丝氨酸蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸的制作方法

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：从含淀粉材料生产发酵产物(如乙醇)是本领域中熟知的。通常使用两种不同种类的方法。最常使用的方法通常被称作“传统方法”，包括在高温时典型地使用细菌α-淀粉酶液化经糊化的淀粉，随后在葡糖淀粉酶和发酵生物的存在下进行同时糖化和发酵。另一种熟知的方法通常被称作“生淀粉水解”-方法(rsh方法)，包括典型地在酸性真菌α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的存在下在低于初始糊化温度处将颗粒淀粉同时糖化和发酵。美国专利号5,231,017-a披露了在乙醇发酵期间在包含用α-淀粉酶液化经糊化的淀粉的方法中酸性真菌蛋白酶的用途。wo2003/066826披露了生淀粉水解方法(rsh方法)，该生淀粉水解方法在真菌葡糖淀粉酶、α-淀粉酶和真菌蛋白酶的存在下，在非煮熟的醪液上进行。wo2007/145912披露了用于产生乙醇的方法，该方法包括在3.5至7.0的ph下并且在低于淀粉糊化温度处，将包含获得自植物材料的颗粒状淀粉的浆料与能够溶解颗粒状淀粉的α-淀粉酶接触持续5分钟至24小时的时间；获得包含大于20％葡萄糖的基质，并且在发酵生物和淀粉水解酶的存在下，在10℃和40℃之间的温度处，发酵该基质持续10小时至250小时的时间。在接触步骤期间添加的另外的酶可以包括蛋白酶。wo2014/037438披露了源自大型亚灰树花菌、变色栓菌、和污叉丝孔菌的丝氨酸蛋白酶及其在动物饲料中的用途。本发明的目的是鉴定大型亚灰树花菌s53蛋白酶的变体，与野生型亲本酶相比，这些变体将导致增加的储存稳定性(例如，增加的热稳定性)，以及提高的变体蛋白酶的表达产量。本发明提供了与其亲本相比具有改进的特性的蛋白酶变体。技术实现要素：在第一方面，本发明涉及蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置1、5、9、25、29、30、32、38、39、40、41、42、45、46、49、50、53、54、55、57、59、60、61、62、64、67、68、69、74、76、77、78、79、80、81、82、87、93、94、96、99、102、103、105、109、111、112、114、115、117、122、123、124、128、130、136、141、142、145、146、147、150、153、154、157、159、161、167、169、175、182、185、199、200、205、207、209、210、213、216、217、225、228、231、234、237、242、244、245、246、248、258、262、266、267、269、271、272、276、278、280、284、289、293、296、299、305、308、313、314、317、318、319、321、322、324、325、326、329、330、331、333、336、338、341、343、345、347、348、355、358、359、361、362、363和364处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体与seqidno:3的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体与seqidno:3的蛋白酶相比具有作为改进因子hif测量的增加的热稳定性。在第二方面，本发明涉及蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置20、27、29、34、40、42、45、46、50、53、54、55、58、59、60、61、62、66、69、76、81、87、93、96、98、101、102、103、109、110、115、117、122、124、125、127、128、130、136、141、142、145、146、148、149、150、153、154、157、159、161、164、167、182、183、184、185、188、199、200、207、208、209、210、211、213、216、219、228、231、237、244、249、252、253、261、266、267、272、275、276、277、280、285、288、291、292、293、294、296、299、303、304、305、306、307、308、310、317、318、319、321、326、327、336、338、341、344、345、348、356、358、359、361、362、363和364处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体与seqidno:3的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体与seqidno:3的蛋白酶相比具有作为改进因子aif测量的增加的比活性。在第三方面，本发明涉及在蛋白酶变体，其对应于seqidno:3的多肽的位置2、17、22、41、41、42、45、46、54、55、57、59、60、61、62、63、64、66、69、80、82、84、87、98、99、102、103、112、114、115、129、131、134、149、159、167、169、199、200、205、207、209、211、213、217、242、250、266、267、269、270、271、272、274、278、279、280、284、288、291、292、294、296、301、307、314、329、331、333、336、362和363处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体与seqidno:3的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体与seqidno:3的蛋白酶相比具有作为改进因子eif测量的增加的表达水平。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。在另一方面，本发明涉及包含本发明的变体的组合物。本发明还涉及一种用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，该方法包括使用产碳水化合物源的酶和发酵生物，在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度处，在变体蛋白酶的存在下将含淀粉材料同时糖化和发酵。在另一方面，本发明涉及用于由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；(b)使用葡糖淀粉酶使在步骤(a)中获得的液化材料糖化；(c)使用发酵生物进行发酵；其中本发明的变体蛋白酶在步骤b)和/或c)期间存在。定义蛋白酶：术语“蛋白酶”(也称为肽酶、蛋白酶、肽水解酶或蛋白水解酶)意指催化肽键的裂解的蛋白水解活性(ec3.4)。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定丝氨酸蛋白酶活性。在一方面，本发明的变体具有seqidno:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的蛋白酶活性。蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白质水解活性(ec3.4)。存在若干种蛋白酶活性类型，例如在arg和lys残基的羧基末端侧切割的胰蛋白酶样蛋白酶以及在疏水性氨基酸残基的羧基末端侧切割的糜蛋白酶样蛋白酶。本发明的蛋白酶是具有酸性最适ph(最适ph<ph7)的丝氨酸内肽酶(ec3.4.21)。可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定ph值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定ph值的实例是ph2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。测定温度的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。普通蛋白酶底物的实例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的anson和mirsky方法中，将变性的血红蛋白用作底物并且在用所讨论的蛋白酶孵育测定后，确定三氯乙酸可溶的血红蛋白的量用作蛋白酶活性的量度(anson，m.l.和mirsky，a.e.，1932，j.gen.physiol.[普通生理学杂志]16:59以及anson,m.l.，1938，j.gen.physiol.[普通生理学杂志]22:79)。