录物测序方法的一个实施方案中被添加到矩阵型微流体装置的列(或行)中的引物的示意图。trac和trbc序列与tcrα和tcrβ的mrna互补，并且在逆转录酶反应期间用作特异性引物。在图4a中所示的第一条形码引物中，rd2是illuminatruseqread2序列，bc1-20是指20种不同的条形码，且p7是illumina测序衔接子之一。p7.bc.rd2引物不参与rt反应，但是在那里使得在扩增步骤期间将条形码添加到扩增区段的该末端。(4b)在单细胞tcr转录物测序方法的该实施方案中被添加到矩阵型微流体装置的行(或列)中的引物的示意图。
图5：superselective引物的图解表示。锚区段使引物稳定地与模板结合。由于未配对的插入物/环区域，诱饵区段(通常5-10个核苷酸)仅短暂地与模板杂交。
图6a-6b：以上图4a-4b所示方法中使用superselective引物的示意图。(6a)逆转录。(6b)扩增。
图7：使用模板转换以生成特定靶转录物的dna模板(靶向转录物测序)的示意图。在模板转换寡核苷酸中，rd1是illuminatruseqread1序列，umi是独特分子标识符，且ggg是寡-ribog序列。在rt引物中，rd2是illuminatruseqread2序列。关于图4和6讨论的p7.bc.rd2引物可以引发由模板转换产生的cdna的后续扩增。
图8a-b：编码构成免疫球蛋白的特定重链和轻链的基因的结构的示意图。(8a)产生编码μ或δ重链的基因的体细胞重组。(8b)产生编码κ轻链的基因的体细胞重组。
图9：显示实施例1的结果的凝胶。来源于tcr转录物的期望dna片段的大小范围为250至350个核苷酸。不期望的非特异性片段的大小范围为100至220个核苷酸。泳道1中的反应产物用无环rt引物和无环v引物产生；泳道2，环rt引物和无环v引物；泳道3，无环rt引物和环v引物；泳道4，环rt引物和环v引物。对于组合3，观察到期望片段与不期望的片段的最佳比率，组合3为无环rt引物和环v引物。
图10：显示实施例2的结果的凝胶。由于添加了p5、p7和其他序列，来源于tcr转录物的期望dna片段的大小范围为320至400个核苷酸。结果表明，固定的细胞比新鲜细胞产生好得多的期望片段产量。
图11a-11b：设计用于管的单细胞t细胞受体模板产生的说明性方法的示意图，其在实施例5中详细描述。
图12a-12b：产生单细胞t细胞受体模板的方法的示意图，该方法类似于图11a-11b所示的方法，但被修改以与fluidigm的c1tm高通量ifc一起使用(在实施例5中详细描述)。
图13：显示实施例5的结果的凝胶。该方法产生绝大多数在预期的350-450bp大小范围内的tcr文库。
详细描述
本文描述了用于制备dna模板的方法，所述dna模板用于来自细胞群体的rna的单细胞转录物测序。该方法需要将来自该群体的细胞分配到单独的反应体积中，使得多个单独的反应体积各自含有单个分离的细胞，其中细胞在分配之前已经用固定剂处理。在某些实施方案中，固定剂可以是细胞透化固定剂。在特定的实施方案中，该方法包括用固定剂预处理细胞的步骤。该方法通过在每个细胞的单独的反应体积中透化或破坏(例如，裂解)每个细胞并在每个单独的反应体积中从rna逆转录cdna来进行(即，其中来自分离的细胞的rna的每个逆转录与来自每个其他分离的细胞的rna的逆转录分开进行)。然后扩增cdna以产生dna，该扩增也在单独的反应体积中进行以从每个分离的细胞产生dna模板。扩增掺入了促进dna模板的dna测序的一种或更多种核苷酸序列。扩增后，可以回收dna模板，例如用于进一步扩增和/或dna测序。在一些实施方案中，以dna模板的一个或更多个池从单独的反应体积回收dna模板，其可任选地进一步合并以产生dna模板的单个池用于进一步扩增和/或dna测序。
本文描述的这些方法使得能够从来源于单细胞的转录物产生dna模板，其效率高于先前可能的效率(例如，无固定剂)。在某些实施方案中，针对t细胞受体或免疫球蛋白的单细胞测序，本文描述了特定化学方法，其允许使用比任何先前可获得的更简单的方案产生dna模板，尤其是当在矩阵型微流体装置上实施时。
定义
除非另有说明，在权利要求书和说明书中使用的术语如下文列出的来定义。这些术语出于清楚起见而定义，但所有定义与本领域技术人员将如何理解这些术语一致。
如本文所用，术语“微流体装置”是指包括室和/或流体通道的任何装置，其中至少一个尺寸小于1毫米。在某些实施方案中，微流体装置包括流体流通道(或线)和单独的控制通道(或线)，其用于控制或调节通过流体通道的流。
术语核酸包括dna或rna的任何形式，包括例如，基因组dna；互补dna(cdna)，其为mrna的dna表示，通常通过信使rna(mrna)的逆转录或通过扩增获得；合成或通过扩增产生的dna分子；和mrna。
术语核酸包括双链或三链核酸以及单链分子。在双链或三链核酸中，核酸链不必为共延伸的(coextensive)(即，双链核酸不必沿着两条链的整个长度为双链的)。
术语核酸还包括其任何化学修饰，诸如通过甲基化和/或通过加帽(capping)。核酸修饰可以包括化学基团的添加，所述化学基团向单独的核酸碱基或作为一个整体的核酸掺入另外的电荷、可极化性(polarizability)、氢键合、静电相互作用和/或官能性。此类修饰可以包括碱基修饰，诸如2’-位置糖修饰、5-位置嘧啶修饰、8-位置嘌呤修饰、在胞嘧啶环外胺的修饰、5-溴尿嘧啶的取代、骨架修饰、异常碱基配对组合诸如异碱基(isobase)，异胞苷(isocytidine)和异胍(isoguanidine)等。
更具体地，在某些实施方案中，核酸可以包括多脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-d-核糖)、多核糖核苷酸(包含d-核糖)和为嘌呤或嘧啶碱基的n-或c-糖苷的任何其他类型核酸，以及包含非核苷酸骨架的其他聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸(pna))和聚吗啉(作为neugene从anti-viralsinc.,corvallis,oregon商购可得)聚合物，以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物包含呈以下构型的核碱基(nucleobases)：允许诸如在dna和rna中发现的碱基配对和碱基堆积。术语核酸还包括在美国专利第6,794,499号、6,670,461号、6,262,490号和6,770,748号中描述的连锁核酸(linkednucleicacids)(lna)，所述美国专利关于其lna的公开内容通过引用以其整体并入本文。
核酸可以来源于完全化学合成过程，诸如固相介导的化学合成，来源于生物来源，诸如通过从产生核酸的任何物种分离，或者来源于牵涉通过分子生物学工具操作核酸的过程，诸如dna复制、扩增(例如pcr扩增)、逆转录，或来源于这些过程的组合。
术语“模板”在本文中用于指用作聚合酶的模板以合成互补核酸分子的核酸分子。
例如，“dna模板”可用于dna测序，通常在添加促进dna测序的一种或更多种核苷酸序列(例如，条形码、独特分子标识符、用于dna测序引物的结合位点和/或测序衔接子，诸如例如，可用于桥式测序中的簇生成的流通池序列)后。
如本文所用，术语“核苷酸条形码”和“条形码”是指编码关于在逆转录中使用条形码引物或寡核苷酸时产生的cdna或关于在扩增反应中使用一种或更多种条形码化引物时产生的扩增子的信息的特定核苷酸序列。
在一些实施方案中，条形码编码捕获位点信息的事项。例如，对于在矩阵型微流体装置上进行的反应，条形码可以编码捕获位点的行或列。两个条形码，一个编码引入条形码的行，另一个编码引入该条形码的列，可以限定驻留在由条形码识别的行和列的交叉点的特定捕获位点。
如本文所用，“umi”是“独特分子标识符”的首字母缩写，也称为“分子标识符”。umi是一组标识符中的一个，一组标识符中每个标识符可与组中的任何其他标识符区分开。实现这种“独特性”的一种方法是使用一串核苷酸。例如，如果该字符串的长度为10个碱基，则有超过100万个独特序列；如果它是20个碱基长，将有1012个独特序列。参见hug和schuler，“measurementofthenumberofmoleculesofasinglemrnaspeciesinacomplexmrnapreparation”，j.theor.biol.(2003)221,615-624以及hollas和schuler，“astochasticapproachtocountrnamoleculesusingdnasequencingmethods”在algorithmsinbioinformatics(2003)：thirdinternationalworkshop，wabi2003，budapest,hungary，2003年9月15-20日，系列标题：lecturenotesincomputerscience2812卷，第55-62页(编辑benson和page)，其对umi概念的描述在此通过引用并入。
本文所用的术语“靶核酸”或“靶rna”是指在本文描述的方法中待检测的特定核酸。相应地，例如，特定rna转录物的扩增是靶特异性扩增的一个例子，而“全转录物组扩增”是目的为扩增给定细胞中存在的所有转录物的扩增的一个例子。当对扩增产物进行测序时，特定转录物的测序称为“靶特异性”或“靶向”测序，而“转录物组测序”旨在对细胞中存在的所有转录物测序。
如本文使用的，术语“靶核苷酸序列”指包含靶核酸的核苷酸序列的分子，诸如，例如通过扩增靶核酸获得的扩增产物或逆转录rna靶核酸后产生的cdna。
如本文所用，术语“互补”指两个核苷酸之间精确配对的能力。即，如果核酸的给定位置上的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸氢键键合，则这两个核酸被认为在该位置上彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中仅一些核苷酸结合，或当在单链分子之间存在总互补性(totalcomplementarity)时，它可以是完全的。核酸链之间的互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则第一核苷酸序列被称为第二序列的“互补序列”。如果第一核苷酸序列与为第二序列的反向(即核苷酸顺序被逆转)的序列互补，则第一核苷酸序列被称为第二序列的“反向互补序列”。
“特异性杂交”指在定义的严格条件下核酸与靶核苷酸序列的结合，而不存在对杂交混合物中存在的其他核苷酸序列的实质结合。本领域技术人员认识到，放松杂交条件的严格性允许耐受序列错配。
在特定实施方案中，杂交在严格的杂交条件下进行。措辞“严格杂交条件”通常指在定义的离子强度和ph在低于特定序列的解链温度(tm)从约5℃至约20℃或25℃的范围内的温度。如本文使用的，tm为双链核酸分子群体变成一半被解离为单链时的温度。计算核酸的tm的方法是本领域熟知的(参见，例如，berger和kimmel(1987)methodsinenzymology,第152卷:guidetomolecularcloningtechniques,sandiego:academicpress,inc.和sambrook等(1989)molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,第1-3卷,coldspringharborlaboratory)，两者均通过引用并入本文)。如标准参考文献所示，当核酸在1mnacl水溶液中时，可以通过以下等式计算tm值的简单估计值：tm＝81.5+0.41(％g+c)(参见例如，anderson和young，quantitativefilterhybridizationinnucleicacidhybridization(1985))。杂交体的解链温度(并且因此用于严格杂交的条件)受多种因素影响，所述多种因素诸如引物或探针的长度和性质(dna、rna、碱基组成)以及靶核酸的性质(dna、rna、碱基组成、存在于溶液中或被固定等)及盐和其他组分的浓度(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)。这些因素的影响是本领域熟知的，并且在本领域的标准参考文献中讨论。适于实现大多数序列的特异性杂交的示例性严格条件是：温度为至少约60℃以及盐浓度为约0.2摩尔、在ph7。
术语“寡核苷酸”用于指是相对短的，通常短于200个核苷酸，更特别地，短于100个核苷酸，甚至更特别地，短于50个核苷酸，以及最特别地，短于40、30、20、15、10或5个核苷酸的核酸。通常，寡核苷酸是单链dna分子。
一段相同类型的核苷酸被称为例如“寡-ribog”(对于一段重复的鸟嘌呤)或“poly-a”(对于一段重复的腺嘌呤)。
术语“引物”指能够在适当的缓冲液中和在合适的温度，在适当的条件下(即，在四种不同的核苷三磷酸和用于聚合的剂，诸如dna或rna聚合酶或逆转录酶的存在下)与核酸杂交(还称为“退火”)并用作用于核苷酸(rna或dna)聚合的起始位点的寡核苷酸。术语“引物位点”或“引物结合位点”指引物与其杂交的靶核酸区段。
如果引物或其一部分与另一核酸内的核苷酸序列杂交，则该引物被称为与该核酸“退火”。引物与特定核苷酸序列杂交的叙述并不意图暗示引物与该核苷酸序列完全地或排他地杂交。例如，引物的一部分可以与特定核酸退火，在这种情况下，该部分被称为“特异于”该核酸。
引物可以与靶核酸序列完全互补，或者可以不太完全互补。在某些实施方案中，引物与靶核酸序列的互补序列在至少7个核苷酸的序列上，更通常在10-30个核苷酸的范围内的序列上，并且通常在至少14-25个核苷酸的序列上具有至少65％的同一性，并且更通常具有至少75％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、或至少95％、96％、97％、98％、或99％同一性。将理解，某些碱基(例如，引物的3’碱基)通常可期望与靶核酸序列的相应碱基完全互补。引物和探针通常在严格杂交条件下与靶序列退火。
术语“核苷酸标签”在本文中用于指通常在逆转录或扩增期间添加至另一核苷酸序列的预先确定的核苷酸序列。使用具有非杂交部分(即“标签”)的引物方便地添加核苷酸标签。核苷酸标签可包括例如用于测序引物的引物结合位点、条形码、umi、测序衔接子等。
如本文所用，术语“条形码引物”是指包含特定条形码核苷酸序列的引物，该特定条形码核苷酸序列编码关于在扩增反应中使用条形码引物时产生的扩增子的信息。
“接头(linker)”可以但不必是核酸或包括核酸。可以将核苷酸接头添加到待扩增的核苷酸序列的任一末端，以利用对核苷酸接头特异的引物促进无偏扩增，核苷酸接头可以相同或不同。
如本文提及引物的部分使用的，术语“靶特异性”核苷酸序列指在合适的退火条件下可以与靶核酸或靶核苷酸序列特异性退火的序列。
如本文所用，“锚序列”是指寡核苷酸(例如引物)中保持寡核苷酸与互补核苷酸序列稳定结合的序列。
如本文所用，“诱饵序列”是指寡核苷酸(例如，引物)中仅瞬时结合互补核苷酸序列的序列。当与锚序列结合使用时，诱饵序列将形成比锚序列更不稳定的杂合体。
如与锚序列和诱饵序列结合使用的，“插入物”是指位于锚序列和诱饵序列之间的非杂交元件，插入物通常是核苷酸序列，但不限于此。
术语“侧翼为”在本文中用于描述中心核苷酸序列在任一侧具有其他核苷酸序列的情况。
如本文所用，当核酸分子(通常是寡核苷酸)的两个自身互补区域彼此杂交时，形成“茎-双链体”。
茎-双链体的两个自身互补区域通常通过核苷酸环连接，以在低于茎-双链体的tm的温度形成“发夹”构型。
“发夹引物”是能够引发核苷酸聚合(例如扩增)并且在较低温度呈现发夹构型的寡核苷酸。
如果引物具有比用于逆转录的温度(例如37-42℃)高的tm的茎-双链体，则称其具有“逆转录期间的发夹构型”。在这种构型中，引物不能起到引发核苷酸聚合的作用。实际上，引物是“关闭的”。
引物被称为在扩增期间具有“线性构型”，使得它可以与足够互补的序列退火并引发核苷酸聚合。实际上，引物是“开启的”。当通过聚合酶链式反应(pcr)进行扩增时，引物在变性时呈现线性构型，其在退火(例如，在50-65℃)和延伸期间保持。
根据本发明的教导的扩增包括至少一种靶核酸的至少一部分藉以复制(通常以模板依赖性方式)的任何手段，包括但不限于，用于线性或指数扩增核酸序列的宽范围技术。用于进行扩增步骤的示例性手段包括连接酶链式反应(lcr)、连接酶检测反应(ldr)、连接随后是q-复制酶扩增、pcr、引物延伸、链置换扩增(sda)、超支化链置换扩增(hyperbranchedstranddisplacementamplification)、多重置换扩增(mda)、基于核酸链的扩增(nasba)、二步骤多重复用扩增、滚环扩增(rca)等，包括其多重版本及组合，例如，但不限于，ola/pcr、pcr/ola、ldr/pcr、pcr/pcr/ldr、pcr/ldr、lcr/pcr、pcr/lcr(还称为组合链式反应(combinedchainreaction)--ccr)等。此类技术的描述可以在除其他来源外的以下来源中找到：ausbel等；pcrprimer：alaboratorymanual，diffenbach，编，coldspringharborpress(1995)；theelectronicprotocolbook，changbioscience(2002)；msuih等，j.clin.micro.34：501-07(1996)；thenucleicacidprotocolshandbook，r.rapley，编，humanapress，totowa，n.j.(2002)；abramson等，curropinbiotechnol.1993feb.；4(1)：41-7，美国专利第6,027,998号；美国专利第6,605,451号，barany等，pct公布号wo97/31256；wenz等，pct公布号wo01/92579；day等，genomics，29(1)：152-162(1995)，ehrlich等，science252：1643-50(1991)；innis等，pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications，academicpress(1990)；favis等，naturebiotechnology18：561-64(2000)；和rabenau等，infection28：97-102(2000)；belgrader，barany和lubin，developmentofamultiplexligationdetectionreactiondnatypingassay,sixthinternationalsymposiumonhumanidentification，1995年(可在万维网上获取：promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-)；lcr试剂盒使用手册，目录号200520，rev.#050002，stratagene，2002；barany，proc.natl.acad.sci.usa88：188-93(1991)；bi和sambrook，nucl.acidsres.25：2924-2951(1997)；zirvi等，nucl.acidres.27：e40i-viii(1999)；dean等，procnatlacadsciusa99：5261-66(2002)；barany和gelfand，gene109：1-11(1991)；walker等，nucl.acidres.20：1691-96(1992)；polstra等，bmcinf.dis.2：18-(2002)；lage等，genomeres.2003feb.；13(2)：294-307，和landegren等，science241：1077-80(1988)，demidov，v.，expertrevmoldiagn.2002nov.；2(6)：542-8.，cook等，jmicrobiolmethods.2003may；53(2)：165-74，schweitzer等，curropinbiotechnol.2001feb.；12(1):21-7，美国专利第5,830,711号，美国专利第6,027,889号，美国专利第5,686,243号，pct公布号wo0056927a3和pct公布号wo9803673a1。
在一些实施方案中，扩增包括至少一个循环的以下顺序程序：使至少一种引物与在至少一种靶核酸中的互补或基本上互补的序列退火；使用聚合酶以模板依赖性方式合成至少一条核苷酸链；并且使新形成的核酸双链体变性以将链分开。循环可以重复或者也可以不重复。扩增可以包括热循环或可以等温进行。
“全转录物组扩增”(“wta”)是指目的在于产生扩增产物的任何扩增方法，所述扩增产物代表来自从其制备rna的细胞的rna群体。一种说明性的wta方法需要在任一端产生带有接头的cdna，以促进无偏扩增。在许多实施方案中，进行wta以分析信使(poly-a)rna。