出于本发明的目的，使用描述于“材料与方法”中的测定确定蛋白酶活性，如动力学suc-aapf-pna测定、普罗塔酶ak(protazymeak)测定、动力学suc-aapx-pna测定以及邻苯二甲醛(opa)。对于普罗塔酶ak测定，当用该蛋白酶孵育时，不可溶普罗塔酶ak(天青精-交联的酪蛋白)底物释放蓝色并且确定该颜色作为蛋白酶活性的量度。对于suc-aapf-pna测定，当用该蛋白酶孵育时，无色的suc-aapf-pna底物释放黄色的对硝基苯胺并且确定该黄色作为蛋白酶活性的量度。内切蛋白酶/外切蛋白酶：具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶(外肽酶)或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。s53蛋白酶：术语“s53”意指选自以下的蛋白酶活性：(a)属于ec3.4.21酶组的蛋白酶；和/或(b)属于ec3.4.14酶组的蛋白酶；和/或(c)肽酶s53家族的丝氨酸蛋白酶，其包含两种不同类型的肽酶：三肽基氨肽酶(外切型)和内切肽酶；如在1993,biochem.j.[生物化学杂志]290:205-218和在merops蛋白酶数据库，发行9.4(2011年1月31日)(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于rawlings,n.d.,barrett,a.j.和bateman,a.,2010,“merops：肽酶数据库(merops:thepeptidasedatabase)”,nucl.acidsres.[核酸研究]38:d227-d233中。为了确定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和s53家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。cdna：术语“cdna”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mrna分子进行反转录而制备的dna分子。cdna缺乏可以存在于对应基因组dna中的内含子序列。初始的初级rna转录物是mrna的前体，其在呈现为成熟的剪接的mrna之前要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工。编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(如atg、gtg或ttg)开始并且以终止密码子(如taa、tag或tga)结束。编码序列可为基因组dna、cdna、合成dna或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或异源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状dna分子，所述dna分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。片段：术语“片段”意指具有在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。改进的特性：术语“改进的特性”意指与相对于亲本有所改进一种变体相关的特征。此类改进的特性包括但不限于：增加的比活性、储存条件下增加的稳定性、增加的热稳定性、以及在重组表达宿主细胞中增加的表达水平。分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如n-末端加工、c-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是seqidno:2的氨基酸199至564。seqidno:2的氨基酸1至17是信号肽，并且氨基酸18至198是前肽。根据本发明使用的成熟s53多肽的n-末端基于edmann-末端测序数据和完整的ms数据经实验证实。成熟多肽还包括seqidno:3(来自大型亚灰树花菌的成熟s53蛋白酶3)。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或多种不同的成熟多肽(即，具有不同的c-末端和/或n-末端氨基酸)的混合物。成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是seqidno:1的核苷酸595至1692。seqidno:1的核苷酸1至51编码信号肽，核苷酸52至594编码前肽。中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。在一个实施例中，一种或多种控制序列与编码本发明多肽的编码序列是异源的(不同来源/物种)。可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。亲本或亲本蛋白酶：术语“亲本”或“亲本蛋白酶”意指具有蛋白酶活性的任何多肽，对其进行改变以产生本发明的酶变体。序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)，rice等人，2000,trendsgenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版)的needle程序中所实施的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。使用needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：(同一的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)出于本发明的目的，使用如在emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)，rice等人，2000,见上文)(优选5.0.0版或更新版)的needle程序中所实施的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,见上文)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5、以及ednafull(ncbinuc4.4的emboss版)取代矩阵。使用needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：(同一的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)子序列：术语“子序列”意指具有从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺失的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。在一方面，子序列含有至少1098个核苷酸(例如，seqidno:1的核苷酸595至1692)。变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如若干个)位置处包含取代的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸。本发明的变体具有seqidno:2的成熟多肽(本文中披露为seqidno:3)的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。野生型蛋白酶：术语“野生型”蛋白酶意指由见于自然界中的天然存在的微生物(如一种细菌、酵母或丝状真菌)表达的蛋白酶。变体命名规则出于本发明的目的，将seqidno:2中包含的成熟多肽用以确定另一种蛋白酶中的对应的氨基酸残基。将另一种蛋白酶的氨基酸序列与seqidno:2中包含的成熟多肽(本文中披露为seqidno:3)进行比对，并且基于该比对，使用如在emboss包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件，rice等人，2000，trendsgenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的needle程序中所实施的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch，1970，j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与披露为seqidno:3的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是空位开放罚分10、空位扩展罚分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种蛋白酶而不是大型亚灰树花菌s53蛋白酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于muscle(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；edgar，2004，nucleicacidsresearch[核酸研究]32:1792-1797)、mafft(版本6.857或更新版本；katoh和kuma，2002，核酸研究30:3059-3066；katoh等人，2005，核酸研究33:511-518；katoh和toh，2007，bioinformatics[生物信息学]23:372-374；katoh等人，2009，methodsinmolecularbiology[分子生物学方法]537:39-64；katoh和toh，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用clustalw(1.83或更新版本；thompson等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的embossemma。