这里提到参数使用的术语“基本上”意味着，该参数足以提供有用的结果。因此，应用于核酸序列的“基本上互补的”通常意味着在所述上下文中充分互补以起作用。通常，基本上互补意味着充分互补以在所用条件下杂交。
“试剂”广义上是指反应中使用的除分析物(例如，被分析的核酸)以外的任何试剂。用于核酸扩增反应的说明性试剂包括但不限于，缓冲液、金属离子、聚合酶、逆转录酶、引物、核苷酸、寡核苷酸、标记物、染料、核酸酶等。用于酶促反应的试剂包括例如，底物、辅因子、缓冲液、金属离子、抑制剂和活化剂。术语试剂还包括影响细胞生长或行为的任何组分，诸如例如缓冲液、培养基或其组分、激动剂或拮抗剂等。
如本文所用的术语“标记物”，是指可用于提供可检测和/或可定量信号的任何原子或分子。特别是，标记物可直接或间接地附接至核酸或蛋白。可附接至探针的合适的标记物包括但不限于，放射性同位素、荧光团、生色团、质量标记物、电子致密颗粒、磁性颗粒、自旋标记物、发射化学发光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子和酶底物。
如本文关于反应、反应混合物、反应体积等使用的，术语“单独的”指其中反应与其他反应隔离进行的反应、反应混合物、反应体积等。单独的反应、反应混合物、反应体积等包括在液滴中进行的那些(参见，例如，2007年11月13日授予quake等的标题为“microfabricatedcrossflowdevicesandmethods”的美国专利第7,294,503号，其通过引用以其整体并入本文并且特别是关于其对用于形成和分析液滴的装置和方法的描述；由link等2010年2月28日公布的,标题为“dropletlibraries”的美国专利公布第20100022414号，其通过引用以其整体并入本文并且特别是关于其对用于形成和分析液滴的装置和方法的描述；以及由miller等2011年1月6日公布的标题为“manipulationofmicrofluidicdroplets”的美国专利公布第20110000560号，其通过引用以其整体并入本文并且特别是关于其对用于形成和分析液滴的装置和方法的描述)，液滴可以但不必是乳液的形式，以及在其中反应、反应混合物、反应体积等通过机械屏障分开的那些中，例如单独的容器、微量滴定板的单独的孔、或矩阵型微流体装置的单独的隔室中进行的那些。
术语“流体隔离”在本文中用于指其中微流体装置的两个或更多个元件彼此不流体连通的状态。
术语“弹性体”具有本领域中使用的一般含义。因此，例如，allcock等(contemporarypolymerchemistry，第二版)将弹性体描述为通常在其玻璃化转变温度和液化温度之间的温度存在的聚合物。弹性材料表现出弹性特性，因为聚合物链容易经受扭转运动以允许骨架对力响应而展开，骨架在没有力的情况下反弹以呈现先前的形状。通常，弹性体在施加力时变形，但是当移除力时弹性体恢复其原始形状。
如本文所用，“固定剂”是稳定用于后续分析的细胞、细胞结构和/或大分子(例如rna)的化合物或化合物的混合物。
当提到t细胞或b细胞使用时，术语“激活的”是指在暴露于刺激细胞中免疫应答的抗原后细胞的状态。
使用固定细胞的单细胞转录物测序-一般情况
本文描述的方法可用于从单个固定细胞制备用于测序的dna模板。模板可以从任何类型的rna制备，例如，从微小rna到信使rna。模板可以由单细胞中的特定rna靶或一类rna的完整互补物制备，例如，全转录物组测序中的所有信使rna。虽然本公开内容集中于制备用于确定rna序列的dna模板，但本领域技术人员理解可以在测序过程中确定rna表达水平，因为表达水平与获得的测序读段的数量相关。另外，如本领域技术人员从下面的讨论中将容易理解的，这些用于产生dna模板和对dna模板测序的方法可以与核酸、蛋白质或单细胞的其他方面的其他类型的分析结合。因为可以在这些方法中使用的单独反应体积中进行多种类型的分析，所以可以鉴定单个细胞的多种特征，促进特定rna序列(任选地在特定水平)与表型的关联。在darmaniss，gallantcj，marinescuvd，niklassonm，segermana，flamourakisg，fredrikssons，assarssone，lundbergm，nelanders等：simultaneousmultiplexedmeasurementofrnaandproteinsinsinglecells.cellrep2016,14：380-389中描述了这种类型方法的一个例子，其通过引用将该描述并入本文中。
分析的细胞
本文所述的方法可用于分析来自任何类型细胞的转录物，例如任何自我复制的、膜结合的生物实体或其任何非复制的、膜结合的后代。非复制后代可以是衰老细胞、终末分化细胞、细胞嵌合体、血清饥饿细胞、感染细胞、非复制突变体、无核细胞、完整细胞核和固定的完整(死亡)细胞等。本文描述的方法中使用的细胞可以具有任何来源、遗传背景、健康状态、固定状态、膜透化性、预处理和/或群体纯度等特征。合适的细胞可以是真核细胞、原核细胞、古细菌(archaeon)等，并且可以来自动物、植物、真菌、原生生物、细菌和/或类似物。在说明性实施方案中，人细胞被分析。细胞可以来自生物发育的任何阶段，例如，在哺乳动物细胞(例如人细胞)的情况下，可以分析胚胎、胎儿或成人细胞。在某些实施方案中，细胞为干细胞。细胞可以是野生型；天然、化学或病毒突变体；工程化突变体(诸如转基因)；和/或类似的细胞。此外，除了其他状态以外，细胞可以是生长的、静止、衰老、转化的和/或永生化的。此外，细胞可以是单一培养物，通常来源于单细胞或一小组非常相似的细胞的克隆群体；可以通过任何合适的机制预先选择，例如亲和结合、facs、药物选择等；和/或可以是不同细胞类型的混合或异质群体。
在特定的实施方案中，细胞是预先选择的t或b细胞群体。两者(连同天然杀伤t细胞或nkt细胞和单核细胞)都是外周血单核细胞(pmbc)，其可以使用标准方法分离。也可以使用标准方法富集pmbc的期望的群体。例如，可以通过选择cd4+细胞来富集t辅助细胞(th)；通过选择cd8+细胞可以富集细胞毒性t细胞(tc细胞或ctl)；记忆t细胞可以通过选择cd45ro+细胞来富集；等等。
本文描述的方法的一个优点是它们可用于分析几乎任何数量的单细胞，例如在特定细胞群体中。在各种实施方案中，所分析的单细胞的数量可以例如是以下值中的至少任一个：10、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7,000、8000、9,000或10,000。当待分析的细胞稀少时，本文所述的方法提供优于细胞分选的优点，即分析需要较少的细胞。在各种实施方案中，分析的单细胞的数量可以少于以下任何值：10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000或1,000。在具体的实施方案中，分析的细胞数量可以落在由上面列出的任何两个值界定的范围内，诸如例如300-1,300、400-1,200、500-1,100、600-1,000或700-900。说明性实施方案旨在分析800个细胞。
固定细胞
用细胞透化固定剂处理细胞可能预期会妨碍后续反应，例如逆转录和/或扩增。令人惊讶的是，基于本文所述的工作，现已发现固定细胞可以改善在对通过逆转录、然后扩增产生的dna模板测序后观察到的结果的质量。
因此，本文描述的方法使得能够从来源于单细胞的转录物产生dna模板，其效率高于先前可能的效率(例如，无固定剂)。在各种实施方案中，这些方法使得能够对来自在单独的反应体积中已经分离的大于：50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％的细胞的任何感兴趣的转录物测序和/或定量其水平，其中分离的细胞的数量范围为例如90-10,000、100-5,000、200-1,500、300-1,300、400-1,200、500-1,100、600-1,000或700-900。例如，使用本文描述的方法，人们可以使用比以前任何可用方案更简单的方案在200-1,500个分离细胞的超过85％、超过90％或超过95％中获得tcr或ig链的序列(和任选地表达水平)，以及任选地一种或更多种表型标志物。在某些实施方案中，合适的固定剂通过稳定细胞核使得细胞裂解不太可能破坏细胞核(其增加释放的核酸中rna的百分比)和/或通过稳定rna来提供这样的结果。
在说明性实施方案中，固定剂是生物标志物和组织学防腐剂(bhp)和/或二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(dsp)。bhp描述于mueller等，“one-steppreservationofphosphoproteinsandtissuemorphologyatroomtemperaturefordiagnosticandresearchspecimens(2011年8月)plosone，6(8)e23780，和在espina等，us2013/0137094，2013年5月30日公布，两者均通过引用并入这种描述。mueller等的表1关于bhp组成提供以下内容：
us2013/0137094如下描述了说明性bhp的产生：
1.制备不含乳酸的血细胞固定剂的方案：
在1型试剂级水中制备10％聚乙二醇(mw8000)(fisher)、100mm原钒酸钠(sigma)和1.0mβ甘油磷酸盐(calbiochem)的储备溶液。在dmso中制备200mm染料木黄酮(genistein)(alexisbiochemicals)的储备溶液。
将0.05mgdsp(pierce)溶于500μldmso中。将0.05mgdtbp溶于500μl1型试剂级水中。
将6.0ml的200proof乙醇(sigma)加入38ml汉克斯平衡盐溶液(hyclone，fisher)中。
向酒精/汉克斯平衡盐溶液加入250μl10％聚乙二醇、1000μl原钒酸钠(sigma)、3.75mlβ乙酸甘油酯(calbiochem)、50.0μldmso中即用型1.0mm星形孢菌素(staurosporine)(sigmacat#s6942)和2.5μl染料木黄酮(alexisbiochemicals)、500μldsp溶液和500μldtbp溶液。轻轻混合。
通过在室温将bhp加入细胞中，可以用bhp固定细胞。