当其他酶与seqidno:2的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(lindahl和elofsson，2000，j.mol.biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可以使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序采用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，psi-blast程序通过迭代数据库搜索过程来产生谱，并且能够检测远距离同源物(atschul等人,1997,nucleicacidsres.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，甚至可以实现更高的敏感度。程序，例如genthreader(jones,1999,j.mol.biol.[分子生物学杂志]287:797-815；mcguffin和jones,2003,bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自不同来源(psi-blast、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，gough等人,2000,j.mol.biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于scop数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的scop超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法例如距离比对矩阵(holm和sander,1998,proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(shindyalov和bourne,1998,proteinengineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，holm和park,2000,bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。在描述本发明的变体时，为了便于参考，采用下文描述的命名法。采用了已接受的iupac单字母和三字母的氨基酸缩写。取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“thr226ala”或“t226a”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“gly205arg+ser411phe”或“g205r+s411f”表示在位置205和位置411处的甘氨酸(g)和丝氨酸(s)分别被精氨酸(r)和苯丙氨酸(f)取代。缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原有氨基酸、位置、*。因此，缺失在位置195处的甘氨酸命名为“gly195*”或“g195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“gly195*+ser411*”或“g195*+s411*”。插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“gly195glylys”或者“g195gk”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“gly195glylysala”或“g195gka”。在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：亲本：变体：195195195a195bgg-k-a多个改变.包含多个改变的变体由加号(“+”)分开，例如“arg170tyr+gly195glu”或“r170y+g195e”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。不同改变.在可以在一个位置引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分隔，例如，“arg170tyr,glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“tyr167gly,ala+arg170gly,ala”指定以下变体：“tyr167gly+arg170gly”、“tyr167gly+arg170ala”、“tyr167ala+arg170gly”、和“tyr167ala+arg170ala”。具体实施方式本发明涉及蛋白酶变体，其在对应于seqidno:2(亲本蛋白酶)的成熟多肽的特定位置的一个或多个(例如若干个)位置处包含取代，其中该变体具有蛋白酶活性。如本文所解释的，在成熟亲本蛋白酶不同于seqidno:3的情况下，特定位置编号可以改变。本发明变体的改进的特性属于以下类别，例如增加的比活性、增加的稳定性，例如增加的储存稳定性或增加的热稳定性(如实例中描述的测量为热应力后半衰期的增加(60℃下5分钟))，以及在重组表达宿主细胞中增加的表达水平。变体本发明提供蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置1、5、9、25、29、30、32、38、39、40、41、42、45、46、49、50、53、54、55、57、59、60、61、62、64、67、68、69、74、76、77、78、79、80、81、82、87、93、94、96、99、102、103、105、109、111、112、114、115、117、122、123、124、128、130、136、141、142、145、146、147、150、153、154、157、159、161、167、169、175、182、185、199、200、205、207、209、210、213、216、217、225、228、231、234、237、242、244、245、246、248、258、262、266、267、269、271、272、276、278、280、284、289、293、296、299、305、308、313、314、317、318、319、321、322、324、325、326、329、330、331、333、336、338、341、343、345、347、348、355、358、359、361、362、363和364处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性。在一个实施例中，这些变体与seqidno:3的蛋白酶相比具有作为改进因子hif测量的增加的热稳定性。在一个实施例中，该变体与成熟亲本蛋白酶的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:3的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在一方面，在本发明的变体中的取代数目是1至20，例如1至10和1至5，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。