固定剂dsp描述于xiang等的“usingdsp,areversiblecross-linker,tofixtissuesectionsforimmunostaining,microdissectionandexpressionprofiling”(2004年12月16日)nucleicacidsres.，32(22)e185中。dsp，也称为lomant试剂，是一种细胞透化性、同型双功能(homobifunctional)的硫醇可裂解分子，据信它在ph为6.5-8.5之间的水性缓冲液中将伯氨基彼此连接。细胞可以被固定，例如，如xiang等所述。简而言之，使成纤维细胞生长至约85％汇合，用1xpbs缓冲液洗涤一次，然后用以1mg/ml的终浓度的dsp(pierce，rockford，il)固定5分钟。制备dsp在100％无水dmso(sigma-aldrich，stlouis，mo)中的储备溶液并储存在-80℃。在使用前立即用1xpbs将储备溶液稀释至工作浓度。当将dmso储备溶液加入pbs中时，为了防止dsp沉淀，将pbs轻轻涡旋并逐滴加入储备溶液。
将细胞分配到单独的反应体积中
可以通过任何可用的方式创建和维护单独的反应体积。例如，单独的反应体积可以由板中的单独孔、乳液中的单独液滴、通道中的单独的流体段、或微流体装置中的单独的反应位点(例如室)组成。
至少有四种标准方法/系统可用于分离细胞用于单细胞测序：显微操作、激光捕获显微切割(lcm)、荧光激活细胞分选(facs)和微流体系统。最后两种方法可以提供可靠地反映细胞群体的异质性所需的大样本数所需的高通量。参见livak，“eukaryoticsingle-cellmrnasequencing,”fieldguidelinesforgeneticexperimentaldesignsinhigh-throughputsequencing，springer，isbn978-3-319-31348-1(2016)，其对于单细胞mrna测序的描述通过引用并入本文。
在一些实施方案中，进行分配步骤以增加仅含有一个细胞的单独反应体积的数量。实现此目的的方法是公知的，并且包括例如有限稀释。在特定的实施方案中，该方法需要确定哪些反应体积含有单个分离的细胞。
方便地，该方法可以使用微流体装置进行，该微流体装置有助于在多个捕获位点捕获单个细胞。在一些实施方案中，捕获位点能够彼此流体隔离，例如，在整个装置中细胞分配后。在某些实施方案中，捕获位点各自具有捕获特征，该捕获特征将细胞或细胞群组保留在该位置。在一些实施方案中，捕获特征位于室内，该室可以与捕获位点内的其他室流体隔离。该装置可以配置成使得可以向每个捕获位点提供一种或更多种第一试剂，并且可以向每个捕获位点提供一种或更多种第二试剂，其中第二试剂与第一试剂不同，并且与第一试剂分开提供。例如，每对试剂可以提供给捕获位点中的一对流体可隔离室，所述室彼此不同，并且任选地，不同于用于细胞捕获的室。
在一些实施方案中，微流体装置的至少一个表面是透明的，以允许细胞和/或来自标签的信号的可视化。在此类实施方案中，该方法可任选地包括在逆转录之前对细胞占据的捕获位点成像。
矩阵型微流体装置
在一些实施方案中，本文描述的方法可以在矩阵型微流体装置上进行，其有助于引入识别装置中的特定行的条形码和识别特定列的条形码，由此该组合独特地识别特定的捕获位点，并因此识别衍生反应产物的特定细胞或细胞群体。该方法已经在这样的装置上进行了测试并证明是可行的(参见实施例3)。
在某些实施方案中，在上述方法中有用的矩阵型微流体装置包括以r行和c列的矩阵排列的捕获位点，其中r和c是大于1的整数。每个捕获位点可以包括捕获特征，该捕获特征能够仅捕获一个细胞，或者，在将成组分析细胞时，该捕获特征能够仅捕获不超过每组细胞所需的细胞数量。在将细胞分配到捕获位点后，捕获位点可以彼此流体隔离。该装置还包括一组r个第一输入线，其被配置为将第一试剂递送至特定行中的捕获位点，以及一组c个第二输入线，其被配置为递送第二试剂至特定列中的捕获位点，其中该递送与递送第一试剂分开。在图1a中示意性地示出了这种类型的示例性装置。图1b示出了通过r个不同的第一输入线向捕获位点递送r个不同的条形码。图1c示出了通过c个不同输入线向捕获位点递送c个不同的条形码。在特定实施方案中，所有条形码将是独特的，即，与提供给装置的每个其他条形码不同。图1d说明，在进行反应后，可以从每个列收集反应产物作为池，例如，通过将收集流体施加到c个第二输入线以将反应产物从输入线一端的出口推出。(本领域技术人员容易理解，“行”和“列”的指定是任意的，因为如果将装置旋转90度，则行成为列，反之亦然，在这种情况下，反应产物将从每行被收集作为池。)图2示出了图1中示意性示出的装置的照片。
在某些实施方案中，矩阵型微流体装置允许分析单个细胞或例如高达(和包括)1000的细胞群组。一个或更多个细胞在每个捕获位点被捕获或分离后，细胞可以是完整的或部分或完全破坏(例如，透化或裂解)。在后一种情况下，该装置被配置为提供该功能。在一些实施方案中，所述装置在至少一个表面上是透明的，以允许成像使细胞数目或表型可视化(例如，当细胞或其内容物已经与光学可检测标记物反应时)。在一些实施方案中，所述装置配置成执行“x-y”组合条形码化，由此可以将反应产物输出到一个或更多个池(其本身可以合并)中并进一步多重分析(例如，通过扩增)，然后“去多重化(de-multiplexing)”(“demux”)以将特定反应产物分配给特定捕获位点。这种类型的条形码化如图1所示，它显示了同一组3'条形码(图1b中的“3'bc”)被递送到每一列和同一组5'条形码(图1c中的“5'bc”)被递送到每一行。
在各种实施方案中，使用具有从约90至约10,000个单独捕获位点的微流体装置来实施本文所述的一种或更多种方法，特别是从约90至约5,000个捕获位点，更特别是从约90至约2,500个捕获位点，甚至更特别是从大约90到大约1,000个捕获位点。在一些实施方案中，微流体装置可具有大于100、大于200、大于300、大于400、大于500、大于600、大于700、大于800、大于900或大于1000个捕获位点。在说明性实施方案中，微流体装置具有在300-1300、400-1200、500-1100、600-1000、700-900或800范围内的若干捕获位点。
在一些实施方案中，捕获位点具有一个或更多个反应室，范围为从约0.2nl至约500nl。反应室体积越低，任何靶核酸的有效浓度越高。在某些实施方案中，反应室为从约0.2nl至约50nl、优选0.5nl至约5nl、更优选从约1nl至约4nl。在一些实施方案中、反应室体积为1.5nl、2.0nl、2.5nl、3.0nl或3.5nl，或落入由这些值中的任何值界定的任何范围内。
满足本文所述规格的微流体装置和采用它们执行所公开的方法的系统可以基于本文的指导和先前共同拥有的专利公布来设计和制造，例如2013年5月12日公布的美国专利公布第2013/0323732号，anderson等和2016年2月26日提交的美国申请第15/055,252号，conant等(两者都将其对单细胞分析方法和系统的描述通过引用并入)。例如，可从fluidigmcorporation(southsanfrancisco，ca)获得的c1tmsingle-cellautoprepsystem提供了ifctm中来自单细胞的核酸的多重分离、裂解和反应的台式自动化。特别是，c1single-cellautopreparrayifc是一种矩阵型微流体装置，有助于从多达96个单个细胞中捕获和高度平行地制备产物。fluidigm还销售这种类型装置的高通量版本，称为c1mrnaseqhtarrayifc，它有助于从多达800个单个细胞捕获和制备产物。如果使用得当，芯片内的每个捕获位点捕获一个单细胞。有时，位点可能捕获零个、两个或更多个细胞；然而，c1芯片的每个捕获位点中捕获的细胞的确切数量很容易以高可信度进行验证，并且很容易在微观图片中记录。在某些实施方案中，捕获细胞并在每个单独的反应体积中进行条形码化以产生条形码化的核酸分子，其通过dna测序(无论是sanger测序、下一代测序还是第三代测序)任选地在预扩增后被最方便地分析。
c1结构使得能够联合任何促进分析细胞内大分子的多步骤生化过程处理离散捕获的细胞。除制备用于dna测序的模板外，此类过程还包括例如多重蛋白质邻近连接测定或多重蛋白质邻近延伸测定以定量特定蛋白质，多重微rna预扩增，rna转录物或dna序列的靶特异性扩增(例如，用于基因分型多态性标志物，例如snp，或以其他方式分析遗传变异，例如拷贝数变异)，或其任何组合。该结构也可用于在任何所需条件下培养离散捕获的细胞，所述条件可通过添加组分诸如例如特定受体的激动剂或拮抗剂而在芯片上进行修改。
生成编码的dna模板
一旦将细胞分配到单独的反应体积中，将单个细胞透化或破坏以释放rna。优选地，细胞被破坏(例如，裂解)，并且可以使用任何实现此目的的常规手段，诸如例如用蛋白酶k处理。示例性裂解溶液是0.5％np-40、50mmtris-hcl、ph8.4、1mmedta。这提供了对逆转录酶最佳的ph，并且np-40不抑制逆转录酶。在65-70℃短暂孵育(1-2分钟)足以裂解许多哺乳动物细胞。如果需要更严格的裂解，该溶液可以补充30μg/ml蛋白酶k，并且孵育可以在50℃进行30分钟，然后在70℃进行1分钟。如果裂解溶液中包含蛋白酶k，则蛋白酶k抑制剂aapf(目录号539470，emdmillipore)可以以0.33mm的浓度被包括在逆转录酶反应中。可商购的裂解溶液包括cellulysertm(tataabiocenter)、realtimereadytmcelllysis(rochediagnostics)和singlecell-to-cttm(lifetechnologies)。
使用来自单细胞的rna工作的一个优点是rna不需要纯化。单细胞的体积为皮升级。即使在通常用于微流体的纳升级别中，细胞裂解物也可以被稀释到足以使酶促反应可以直接在裂解物中进行。
在某些实施方案中，将逆转录试剂加入到单独的反应体积中并进行逆转录。在特定的实施方案中，随后将扩增试剂加入到单独的反应体积中并进行扩增。
在一些实施方案中，在每个反应体积(与每个其他反应体积分开)中进行的反应产生dna模板，其编码关于反应体积身份和/或细胞和/或靶的一个或更多个信息项(例如，在靶向转录物测序中)。可以回收dna模板，任选合并，并进行dna测序，dna测序确定dna模板的序列和其中编码的信息项二者。在特定实施方案中，这允许将特定dna模板鉴定为来源于特定反应体积中的单细胞。
可以实现这种鉴定的一种方式是将一个或更多个条形码核苷酸序列(“条形码”)掺入dna模板中。条形码实际上可以是任何长度，尽管在一些实施方案中，较短的条形码(例如，4-6个核苷酸长度)可以是优选的。在各种实施方案中，合适的条形码长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19或20个核苷酸或可以落入由这些值中的任何一个界定的范围，例如2-10或3-8。
在一些实施方案中，每个反应可以掺入至少一种独特分子标识符(“umi”)，其是独特识别其所掺入的分子的核苷酸序列。kivioja等(2012)描述了使用umi计算分子绝对数量的过程。在一些实施方案中，umi是随机序列标记(通常为n4至n10)，其在任何扩增步骤之前附接于待测序的分子。对于常规rna测序，从映射到每个特定转录物的读段的总数推断定量。对于umi，通过计算针对每个特定转录物观察到的独特umi的数量来完成定量，而不管每个umi被读取多少次。对于5'末端加标签，umi可以被掺入到模板转换寡核苷酸中。对于3'-末端加标签，umi可以被掺入例如寡dt引物中。就用于umi的随机核苷酸的数量而言，n5对于大多数哺乳动物细胞应该是足够的。对于预期具有更多总转录物的较大细胞，可能建议使用n6或n7。
在这些实施方案的变化形式中，除了一个或更多个umi之外，反应还掺入一个或更多个条形码(例如，两个条形码以编码矩阵型微流体装置的行和列加上umi以编码原始rna模板的分子身份)。umi可以是任何长度，并且给定分析期望的长度将随着待识别的独特分子的数量增加而增加。在各种实施方案中，合适的umi长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19或20个核苷酸或可以落入由这些值中的任何一个界定的范围，例如2-10、3-8、4-7或5-6。
t细胞受体或免疫球蛋白转录物的单细胞测序
在某些实施方案中，可以进行上述方法以分别在单个t或b细胞中对t细胞受体(tcr)或免疫球蛋白(ig)转录物测序。在一些实施方案中，激活t或b细胞以增加可用于分析的tcr或ig转录物的水平。可以使用本领域技术人员已知的任何方法激活t细胞或b细胞。例如，当由抗原呈递细胞(apc)表面上表达的mhcii类分子呈递肽抗原时，t辅助细胞(th)被激活。细胞毒性t细胞(tc细胞或ctl)通过结合与存在于所有有核细胞表面上的mhci类分子缔合的抗原而被激活。b细胞被结合细胞表面受体的抗原激活。
tcr转录物产生
每个t淋巴细胞表达结合抗原的tcr。抗原结合是免疫应答级联中的关键事件。大多数tcr是由分别由tra和trb基因编码的α-链和β-链组成的异二聚体。一小部分tcr是分别由trg和trd基因编码的γ-链和δ-链组成的异二聚体。
通过在tra、trb、trg和trd基因座处发生的体细胞v(d)j重组产生抗原识别的多样性。为了便于讨论，下面描述的方法分别集中于对来自tra和trb基因座的转录物进行测序，但是这些方法同样适用于来自trg和trd基因座的转录物。在单细胞分辨率下，确定tra和trb的适当部分的序列充当t细胞祖先的独特标识符，因为表达相同tcrαβ对的任何两个t细胞可能来自共同的t细胞克隆。本公开内容描述了用于靶向单细胞转录物测序以确定t细胞克隆身份的改进方法。改进的方法可方便地在微流体装置上进行，例如本文所述的那些装置，例如，如fluidigm出售的c1single-cellautopreparraytmifc或c1mrnaseqhtarrayifc。
tra和trb具有图3中图示的复杂结构。在任何给定的t细胞中，v(d)j重组已在tra和trb处将许多可变(v)、连接(j)和多样性(d)区段中的一个连接到恒定(c)区段以产生编码由该细胞表达的α-链和β-链的基因。在该过程中，将非模板化核苷酸(n)插入指示为cdr3的区段中。cdr3的序列是用于确定克隆身份的最佳标志物。通过使用对v和c特异性的引物，可以扩增和测序含有cdr3的区段。因为存在许多不同的v区段，所以需要在pcr混合物中包括许多不同的trav和trbv引物。然而，对于任何给定的细胞，通常只有一种trav和一种trbv引物参与pcr。
通过逆转录和扩增从trc制备dna模板
以上概述概括性地描述了从单个t细胞制备两种类型的tcr转录物的dna模板的方法。这些方法使能使用仅一种扩增，这比用于从单细胞制备tcr模板的任何可用方案简单得多。另外，这些方法将逆转录步骤与扩增步骤分开，这提供了更高的特异性。在一些实施方案中，通过如下所述的引物设计进一步增强特异性。
这些方法可以以本领域技术水平内的各种方式实施。在具体的实施方案中，在c1mrnaseqhtarrayifc上进行单细胞tcr测序(sctcrseq)的目的是产生具有适当条形码和测序衔接子的800个单细胞文库，使得可以合并从ifc收集的材料，用珠清理，并直接加载到illumina测序仪上。捕获细胞后的第一步是使用c1的20个列入口将逆转录酶(rt)试剂添加到捕获的细胞中。参考图4a，rt试剂包括两种rt引物，第一种rt具有对编码t细胞受体的第一链的rna的恒定区段(cs)特异性的部分，且第二rt引物具有对于编码t细胞受体的第二链的rna的恒定区段(cs)特异性的部分。第一和第二rt引物各自另外包含第一核苷酸标签，第一核苷酸标签包含用于第一dna测序引物的第一引物结合位点，第一核苷酸标签在cs特异性部分的5'。
rt试剂包括另外类型的引物，称为“第一条形码引物”，其自3’至5’包括对第一引物结合位点特异性的部分、第一条形码核苷酸序列和第一测序衔接子。如图4a所示，在每个列中添加带有不同条形码的不同的第一条形码引物(使得每个条形码独特地标识特定的列)。trac和trbc序列与tcrα和β的mrna互补，并且在逆转录酶反应期间用作特异性引物。在图4a中所示的第一条形码引物中，rd2是illuminatruseqread2序列，bc1-20是指20种不同的条形码，且p7是illumina测序衔接子之一。p7.bc.rd2引物不参与逆转录反应，但是在那里使得在扩增步骤期间将条形码添加到扩增区段的该末端。
对于两种rt引物(trac和trbc)和第一条形码引物(p7.bc1-20.rd2，即20种不同的第一条形码引物)设计的示例性序列如下：
ac.a1:gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgaataggcagacagacttgtca(seqidno:1)
bc.a1:gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcacaccagtgtggccttt(seqidno:2)
p7.bc.rd2x:caagcagaagacggcatacgagat[条形码序列]gtgactggagttcagacgt(seqidno:3)
加入这些rt试剂后，裂解细胞，例如通过加入蛋白酶k/np-40混合物并在升高的温度(50℃)孵育。然后，将逆转录所需的另外的组分(例如，缓冲液、dntp、蛋白酶k抑制剂、逆转录酶和c1tm加载试剂(fluidigm100-5170))从共同的储库转移至捕获的细胞并进行逆转录。
该示例性方法的下一步是使用c1的40行入口添加扩增试剂。参见图4b，扩增试剂包括两组扩增引物，一组第一扩增引物，每个第一扩增引物具有对编码t细胞受体α链的rna的不同可变区段(vs)特异性的部分，和一组第二扩增引物，每个第二扩增引物具有对编码t细胞受体β链的rna的不同可变区段(vs)特异性的部分。第一和第二扩增引物各自另外包含第二核苷酸标签，其包含用于第二dna测序引物的第二引物结合位点，第二核苷酸标签在vs特异性部分的5'。
扩增试剂包括另外类型的引物，称为“第二条形码引物”，其自3’至5’包括对第二引物结合位点特异性的部分、第二条形码核苷酸序列和第二测序衔接子。如图4b所示，在每行中添加带有不同条形码的不同的第二条形码引物(使得每个条形码独特地标识特定行)。trav和trbv序列特异于可能在tcrα和β的mrna中的可变区段。因为有许多不同的可变区段，所以必须在每个捕获位点使用多个trav和trbv引物。rd1是illuminatruseqread1序列，bc1-40是指40种不同的条形码，且p5是illumina测序衔接子之一。针对两组扩增引物(38trav和31trbv)和第二条形码引物(p5.bc1-40.rd1，即40种不同的第二条形码引物)设计的示例性序列如下：
p5.bc.rd1x:aatgatacggcgaccaccgagatct[条形码序列]acactctttccctacacga(seqidno:73)
除了上述引物之外，扩增试剂还包括用于进行扩增反应的其他组分(例如，preampmastermix(fluidigm100-5581)和c1tmloadingreagent(fluidigm100-5170))。
rt引物(trac和trbc)和第一条形码(p7.bc.rd2)引物仍然存在于rt步骤中并在扩增步骤期间使用。在扩增区段的这一端上的40个条形码和在另一端上的20个条形码的组合排列为800个细胞中的每一个提供了独特的条形码身份。
在20个收集口收集的扩增子应具有以下结构：
p5-bc-rd1-v(α或β)-cdr3(α或β)-c(α或β)-rd2-bc-p7
因为每个细胞具有其自己的组合条形码，所以可以合并20个收集物，使用珠或一些其他方法纯化，并加载到illumina测序仪上以确定每个细胞的cdr3序列。通过在p7.bc.rd2引物中使用不同组的20个条形码用于另外的ifc，来自多个ifc的文库可以在测序之前汇集在一起。
在特定实施方案中，扩增反应是pcr，优选在热启动条件下进行以改善扩增特异性。
超选择性引物(superselectiveprimer)
在本文所述方法的一些实施方案中，可使用超选择性(也称为“环”)引物(marrass，vargas-goldd，tyagis，kramerfr，pct/us2014/015351，其关于超选择性引物的描述通过引用并入)进一步增强扩增特异性。图5中示意性地示出了示例性超选择性引物。锚区段(通常18-35个核苷酸)保持引物稳定地结合模板。由于未配对的插入物/环区域，诱饵区段(通常5-10个核苷酸)仅短暂地与模板杂交。偶尔，在该杂交时间期间，引物通过聚合酶延伸。诱饵区段的任何错配都会大大减少任何杂交事件的占用时间，并从而大大降低引物将被延伸的可能性。因此，应该参与引物延伸的唯一模板是具有锚序列和附近的、完全匹配的诱饵序列的模板。示例性超选择性引物可具有24个核苷酸的锚区段、14个核苷酸的插入物和5-7个核苷酸的诱饵序列。由未配对的模板核苷酸形成的环不需要与引物中的插入物长度相同。例如，与14个核苷酸的插入物相对的环可能仅含有10个核苷酸。
对于tcr测序，可以使用上文概述的相同程序，具有以下修改：tcr特异性引物包括不与tcr转录物杂交的插入物。图6a说明了超选择性引物在逆转录中的使用，而图6b说明了它们在扩增中的使用。
参照图6a，第一rt引物的cs特异性部分包括不与编码tcr的α链的rna的cs退火的插入物，和/或第二rt引物的cs特异性部分包括不与编码tcr的β链的rna的cs退火的插入物。插入物的侧翼是5'锚序列和3'诱饵序列，两者都与cs退火。优选地，第一和第二rt引物均包括插入物；在一些实施方案中，插入物在序列和/或长度方面类似或相同。