在一个特定的方面，本发明涉及一种蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置1、5、9、25、29、30、32、38、39、40、41、42、45、46、49、50、53、54、55、57、59、60、61、62、64、67、68、69、74、76、77、78、79、80、81、82、87、93、94、96、99、102、103、105、109、111、112、114、115、117、122、123、124、128、130、136、141、142、145、146、147、150、153、154、157、159、161、167、169、175、182、185、199、200、205、207、209、210、213、216、217、225、228、231、234、237、242、244、245、246、248、258、262、266、267、269、271、272、276、278、280、284、289、293、296、299、305、308、313、314、317、318、319、321、322、324、325、326、329、330、331、333、336、338、341、343、345、347、348、355、358、359、361、362、363和364处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体与seqidno:3的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体与seqidno:3的蛋白酶相比具有作为改进因子hif测量的增加的热稳定性。更具体地说，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：a1t、s5i、s5k、s5l、s5y、t9h、k25p、s29i、s29p、s29r、s30e、k32w、f38l、i39g、i39l、i39v、i39y、d40f、d40g、d40h、d40n、d40p、q41i、q41v、f42c、f42k、f42s、f42y、k45l、k45m、k45y、a46c、a46e、k49p、s50c、s50i、s50l、s50m、s50q、a53c、a53e、a53v、q54i、q54l、q54m、q54v、f55h、f55l、k57p、k57s、i59g、i59m、i59p、s60p、s61l、s61p、s62c、s62n、s62p、t64g、t64i、l67v、q68v、q68y、t69c、e74h、e74r、d76l、d76r、q77l、s78d、p79y、s80l、e81a、e81h、e81k、e81l、e81p、e81y、a82f、a82l、a82m、a82p、n87s、t93l、t93s、v94s、l96w、g99c、t102l、t102v、t103i、t103k、t103v、i105q、d109h、d109k、d109m、d109y、f111h、f111k、f111s、f111y、q112r、g114l、n115a、n115c、n115k、n115p、n115r、n115t、n115y、e117d、e117g、e117h、e117n、e117q、e117s、i122k、i122r、i123a、n124l、n124v、g128a、g128e、g128f、g128l、g128s、s130d、s130g、s130l、s130n、s130p、l136k、g141t、q142a、q142f、q142l、q142n、n145v、t146a、t146i、t146l、t146n、i147s、k150f、k150l、k150r、n153a、n153l、n153m、n153p、n153r、n153y、q154a、q154i、q154l、q154m、q154n、q154t、q154v、n157i、n157l、y159h、q161e、t167f、i169f、i169s、d175i、d175n、q182c、q182t、q182v、h185p、f199l、f199m、m200s、a205s、q207h、q207l、v209f、s210t、t213l、t213r、a216r、f217i、f217y、v225y、i228l、i228t、i228w、y231i、s234q、s237f、s237q、a242i、a242l、a242v、g244s、s245p、t246s、s248y、f258p、s262p、v266k、v266r、d267a、d267h、d267l、d267n、q269l、v271r、s272i、s272k、s272l、s272r、s272t、s272v、s272y、t276l、t276y、g278p、d280n、d280s、d280t、d280y、c284a、c284g、f289y、i293t、v296a、v296i、r299n、k305s、l308v、p313l、f314i、f314l、s317e、s317n、s317w、s318p、a319f、a319q、k321l、k321q、k321s、a322d、l324q、l324s、n325l、d326p、s329c、s329h、s329i、s329l、s329n、s329t、s329v、s329w、g330q、s331w、s331y、p333r、s336k、s336n、n338m、n338q、n338r、p341s、k343a、k343h、k343s、k343t、k343v、g345s、d347i、p348y、p355i、p355r、a358l、a358p、a358r、a358y、k359l、k359s、l361m、t362l、t362n、a363g、a363l和v364i，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子hif测量的至少1.4的热稳定性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：s5k、s5l、s5y、t9h、k25p、s29r、s30e、k32w、f38l、i39g、i39l、i39v、i39y、d40f、d40g、d40h、d40n、d40p、q41i、q41v、f42c、f42k、f42s、f42y、k45l、k45m、k45y、a46c、k49p、s50i、s50l、s50m、s50q、a53c、a53e、a53v、q54i、q54l、q54m、q54v、f55h、f55l、k57p、k57s、i59g、i59m、i59p、s60p、s61l、s61p、s62c、s62n、s62p、t64g、t64i、l67v、q68v、q68y、t69c、e74r、d76l、d76r、q77l、s78d、p79y、s80l、e81a、e81h、e81k、e81l、e81p、e81y、a82m、a82p、n87s、t93l、v94s、g99c、t102l、t102v、t103i、t103k、t103v、i105q、d109h、d109k、d109m、d109y、f111h、f111k、f111s、q112r、g114l、n115c、n115k、n115r、n115t、n115y、e117d、e117g、e117h、e117n、e117q、e117s、i122r、n124l、g128f、g128s、s130g、s130n、s130p、l136k、g141t、q142a、q142f、q142l、q142n、n145v、t146a、t146l、t146n、i147s、k150l、n153m、n153p、n153r、q154i、q154l、q154n、q154t、q154v、n157l、q161e、t167f、i169f、d175n、q182c、q182t、q182v、f199l、f199m、m200s、a205s、q207h、q207l、v209f、s210t、t213r、f217i、v225y、i228l、i228t、i228w、s234q、s237f、g244s、s245p、t246s、s248y、f258p、s262p、v266k、v266r、d267a、d267h、d267l、d267n、q269l、v271r、s272k、s272l、s272r、s272v、s272y、t276y、g278p、d280n、d280s、d280t、c284g、f289y、i293t、v296a、r299n、k305s、l308v、f314l、s317e、s317w、s318p、a319f、a319q、k321l、k321q、k321s、a322d、l324q、l324s、d326p、s329c、s329h、s329i、s329l、s329n、s329w、g330q、s331w、s331y、s336k、s336n、p341s、k343a、k343h、k343s、k343t、g345s、d347i、p348y、p355i、a358l、a358p、a358r、a358y、k359l、k359s、l361m、t362l、a363g、a363l和v364i，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子hif测量的至少1.6的热稳定性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：s5k、s5l、s5y、t9h、k25p、s30e、f38l、i39g、i39l、i39v、i39y、d40f、d40g、d40h、d40n、d40p、q41i、q41v、f42k、f42y、k45l、k45m、k45y、a46c、k49p、s50i、s50l、s50m、s50q、a53c、a53e、a53v、q54l、q54m、f55h、f55l、k57p、k57s、i59g、i59m、i59p、s60p、s61p、s62n、s62p、t64g、t64i、l67v、q68v、q68y、t69c、e74r、d76l、d76r、q77l、s78d、p79y、e81a、e81k、e81l、e81p、