参照图6b，多个第一扩增引物的vs特异性部分包括不与编码tcr的α链的rna的vs退火的插入物，和/或多个第二扩增引物的vs特异性部分包括不与编码tcr的β链的rna的vs退火的插入物。插入物的侧翼是5'锚序列和3'诱饵序列，两者都与vs退火。优选地，第一和第二扩增引物均包括插入物；在一些实施方案中，插入物在序列和/或长度方面类似或相同。
在各种实施方案中，第一和第二rt引物可包括插入物，其中标准引物(即，无插入物)用于扩增；标准引物可与包括插入物的扩增引物一起用于逆转录；或两组引物均可包括插入物。作为后一实施方案的实例，下文给出了rt引物(1trac和1trbc)和扩增引物(41trav和31trbv)的示例性超选择性形式的序列：
使用这些超选择性引物，得到的扩增子仍然具有相同的一般结构(p5-bc-rd1-v(α或β)-cdr3(α或β)-c(α或β)-rd2-bc-p7)并且可以如上所述合并和测序。
在上述方法的某些优选实施方案中，超选择性引物用于扩增，但不用于逆转录，因为这种引物组合相当令人惊讶地增强了期望产物的产生。
在一些实施方案中，“外部”条形码引物的浓度超过“内部”靶特异性引物的浓度。例如，外部条形码引物可以比内部靶特异性引物100倍、75倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍或5倍过量使用，或以落在任何这些值界定的任何范围内的过量程度，例如30倍至50倍使用。例如，在c1芯片上的实施方案中，使用50nm的内部靶特异性引物和为40倍过量的2μm的外部条形码引物获得了良好的结果。
通过逆转录、模板转换和扩增来制备dna模板
在一些实施方案中，可以使用模板转换从单细胞制备dna模板。这种众所周知的技术在zhuyy，machlederem，chenchika等(2001)reversetranscriptasetemplateswitching：asmartapproachforfull-lengthcdnalibraryconstruction.biotechniques30：892-897中概述，其通过引用将此描述并入本文。以上概述概括性地讨论了使用模板切换制备本文所述dna模板的方法。图7说明了该技术的一个实施方案的应用，以产生特定靶转录物的dna模板(靶向转录物测序)。靶特异性引物的数量和身份由待测序的mrna确定。这些靶特异性引物通常位于其各自mrna的5'末端附近。在图7中，rt引物显示带有插入物，但也可以使用无插入物的引物。逆转录酶延伸靶特异性引物，然后利用模板转换机制，复制模板转换寡核苷酸(rd1-umi-ggg)中的信息。通过掺入umi，可以获得针对靶向mrna的更准确的定量信息。“ggg”表示寡-ribog序列。最典型地，在模板转换寡核苷酸中使用三个鸟嘌呤，但可以使用任何有效的数目。一个或更多个鸟嘌呤可以是锁核酸(lna)。
通过使用rt引物，该方法可以适用于全转录物组测序，其中靶特异性部分被对mrna分子的poly-a尾特异性的部分(例如，poly-dt)替换。在任一情况下，可以扩增模板并使用条形码引物诸如以上描述的那些(例如，p5-bc-rd1和rd2-bc-p7)添加条形码和测序衔接子，然后如上所述进行合并和测序。如果进行全转录物组测序，则可以使用标准生物信息学方法从所得数据集确定tcr和ig序列，从而避免对上述专门的单细胞tcr或ig转录物测序方法的需要。示例性的生物信息学方法见于natmethods.2016apr；13(4)：329-32.doi：10.1038/nmeth.3800.epub2016年5月7日.tcellfateandclonalityinferencefromsingle-celltranscriptomes.stubbingtonmj，
可选地，靶向转录物测序或转录物组测序中的任一者或两者可与上述单细胞tcr或ig转录物测序方法组合。
在一些实施方案中，使用模板转换寡核苷酸提供了另一种获得tcr/ig序列信息的机制。在这种情况下，逆转录步骤将用trac引物、trbc引物、任选地用于另外的mrna的靶或多聚a特异性引物、p7.bc.rd2引物和模板转换寡核苷酸进行。将trac和trbc引物延伸至tcrmrna的5'末端，然后进行模板转换。对于扩增步骤，所有需要添加的是包括p5.bc.rd1引物的扩增试剂。不需要添加所有不同的trav和trbv引物。如果需要，可以增加测序循环的数量以确定获得cdr3序列。
在特定实施方案中，模板转换方法在微流体装置中进行，如上所述。在这种情况下，rt引物可以经一组输入线递送到捕获位点，且5’寡核苷酸可以经由另一组输入线递送到捕获位点。
ig转录物产生
天然抗体通常具有两条相同的ig重链。通过体细胞重组以与以上对tcr描述的类似的方式从多个可能的v、d、j和c区段组装每个ig重链基因。重链重排的实例显示在图8a中。存在多个不同c区段(编码恒定区)，产生不同同种型。天然抗体通常还具有两条相同的ig轻链，其可以是κ轻链或λ轻链。通过体细胞重组从多个可能的v、j和c区段组装每个ig轻链基因。κ轻链重排的一个实例如图8b所示。如本领域技术人员容易理解的，也可以进行本文关于测序tcr转录物描述的策略以简单地通过设计与ig的v和c区退火而不是tcr的v和c区域退火的引物来进行ig转录物的测序。
dna测序
在一些实施方案中，本文所述的方法包括使产生的dna模板经受dna测序，例如sanger测序、下一代测序(例如桥式测序)或第三代测序。在此类实施方案的变化形式中，可以基于一个或两个条形码鉴定从dna测序获得的序列为来源于特定捕获位点。
如上所述，来自矩阵型微流体装置的特定行或列的反应产物可作为池输出。反应产物的任何后续表征，例如dna测序，可以在单个出口池中进行。然而，还预期可以在进一步表征之前合并池本身。在这种情况下，来自微流体装置中的每个单独捕获位点的dna模板通常是不同的，这可以容易地实现，例如通过使用两个条形码序列来编码微流体装置中捕获位点的行和列位置。
在一些实施方案中，在进行dna测序之前进一步扩增反应产物是有利的。当所有反应产物具有共同的末端序列时，可以将所有待测序的反应产物合并并使用对末端序列特异的引物(即，在制备上述tcr模板的说明性实施方案中，将使用p5和p7引物)一起扩增。
引物组合
可以组合上述任何引物或寡核苷酸以形成引物组合。通常，引物组合包括2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多种引物或寡核苷酸，它们在诸如本文所述的方法中一起使用。当在反应中作为一组使用时，单独的引物可以单独包装或包装在一起。例如，当引物用于对tcr或ig测序时，所有可能的可变区段特异性引物的组被方便地包装在一起。
试剂盒
根据本发明的试剂盒可以包含对于实践本文描述的一种或更多种方法有用的一种或更多种试剂。试剂盒通常包含具有一个或更多个容器的包装，所述一个或更多个容器容纳试剂作为一种或更多种单独的组合物，或任选地，在试剂的相容性将允许的情况下，作为混合物。试剂盒还可包括从用户角度是能是期望的其他材料，诸如缓冲液、稀释剂、标准品和/或在样品处理、洗涤、或进行测定的任何其他步骤中有用的任何其他材料。在具体的实施方案中，试剂盒包含以上讨论的一种或更多种矩阵型微流体装置和/或引物/寡核苷酸或其组合。
应当理解的是，本文描述的实施例和实施方案仅用于示例性的目的，并且为本领域技术人员教导了根据其的各种修改或改变，并被包括在本申请的精神和范围及所附的如权利要求的范围内。
另外，本文引用的所有其他出版物、专利和专利申请通过引用以其整体为了所有目的并入本文。
实施例
实施例1:超选择性引物用于产生t细胞受体模板的用途
rt引物组1(rt-无环)是ac.a1和bc.a1的混合物。rt引物组2(rt-环)是ac.l1和bc.l1的混合物。v引物组1(v-无环)是以下的混合物：av01.a1、av02.a1、av03.a1、av04.a1、av05.a1、av06.a1、av07.a1、av08.a11、av08.a12、av08.a13、av09.a1、av10.a1、av12.a1、av13.a11、av13.a12、av14.a1、av16.a1、av17.a1、av18.a1、av19.a1、av20.a1、av21.a1、av22.a1、av23.a1、av24.a1、av25.a1、av26.a11、av26.a12、av27.a1、av29.a1、av30.a1、av34.a1、av35.a1、av36.a1、av38.a1、av39.a1、av40.a1、av41.a1、bv02.a1、bv03.a1、bv04.a1、bv05.a11、bv05.a12、bv06.a11、bv06.a12、bv07.a11、bv07.a12、bv07.a13、bv07.a14、bv09.a1、bv10.a11、bv10.a12、bv10.a13、bv11.a1、bv12.a11、bv12.a12、bv13.a1、bv14.a1、bv15.a1、bv16.a1、bv18.a1、bv19.a1、bv20.a1、bv24.a1、bv25.a1、bv27.a1、bv28.a1、bv29.a1和bv30.a1。v引物组2(v-环)是以下的混合物：av01.l1、av02.l1、av03.l1、av04.l1、av05.l1、av06.l1、av07.l2、av08.l11、av08.l12、av08.l13、av08.l14、av9.l11、av9.l12、av10.l1、av12.l11、av12.l12、av12.l13、av13.l11、av13.l12、av14.l1、av16.l1、av17.l1、av18.l1、av19.l1、av20.l1、av21.l1、av22.l1、av23.l1、av24.l1、av25.l1、av26.l11、av26.l12、av27.l1、av29.l1、av30.l1、av34.l1、av35.l1、av36.l1、av38.l1、av39.l1、av40.l1、av41.l1、bv02.l1、bv03.l1、bv04.l1、bv05.l11、bv05.l12、bv06.l11、bv06.l12、bv07.l11、bv07.l12、bv07.l13、bv07.l14、bv09.l1、bv10.l11、bv10.l12、bv10.l13、bv11.l1、bv12.l11、bv12.l12、bv13.l1、bv14.l1、bv15.l1、bv16.l1、bv18.l1、bv19.l1、bv20.l1、bv24.l1、bv25.l1、bv27.l1、bv28.l1、bv29.l1和bv30.l1。在下面描述的实验中，这些引物以下列组合使用：