e81y、a82p、n87s、t93l、v94s、g99c、t102l、t102v、t103i、t103k、t103v、i105q、d109h、d109k、d109m、d109y、f111h、f111k、f111s、q112r、g114l、n115r、e117g、e117h、e117n、e117q、e117s、i122r、n124l、g128s、s130g、s130n、s130p、l136k、q142a、q142l、q142n、n145v、t146a、t146l、i147s、k150l、n153m、n153r、q154i、q154l、q154n、q154t、q154v、n157l、q161e、t167f、i169f、d175n、q182c、q182v、f199l、f199m、m200s、q207h、s210t、t213r、f217i、i228l、i228t、i228w、s237f、g244s、t246s、s248y、f258p、s262p、v266k、v266r、d267a、d267h、d267n、v271r、s272k、s272l、s272r、s272v、s272y、t276y、g278p、d280n、d280s、d280t、c284g、f289y、i293t、v296a、k305s、l308v、f314l、s317e、s317w、s318p、a319f、a319q、l324s、d326p、s329c、s329i、s329l、s329n、s329w、g330q、s331w、s331y、s336n、p341s、k343h、k343s、k343t、g345s、d347i、p355i、a358p、a358r、a358y、k359l、k359s、t362l、a363l和v364i，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子hif测量的至少1.8的热稳定性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：s5k、s5y、k25p、s30e、i39g、i39l、i39y、d40f、d40g、d40h、d40n、d40p、q41i、q41v、f42k、k45m、k45y、a46c、s50i、s50l、s50m、s50q、a53c、a53v、q54m、f55h、f55l、k57p、k57s、i59m、i59p、s60p、s61p、t64i、q68v、q68y、e74r、d76l、d76r、s78d、p79y、e81a、e81k、e81l、e81p、a82p、n87s、t93l、v94s、t102l、t102v、t103i、t103k、t103v、d109h、d109k、d109m、d109y、f111h、f111k、f111s、g114l、n115r、e117g、e117h、e117n、i122r、g128s、s130g、s130n、l136k、q142l、q142n、n145v、t146a、t146l、i147s、k150l、n153m、n153r、q154l、q154n、q154t、q154v、n157l、i169f、d175n、f199l、m200s、s210t、t213r、f217i、i228l、i228w、s237f、g244s、t246s、s262p、v266k、d267h、d267n、v271r、s272l、s272v、s272y、t276y、g278p、d280s、d280t、c284g、f289y、i293t、v296a、s317e、s317w、s318p、a319f、l324s、d326p、s329c、s329i、s329w、g330q、s331y、s336n、p341s、k343t、d347i、p355i、a358p、a358r、a358y、k359l、t362l和a363l，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子hif测量的至少2.2的热稳定性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：s5k、i39g、i39l、i39y、d40h、f42k、k45m、a46c、s50i、s50m、a53c、q54m、f55h、f55l、k57p、k57s、i59m、i59p、t64i、q68y、e74r、d76l、s78d、p79y、e81k、e81l、n87s、t93l、t102v、t103i、t103k、t103v、d109h、d109y、f111h、f111k、f111s、n115r、e117g、e117h、i122r、l136k、q142l、q142n、t146l、i147s、n153r、q154l、q154n、q154t、n157l、i169f、d175n、f199l、m200s、s210t、t213r、i228l、s237f、t246s、s262p、d267n、v271r、s272v、s272y、t276y、d280s、d280t、c284g、f289y、i293t、v296a、s317e、s317w、a319f、l324s、s329i、s329w、s331y、s336n、p341s、d347i、p355i和t362l，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子hif测量的至少3.2的热稳定性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：i39g、d40h、k45m、a46c、s50i、a53c、f55h、f55l、k57p、t64i、e74r、p79y、t102v、n115r、e117h、i147s、n157l、d175n、f199l、s210t、i228l、d267n、d280t、c284g、v296a、s317e、a319f、s329i、p341s、d347i和p355i，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子hif测量的至少6.4的热稳定性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一方面，该变体包含选自下组的一个取代或由其组成，该组由以下组成：a1t、s5i、s5k、s5l、s5y、t9h、k25p、s29i、s29p、s29r、s30e、k32w、f38l、i39g、i39l、i39v、i39y、d40f、d40g、d40h、d40n、d40p、q41i、q41v、f42c、f42k、f42s、f42y、k45l、k45m、k45y、a46c、a46e、k49p、s50c、s50i、s50l、s50m、s50q、a53c、a53e、a53v、q54i、q54l、q54m、q54v、f55h、f55l、k57p、k57s、i59g、i59m、i59p、s60p、s61l、s61p、s62c、s62n、s62p、t64g、t64i、l67v、q68v、q68y、t69c、e74h、e74r、d76l、d76r、q77l、s78d、p79y、s80l、e81a、e81h、e81k、e81l、e81p、e81y、a82f、a82l、a82m、a82p、n87s、t93l、t93s、v94s、l96w、g99c、t102l、t102v、t103i、t103k、t103v、i105q、d109h、d109k、d109m、d109y、f111h、f111k、f111s、f111y、q112r、g114l、n115a、n115c、n115k、n115p、n115r、n115t、n115y、e117d、e117g、e117h、e117n、e117q、e117s、i122k、i122r、i123a、n124l、n124v、g128a、g128e、g128f、g128l、g128s、s130d、s130g、s130l、s130n、s130p、l136k、g141t、q142a、q142f、q142l、q142n、n145v、t146a、t146i、t146l、t146n、i147s、k150f、k150l、k150r、n153a、n153l、n153m、n153p、n153r、n153y、q154a、q154i、q154l、q154m、q154n、q154t、q154v、n157i、n157l、y159h、q161e、t167f、i169f、i169s、d175i、d175n、q182c、q182t、q182v、h185p、f199l、f199m、m200s、a205s、q207h、q207l、v209f、s210t、t213l、t213r、a216r、f217i、f217y、v225y、i228l、i228t、i228w、y231i、s234q、s237f、s237q、a242i、a242l、a242v、g244s、s245p、t246s、s248y、f258p、s262p、v266k、v266r、d267a、d267h、d267l、d267n、q269l、v271r、s272i、s272k、s272l、s272r、s272t、s272v、s272y、t276l、t276y、g278p、d280n、d280s、d280t、d280y、c284a、c284g、f289y、i293t、v296a、v296i、r299n、k305s、l308v、p313l、f314i、f314l、s317e、s317n、s317w、s318p、a319f、a319q、k321l、k321q、k321s、a322d、l324q、l324s、n325l、d326p、s329c、s329h、s329i、s329l、s329n、s329t、s329v、s329w、g330q、s331w、s331y、p333r、s336k、s336n、n338m、n338q、n338r、p341s、k343a、k343h、k343s、k343t、k343v、g345s、d347i、p348y、p355i、p355r、a358l、a358p、a358r、a358y、k359l、k359s、l361m、t362l、t362n、a363g、a363l和v364i，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代与亲本蛋白酶相比，提供具有作为改进因子hif测量的至少1.4的热稳定性的增加的蛋白酶变体。