1：无环rt引物与无环v引物
2：环rt引物与无环v引物
3：无环rt引物与环v引物
4：环rt引物与环v引物
逆转录酶反应体系包含来自人外周血单核细胞(pbmc)的100ng总rna、220nm每种rt引物(rt-无环或rt-环)、15mmtris-hcl，ph8.4、75mmkcl、10mmmgcl2、5％(v/v)甘油、10mm二硫苏糖醇、0.8单位/μlrnaseouttm(thermofisherscientific)、500μm每种dntp和8单位/μl
结果示于图9中。来源于tcr转录物的期望dna片段的大小范围为250至350个核苷酸。不需要的非特异性片段的大小范围为100至220个核苷酸。对于组合3，观察到期望片段与不期望的片段的最佳比率，组合3为无环rt引物和环v引物。
实施例2：固定增强从rna转录物产生的dna模板的回收
使用磁珠纯化富集人外周血单核细胞(pbmc)的cd4+细胞。通过添加2μg/ml植物凝集素(pha)激活重悬在含有il-2和il-7的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中的沉淀细胞。激活五天后，洗涤细胞并再次使用磁珠纯化富集cd4+细胞。将这些细胞的两个等分试样沉淀。将指定为新鲜的细胞重悬于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。将指定为固定的细胞重悬于含有1mg/ml3,3'-二硫代二丙酸二(n-羟基琥珀酰亚胺酯)(dsp，sigma-aldrich)的pbs中。将800个新鲜或固定的细胞沉淀并重悬于5.5μl裂解混合物中，该混合物由50mmtris-hcl，ph8.4、40mm二硫苏糖醇、0.5％np-40去污剂、8单位/ml蛋白酶k(newenglandbiolabs)、230nm每种rt-无环引物、9.2μmp7.rccbc001.rd2x引物(caagcagaagacggcatacgagatcgcgactgaagtgactggagttcagacgt)(seqidno：149)和1×c1加载试剂(fluidigm)组成。将这些反应体系在50℃孵育30分钟，在72℃孵育1分钟，然后置于冰上。向每个反应体系中加入6μl的rt混合物，使得最终浓度为15mmtris-hcl，ph8.4、75mmkcl、10mmmgcl2、5％(v/v)甘油、360μmaapf蛋白酶k抑制剂(emdmillipore)、500μm每种dntp、8单位/μl
使用highsensitivitydna试剂盒在2100bioanalyzer系统上分析每个样品的1μl等分试样。结果示于图10中。由于添加了p5、p7和其他序列，来源于tcr转录物的期望dna片段的大小范围为320至400个核苷酸。结果表明，固定细胞比新鲜细胞产生更好得多的期望片段产量。
实施例3：使用c1mrnaseqhtarrayifc产生单细胞t细胞受体模板
在下面的程序中，任何对标准方案的提及是指“使用c1高通量ifc产生用于mrna测序的单细胞cdna文库”(fluidigmpn100-9886)。本文档还提供了仪器操作的详细信息。
储液
5×rt缓冲液
75mmtris-hcl，ph8.4
375mmkcl
50mmmgcl2
25％甘油(50％，teknovag1796、g1797、g1798、g1799)
18mmaapf蛋白酶k抑制剂
将10mgaapf蛋白酶k抑制剂溶于1mldmso中
储存在-20℃
c1混合物
20×列混合物
混合物：
187.5μl细胞漂洗试剂(fluidigm)
12.5μlc1加载试剂(fluidigm100-5170)
向20个孔中的每个孔分配8μl
添加2μl100μmp7.rccbc001-020.rd2x，每孔加入不同的条形码
在设置引发(prime)步骤期间，将8μl的每一种转移到标记为“列入口”的20个入口中的每一个。条形码混合物的添加实际上将在细胞染色后发生。
裂解混合物(163.5μl)
15μl1mtris-hcl，ph8.4
12μl1m二硫苏糖醇
15μl10％np-40(最终rxn中0.5％)
6.9μl10μm每种rt-无环引物
3μl800单位/ml(20mg/ml)蛋白酶k(最终rxn中8单位/ml)
8.2μlc1加载试剂(fluidigm100-5170)
103.4μlh2o
在设置最终反应体系期间，将130μl裂解混合物转移到入口l2(大容器)。
rt混合物(26μl)
10μl5×rt缓冲液
1μl25mm每种dntp
1μl18mmaapf蛋白酶k抑制剂(最终rxn中360μm)
1μl200单位/μl
1.3μlc1加载试剂(fluidigm100-5170)
11.7μlh2o
在设置最终反应体系期间，将20μlrt混合物转移至入口rt。
40×行混合物
pcr混合物(225μl)
130μl5×preampmastermix(fluidigm100-5581)(最终rxn中1×)
65μl500nm每种v-环引物(最终rxn中每种引物50nm)
18μlc1加载试剂(fluidigm100-5170)
12μlh2o
将5μlpcr混合物分配到40个孔中的每一个中
添加2.9μl10μmp5.rcrbc001-040.rd1x，每孔添加不同的条形码
在设置最终反应体系期间，将5μl的每一种转移至标记为“行条形码”的入口。
收集混合物(200μl)
194μlc1收集试剂(fluidigm100-7081)
6μl10mg/ml酵母trna(thermofisherscientificam7119)
在设置最终反应体系期间，180μl到每个收集入口。
c1步骤
1.引发：
a.遵循标准引发加载图，用移液器吸取混合物。对于阀流体(valvefluid)，添加吐温20至最终浓度为0.05％，并向acc1和acc2各加载250μl。
b.用移液器吸取8μl每种列混合物至20个列入口
c.运行引发脚本：“mrnaseqprimer&cbarcode”。～51分钟
2.细胞装载：
a.按照标准方案更换液体
b.将列混合物保留在20个列入口中
c.使用按实施例2中所述制备的活化的、dsp固定的cd4+t细胞，将20μl细胞悬浮液分配至两个细胞入口中的每一个
d.如果你想要细胞加载和染色：运行脚本“mrnaseqht:cellload&stainwithcolumnbarcode”～39分钟
e.如果你只想要细胞加载和洗涤：运行脚本“mrnaseqht:cellloadwithcolumnbarcode”～9分钟
3.最终反应：
a.按照标准方案更换与细胞相关的液体。
b.用移液器吸取裂解混合物到l2区(右上角)，～130μl
c.用移液器吸取rt混合物到rt入口，约20μl
d.用移液器吸取含有条形码引物的pcr混合物到40个行入口中，各～5μl
e.在将ifc插入机器之前，检查全部试剂，例如收集试剂。
f.运行脚本“sctcrseqht”～6小时。像往常一样设定时间延迟。
最终反应由以下组成：
1.对于室0+1的裂解混合物
50℃，30分钟(1800秒)
72℃，1分钟(60秒)
10℃，1分钟(60秒)
2.对于室0+1+2的rt混合物
42℃，60分钟(3600秒)
85℃，5分钟(300秒)
3.对于室0+1+2+3的pcr混合物
70℃，30分钟(1800秒)
95℃，5分钟(300秒)
20个循环：96℃，20秒
60℃，6分钟(360秒)
4.收集
将20个收集样品转移到96孔板中。
合并每种样品5μl。
使用80μlampurexp珠进行清理。用50μl10mmtris-hcl，ph8.0、0.1mmedta洗脱。
使用40μlampurexp珠进行清理。用20μl10mmtris-hcl，ph8.0、0.1mmedta洗脱。
加入：
2.5μl10μmp5引物
2.5μl10μmp7引物
25μl
98℃，30秒
20个循环：98℃，10秒
62℃，2分钟
75℃，2分钟
4℃，保持
使用35μlampurexp珠进行清理。用20μl10mmtris-hcl，ph8.0、0.1mmedta洗脱。
前面没有给出的引物序列如下：
以下是使用该方案分析的单个刺激的cd4+t细胞中检测到的αcdr3序列的实例：
上行是通过测序确定的dna序列。下行是推断的氨基酸序列。当通过类似于natbiotechnol.2014jul；32(7):684-92,“linkingt-cellreceptorsequencetofunctionalphenotypeatthesingle-celllevel,”hana,glanvillej,hansmannl,davismm中描述的方法分析来自相同群体的单细胞时，检测到相同的cdr3序列。
实施例4：使用c1mrnaseqhtarrayifc产生单细胞t细胞受体+靶转录物模板
该方案与实施例3中的相同，不同之处在于将靶rt引物添加至裂解混合物中，并将模板转换寡聚物(tso)添加至rt混合物。修改后的配方如下所示：
裂解混合物(163.5μl)
15μl1mtris-hcl，ph8.4
12μl1m二硫苏糖醇
15μl10％np-40(最终rxn中0.5％)
6.9μl10μm每种rt-无环引物
6.9μl10μm每种靶rt引物
3μl800单位/ml(20mg/ml)蛋白酶k(最终rxn中8单位/ml)
8.2μlc1加载试剂(fluidigm100-5170)
96.5μlh2o
在设置最终反应体系期间，将130μl裂解混合物转移到入口l2(大容器)。
rt混合物(26μl)
10μl5×rt缓冲液
5μl20μmtso.rd1.1
1μl25mm每种dntp
1μl18mmaapf蛋白酶k抑制剂(最终rxn中360μm)
1μl200单位/μl
1.3μlc1加载试剂(fluidigm100-5170)
6.7μlh2o
在设置最终反应体系期间，将20μlrt混合物转移至入口rt。
模板转换寡核苷酸tso.rd1.1的序列是/5'-生物素/rarcrarcrurcrurururcrcrcrurarcrarcrgrarcrgrcrurcrururcrcrgrarurcrurnrnrnrhrhrhrhrgrgrg/3'-氨基修饰物/，r表示核糖核苷酸，rn是ra、rc、rg、或ru，且rh是ra、rc、或ru(seqidno：214)。用于96个靶转录物的靶rt引物的序列是：
实施例5：使用发夹引物产生单细胞t细胞受体模板