本发明提供蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置20、27、29、34、40、42、45、46、50、53、54、55、58、59、60、61、62、66、69、76、81、87、93、96、98、101、102、103、109、110、115、117、122、124、125、127、128、130、136、141、142、145、146、148、149、150、153、154、157、159、161、164、167、182、183、184、185、188、199、200、207、208、209、210、211、213、216、219、228、231、237、244、249、252、253、261、266、267、272、275、276、277、280、285、288、291、292、293、294、296、299、303、304、305、306、307、308、310、317、318、319、321、326、327、336、338、341、344、345、348、356、358、359、361、362、363和364处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性。在一个实施例中，这些变体与seqidno:3的蛋白酶相比具有作为改进因子aif测量的增加的比活性。在一个实施例中，该变体与成熟亲本蛋白酶的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:3的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在一方面，在本发明的变体中的取代数目是1至20，例如1至10和1至5，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。在一个特定的方面，本发明涉及一种蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置20、27、29、34、40、42、45、46、50、53、54、55、58、59、60、61、62、66、69、76、81、87、93、96、98、101、102、103、109、110、115、117、122、124、125、127、128、130、136、141、142、145、146、148、149、150、153、154、157、159、161、164、167、182、183、184、185、188、199、200、207、208、209、210、211、213、216、219、228、231、237、244、249、252、253、261、266、267、272、275、276、277、280、285、288、291、292、293、294、296、299、303、304、305、306、307、308、310、317、318、319、321、326、327、336、338、341、344、345、348、356、358、359、361、362、363和364处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体与seqidno:3的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体与seqidno:3的蛋白酶相比具有作为改进因子aif测量的增加的比活性。更具体地说，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：g20l、g20r、t27s、s29a、s29c、s29l、s29n、s29p、s29r、a34l、a34n、a34r、d40s、d40y、f42y、k45l、k45y、a46e、a46k、s50a、s50c、s50i、s50l、s50t、a53i、a53k、a53l、a53s、q54l、f55r、d58m、i59m、i59p、s60c、s60e、s60p、s61d、s61p、s62c、s62n、s66f、s66l、s66m、s66t、t69c、d76a、d76g、d76k、d76l、d76n、d76p、d76v、d76y、e81s、n87f、t93s、l96f、l96s、l96t、t98l、p101f、p101l、p101m、p101r、t102c、t102i、t103v、d109p、d110w、n115a、n115d、n115g、n115p、e117d、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117s、e117w、e117y、i122l、n124d、n124i、n124k、n124l、n124m、n124t、n124v、f125k、f125l、f125m、l127c、l127p、g128n、g128r、g128s、g128w、g128y、s130d、s130f、s130i、s130n、l136c、g141a、g141c、g141f、g141l、g141m、g141q、g141r、g141v、q142a、q142l、q142m、q142s、q142w、n145f、n145g、n145i、n145l、n145p、n145r、n145s、n145v、n145w、t146a、t146c、t146h、t146i、t146m、t146n、t146q、t146r、t146v、t146w、s148g、a149v、k150f、n153d、n153f、n153g、n153r、n153y、q154c、q154f、q154g、q154i、q154k、q154l、q154m、q154r、q154t、q154v、q154w、q154y、n157a、n157e、n157f、n157m、n157y、y159f、y159g、y159h、y159s、q161a、a164l、t167d、t167v、q182f、s183a、s183f、s183l、s183m、a184d、a184f、a184h、a184i、a184k、a184l、a184q、a184r、a184s、a184t、a184v、a184w、a184y、h185a、h185l、h185p、h185s、n188l、n188q、f199l、m200f、m200l、q207f、g208h、g208y、v209f、v209g、v209h、v209l、v209n、v209w、v209y、s210e、s210l、s210r、s210t、s210y、p211f、t213f、t213h、t213i、t213l、t213n、t213r、t213s、t213w、t213y、a216f、a216l、s219m、i228f、i228h、i228l、i228m、i228q、i228v、i228y、y231f、y231s、s237f、s237i、s237k、s237l、g244l、g244n、g244p、g244r、g249c、n252f、n252k、n252s、r253c、v261a、v261g、v266c、v266r、d267s、s272i、s272k、s272l、s272m、s272q、s272r、s272t、s272y、q275a、q275f、q275k、q275l、q275r、q275v、t276f、t276r、t276v、i277l、i277v、d280f、d280h、d280m、d280n、d280s、d280t、a285l、a285s、t288c、t288i、t288v、s291v、v292c、i293m、i293y、s294t、s294v、v296l、r299p、a303c、a303f、a303h、a303s、a303v、g304h、g304k、g304p、g304r、g304s、g304y、k305c、k305f、k305h、k305i、k305l、k305m、k305s、k305t、k305y、s306l、s306m、s306r、p307c、l308p、l308t、f310m、f310p、f310y、s317a、s317c、s317g、s317h、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