该实施例描述了对被设计为用于管的单细胞t细胞受体模板的产生的示例性方法的修改以适用于fluidigm的c1tm高通量ifc(“ht-ifc”)。
被设计为用于管的方法在图11a-11b中示意性地示出。在逆转录酶(rt)步骤(图11a)期间，引物rd2.trac和rd2.trbc分别与tcrα和β的mrna杂交，并延伸以产生tcr特异性cdna。引物rd2.n7.t20vn(图11a中的rd2-umi-寡聚dt)从样品中的所有polya+mrna产生cdna。引物p7.rccbc001.rd2x(图11a中的p7-cbc1-20-rd2)存在于反应中，但直到pcr步骤才被使用。在pcr的初始循环期间(图11b)，引物rd1.trav.l1(42种不同的引物；图11b中的rd1-trav)、rd1.trbv.l1(31种不同的引物；图11b中的rd1-trbv)和rd1.target.l1(96种不同的引物；图11中的rd1-靶)分别在tcr-αcdna、tcr-βcdna和96种靶cdna上产生引物延伸产物。为了增强特异性，将这些引物设计为超、选择性引物(marrass，vargas-goldd，tyagis，kramerfr，pct/us2014/015351；vargasdy，kramerfr，tyagis，marrassa，“multiplexreal-timepcrassaysthatmeasuretheabundanceofextremelyraremutationsassociatedwithcancer,”plosone11:e0156546,2016)。此时，dna链具有rd1或rd25'尾，并且可以用外部引物p5.rcrbc001.rd1x(图11b中的p5-rbc11-40-rd1)和p7.rccbc001.rd2x(图11b中的p7-cbc11-20-rd2)扩增。该程序产生的文库大小绝大多数为350-450bp。当测序时，这些文库产生期望的数据，即tcr序列和来自96个靶转录物的序列。
然而，当该程序与htifc一起使用时，文库包括显著百分比的通常小于350bp的非特异性片段。这似乎是由于pcr试剂与rt反应体系的次优混合。在pcr混合物中，引物p5.rcrbc001.rd1x(或其条形码对应物之一)以高浓度与dna聚合酶和pcr所需的所有其他组分一起存在。当pcr混合物被加载到ifc中时，与rt反应体系的混合主要通过扩散发生。因为rt反应体系中的引物比cdna小，所以这些引物扩散得更快，并且首先遇到p5.rcrbc001.rd1x和pcr混合物中的其他引物。因此，包括多种引物的假产物(spuriousproduct)在产生包括cdna的任何特异性产物之前都有机会形成。通过将引物p5.rcrbc001.rd1x移至rt反应体系可以部分地克服该问题。当完成该操作时，htifc中产生的文库确实具有在350-450bp大小范围内的期望的产物，但仍有许多250bp和更小的非特异性产物。
产生残留的非特异性产物似乎是由于pcr期间使用的再水化步骤。在针对htifc开发的标准mrna测序方案中，每隔一个pcr循环进行再水化。在tcr方案中，通过将再水化从每隔1个循环改变为每隔3个循环，特异性产物(350至450bp)与非特异性产物(小于250bp)的比率提高。虽然增加到每隔7个循环再水化更多地提高了比率，但效果是微不足道的。一种解释是，当反应降低至25℃时，引物有机会形成非特异性产物。期望要的是在较低温度将引物“关闭”的方法。这是通过使用发夹引物完成的，每个发夹引物由通过环连接的平末端、自身互补的茎(“茎-双链体”)组成(laokq，strausna，livakkj，“hotstartreversetranscriptionbyprimerdesign”，美国专利8,993,240)。发夹引物的使用解决了另一个问题。在rt反应中具有太多引物也可导致非特异性产物的形成。这里使用的发夹被设计为在rt反应的42℃关闭，但在pcr中使用的62℃退火温度打开。因此，在rt反应期间或在pcr中的再水化步骤期间，当ht-ifc的温度降低至25℃时，这些引物不起作用。
用发夹形式(表示为.hp)替换以下引物：p5.rcrbc001-040.rd1x(40种引物)、p7.rccbc001-020.rd2x(20种引物)、rd1.trav.l1(42种引物)、rd1.trbv.l1(31种引物)和rd1.target.l1(96种引物)。使用这些引物的.hp形式，在ht-ifc中从被捕获在htifc中的单细胞产生大小范围为350-450bp的特异性tcr文库，仅具有最小量的非特异性片段。该策略在图12a-12b中示意性地示出。从刺激的cd4+或cd8+t细胞的混合池制备tcr文库。根据下面给出的方案，大约400个dsp固定的单细胞被捕获在htifc上并被处理。如图13所示，该方法产生的文库大小绝大多数为350-450bp。
方案：
购买
thermofisherscientific
18064-014
10％np-40
pi-28324
dntp混合物，每种25mm
ferr1121
酵母trna(10mg/ml)
am7119
newenglandbiolabs
蛋白酶k
p8107s
m0543s
emdmillipore
aapf蛋白酶k抑制剂
539470
teknova
1mtris-hcl，ph8.4
t1084
1mdtt(二硫苏糖醇)
d9750
dna悬浮缓冲液
t0221
beckmancoμlter
ampurexp珠
a63880
储液
5×rt缓冲液
75mmtris-hcl，ph8.4
375mmkcl
50mmmgcl2
25％甘油(50％，teknovag1796、g1797、g1798、g1799)
18mmaapf蛋白酶k抑制剂
将10mgaapf蛋白酶k抑制剂溶于1mldmso中
储存在-20℃
c1混合物
20×列混合物
混合物：
187.5μl细胞漂洗试剂(fluidigm)
12.5μlc1tm加载试剂(fluidigm100-5170)
向20个孔中的每个孔中分配8μl
加入2μl50μmp7.rccbc001-020.rd2x.hp(pcr中1μm)，每孔加入不同的条形码
在细胞装载和染色之前，将每种9μl的转移至标记为“列入口”的20个入口中的一个。条形码混合将在细胞染色后发生。
2×裂解混合物(245.4μl)
45μl1mtris-hcl，ph8.4
36μl1mdtt
45μl10％np-40(最终rxn中0.5％)
20.7μl10μm每种ac.a1/bc.a1引物(rtrxn中110nm)
18.9μl10μmrd2.n7.t20vn(rt循环中100nm)
9μl800单位/ml(20mg/ml)蛋白酶k(最终rxn中8单位/ml)
33.8μlc1tm加载试剂(fluidigm100-5170)
37μlh2o
40×行混合物
将5μl2×裂解混合物分配到40个孔中的每个孔中
加入5μl17μmp5.rcrbc001-040.rd1x.hp(pcr中1μm)，每孔加入不同的条形码
将每种9μl转移至标记为“行条形码”的入口
rt混合物(26μl)
10μl5×rt缓冲液
1μl25mm每种dntp
1μl18mmaapf蛋白酶k抑制剂(最终rxn中360μm)
1μl200单位/μlsuperscriptii逆转录酶
1.3μlc1tm加载试剂(fluidigm100-5170)
11.7μlh2o
将20μlrt混合物转移至入口rt
pcr混合物(150μl)
54.6μl5×preampmastermix(fluidigm100-5581)
2.7μl5μm每种trav.l1.hp/trbv.l1.hp引物(最终rxn中每种引物50nm)
2.7μl5μm每种靶.l1.hp引物(最终rxn中每种引物50nm)
7.5μlc1tm加载试剂(fluidigm100-5170)
82.5μlh2o
将130μlpcr混合物转移至入口l2(大储库)。
收集混合物(200μl)
194μlc1收集试剂(fluidigm100-7081)
6μl10mg/ml酵母trna
180μl到收集入口
c1步骤
1.引发：
a.遵循sctcrsmall_v1xxv5引发加载图，用移液器吸取混合物。对于阀流体，添加吐温20至终浓度为0.05％，或使用阀门流体v2。
b.用移液器吸取9μl每列混合物至20个列入口
c.运行引发脚本：“sctcrsmall:26minprimewithcolumnbarcode(1911x)”
2.细胞装载：
a.遵循sctcrsmall_v1xxv5更换液体。
b.将列混合物保留在20个列入口中
c.将20μl细胞悬浮液分配到两个细胞入口中的每一个
d.将20μl细胞漂洗试剂分配到两个细胞染色入口中的每一个
e.运行脚本“sctcrsmall:36min,cellloadwithcolumnbarcode(1911x)”
3.最后的反应：
a.遵循sctcrsmall_v1xxv5更换细胞相关的液体。
b.用移液器吸取裂解混合物到40个行入口中，各～9μl
c.用移液器吸取rt混合物到rt入口，～20μl
d.用移液器吸取pcr混合物到l2区(右上角)，～130μl
e.在将ifc插入机器之前，检查全部试剂，例如收集试剂。
f.运行脚本“sctcrsmall:7hr50minchemistryv5d(1911x)”。像往常一样设置时间延迟。
最终反应由以下组成：
1.对于室0+1的裂解混合物
50℃，30分钟(1800秒)
72℃，1分钟(60秒)
10℃，1分钟(60秒)
2.对于室0+1+2的rt混合物
42℃，90分钟(5400秒)
85℃，5分钟(300秒)
3.对于室0+1+2+3的pcr混合物
95℃，2分钟(120秒)
22个循环：95℃5秒
62℃，5分钟(300秒)
4.收集
c1后步骤
将20个收集样品转移到96孔板中。
合并2.5μl每种样品。
使用40μlampurexp珠进行清理。用50μldna悬浮缓冲液洗脱。
使用40μlampurexp珠进行清理。用20μldna悬浮缓冲液洗脱。
加入：
2.5μl10μmp5引物
2.5μl10μmp7引物
25μlq5hotstarthifipcrmastermix
98℃30秒
21个循环：98℃，10秒
62℃，2分钟
75℃，2分钟
4℃，保持
用35μlampurexp珠清理。用30μldna悬浮缓冲液洗脱。
用21μlampurexp珠清理。用20μldna悬浮缓冲液洗脱......
在bioanalyzer上检查1μl。
引物：
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