、s317y、s318n、s318r、a319f、a319w、k321r、k321s、d326p、v327c、v327t、s336r、n338h、n338s、n338t、p341i、p341n、p341r、a344k、a344l、a344p、g345k、g345s、p348g、p348l、p348s、n356l、n356y、a358f、a358l、a358p、k359c、k359l、k359s、k359w、l361e、l361m、l361p、l361r、l361s、l361t、l361v、t362a、t362c、t362h、t362i、t362k、t362l、t362m、t362p、t362q、t362r、t362v、t362y、a363e、a363f、a363l、a363m、a363v、v364f、v364i、v364l、v364m和v364s，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少1.37的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：g20l、g20r、t27s、s29a、s29c、s29l、s29n、s29p、s29r、a34l、a34n、a34r、f42y、k45l、k45y、a46e、a46k、s50a、s50l、a53l、q54l、f55r、i59m、i59p、s60e、s60p、s61d、s61p、s62n、s66m、s66t、t69c、d76a、d76g、d76k、d76l、d76n、d76p、d76v、d76y、e81s、n87f、t93s、l96f、l96s、l96t、t98l、p101f、p101l、p101m、p101r、t102c、t102i、t103v、d109p、d110w、n115a、n115d、n115g、n115p、e117d、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117s、e117w、e117y、n124d、n124i、n124k、n124l、n124m、n124t、n124v、f125k、f125l、f125m、l127c、l127p、g128n、g128r、g128s、g128w、g128y、s130d、s130f、s130i、s130n、l136c、g141a、g141c、g141f、g141l、g141m、g141q、g141r、g141v、q142a、q142l、q142m、q142s、q142w、n145f、n145g、n145i、n145l、n145p、n145r、n145s、n145v、n145w、t146a、t146c、t146h、t146i、t146m、t146n、t146q、t146r、t146v、t146w、s148g、a149v、k150f、n153y、q154i、q154k、q154l、q154m、q154r、q154w、n157f、n157y、y159h、y159s、q161a、t167d、q182f、a184f、a184i、a184k、a184v、a184w、h185a、n188l、f199l、m200f、m200l、q207f、g208h、g208y、v209f、v209g、v209h、v209l、v209n、v209w、v209y、s210e、s210l、s210r、s210t、s210y、p211f、t213f、t213i、t213l、t213n、t213r、t213s、t213w、a216f、s219m、i228f、i228h、i228l、i228m、i228q、i228v、i228y、y231f、y231s、s237f、s237i、s237k、s237l、g244n、g249c、n252f、v261a、v261g、v266c、v266r、d267s、s272i、s272l、s272m、s272q、s272r、s272t、s272y、q275f、q275k、q275l、q275r、q275v、t276f、t276r、t276v、i277l、i277v、d280f、d280h、d280m、d280n、d280s、d280t、a285s、t288c、t288v、i293y、s294t、s294v、a303f、g304h、g304k、g304p、g304r、g304s、k305c、k305f、k305h、k305i、k305s、k305t、s306l、s306r、p307c、l308p、l308t、f310m、f310p、f310y、s317a、s317c、s317g、s317h、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、s317y、s318n、s318r、a319f、a319w、k321r、k321s、d326p、v327c、v327t、s336r、n338h、n338s、n338t、p341i、p341n、p341r、a344k、a344l、a344p、g345k、g345s、p348g、p348l、p348s、n356l、n356y、a358l、k359s、k359w、l361p、l361r、t362c、t362h、t362i、t362k、t362m、t362r、t362y、a363f和v364m，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少2.0的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：g20l、g20r、t27s、s29a、s29c、s29l、s29n、s29p、s29r、a34l、a34n、a34r、k45y、a46e、s50l、a53l、f55r、i59m、s60e、s60p、s61p、s62n、s66m、s66t、t69c、d76a、d76g、d76k、d76l、d76n、d76p、d76v、d76y、e81s、n87f、t93s、l96f、l96s、l96t、t98l、p101f、p101l、p101m、p101r、t102c、t102i、t103v、d109p、d110w、n115a、n115d、n115g、e117d、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117s、e117w、e117y、n124i、n124k、n124l、n124m、n124v、f125k、f125l、f125m、l127c、l127p、g128n、g128r、g128s、g128w、g128y、s130d、s130f、s130i、s130n、l136c、g141a、g141c、g141f、g141l、g141m、g141q、g141r、g141v、q142a、q142l、q142m、q142s、q142w、n145f、n145g、n145i、n145p、n145r、n145s、n145v、n145w、t146a、t146c、t146h、t146i、t146m、t146n、t146q、t146r、t146v、t146w、s148g、a149v、n153y、q154i、q154l、q154r、n157f、y159h、y159s、t167d、q182f、a184f、a184i、a184k、a184w、f199l、m200l、g208h、g208y、v209f、v209g、v209h、v209l、v209n、v209y、s210e、s210l、t213f、t213i、t213n、t213r、i228f、i228l、i228q、i228v、i228y、y231f、y231s、s237f、s237i、s237k、s237l、g244n、g249c、v261a、v266r、d267s、s272i、s272l、s272q、s272r、s272t、s272y、q275k、q275l、q275r、q275v、t276f、t276v、i277l、d280f、d280m、d280n、d280s、d280t、a285s、t288v、i293y、s294t、s294v、g304h、g304k、g304p、g304r、g304s、k305f、k305h、k305i、k305t、s306l、p307c、l308p、f310m、f310p、f310y、s317a、s317c、s317g、s317h、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、s317y、s318n、s318r、a319f、a319w、k321r、k321s、d326p、v327c、v327t、s336r、n338h、n338s、n338t、p341i、p341n、p341r、a344k、a344l、g345k、g345s、p348g、p348l、p348s、n356l、n356y、a358l、k359s、l361p、l361r、t362c、t362h、t362i、t362y和v364m，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少2.2的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：g20l、g20r、s29a、s29c、s29n、s29p、a34n、a34r、a46e、s50l、f55r、i59m、s60e、s60p、s61p、s62n、s66m、d76a、d76g、d76k、d76l、d76n、d76p、d76v、d76y、e81s、n87f、l96f、l96s、l96t、t98l、p101f、p101l、p101m、p101r、t102c、t102i、t103v、d109p、n115a、n115d、n115g、e117d、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117w、e117y、n124i、n124k、n124v、f125l、f125m、l127p、g128n、g128s、g128w、g128y、s130d、s130f、g141a、g141f、g141l、g141m、g141q、g141r、q142a、q142l、q142m、q142s、q142w、n145g、n145i、n145s、n145w、t146a、t146h、t146n、t146v、t146w、q154r、y159h、y159s、t167d、q182f、f199l、g208h、g208y、v209f、v209g、v209h、v209l、v209n、v209y、s210l、t213i、i228l、i228q、i228y、y231f、y231s、s237f、s237i、s237k、s237l、g244n、v261a、v266r、d267s、s272l、s272t、s272y、q275k、q275r、t276f、t276v、i277l、d280f、d280n、d280s、d280t、a285s、s294t、g304h、g304k、g304p、g304r、g304s、k305h、k305i、l308p、f310m、f310p、s317c、s317g、s317h、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、s317y、a319f、k321s、d326p、v327c、s336r、n338h、p341i、p341n、p341r、g345k、g345s、p348g、p348s、n356y、a358l、l361p、t362i和v364m，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少2.6的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：s29n、a34n、a34r、i59m、s60p、d76a、d76g、d76k、d76l、d76n、d76p、d76v、d76y、n87f、l96f、l96s、t98l、p101l、p101m、t102c、t102i、d109p、n115a、e117d、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117w、e117y、n124i、n124k、n124v、f125l、g128n、g128w、s130d、s130f、g141f、g141l、g141m、g141q、g141r、q142a、q142l、q142m、q142s、q142w、n145i、n145s、t146h、t146n、t146w、q154r、y159s、t167d、q182f、v209f、v209h、v209l、i228q、y231s、s237i、s237l、d267s、s272t、s272y、t276f、t276v、d280f、d280s、d280t、a285s、s294t、g304h、g304p、k305h、f310m、f310p、s317c、s317g、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、s317y、a319f、d326p、v327c、n338h、p341n、p341r、g345k、g345s、p348s、n356y和l361p，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少3.0的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：s29n、a34n、a34r、i59m、s60p、d76a、d76k、d76l、d76n、d76p、d76y、n87f、l96f、d109p、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117w、e117y、n124v、g141f、g141l、g141m、g141r、q142l、q142m、q142s、q142w、t146h、t146n、q154r、v209f、v209h、i228q、t276f、d280t、a285s、s294t、f310m、f310p、s317c、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、d326p、n338h、p341n、p341r、g345k、g345s、p348s、n356y和l361p，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少3.8的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：a34n、a34r、d76a、d76k、d76l、d76n、d76y、n87f、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117w、e117y、g141l、g141m、q142l、q142m、q142s、q142w、t146h、t146n、q154r、v209h、t276f、a285s、s294t、f310m、f310p、s317i、s317k、s317r、s317w、n338h和g345s，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少4.5的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一方面，该变体包含选自下组的一个取代或由其组成，该组由以下组成：g20l、g20r、t27s、s29a、s29c、s29l、s29n、s29p、s29r、a34l、a34n、a34r、d40s、d40y、f42y、k45l、k45y、a46e、a46k、s50a、s50c、s50i、s50l、s50t、a53i、a53k、a53l、a53s、q54l、f55r、d58m、i59m、i59p、s60c、s60e、s60p、s61d、s61p、s62c、s62n、s66f、s66l、s66m、s66t、t69c、d76a、d76g、d76k、d76l、d76n、d76p、d76v、d76y、e81s、n87f、t93s、l96f、l96s、l96t、t98l、p101f、p101l、p101m、p101r、t102c、t102i、t103v、d109p、d110w、n115a、n115d、n115g、n115p、e117d、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117s、e117w、e117y、i122l、n124d、n124i、n124k、n124l、n124m、n124t、n124v、f125k、f125l、f125m、l127c、l127p、g128n、g128r、g128s、g128w、g128y、s130d、s130f、s130i、s130n、l136c、g141a、g141c、g141f、g141l、g141m、g141q、g141r、g141v、q142a、q142l、q142m、q142s、q142w、n145f、n145g、n145i、n145l、n145p、n145r、n145s、n145v、n145w、t146a、t146c、t146h、t146i、t146m、t146n、t146q、t146r、t146v、t146w、s148g、a149v、k150f、n153d、n153f、n153g、n153r、n153y、q154c、q154f、q154g、q154i、q154k、q154l、q154m、q154r、q154t、q154v、q154w、q154y、n157a、n157e、n157f、n157m、n157y、y159f、y159g、y159h、y159s、q161a、a164l、t167d、t167v、q182f、s183a、s183f、s183l、s183m、a184d、a184f、a184h、a184i、a184k、a184l、a184q、a184r、a184s、a184t、a184v、a184w、a184y、h185a、h185l、h185p、h185s、n188l、n188q、f199l、m200f、m200l、q207f、g208h、g208y、v209f、v209g、v209h、v209l、v209n、v209w、v209y、s210e、s210l、s210r、s210t、s210y、p211f、t213f、t213h、t213i、t213l、t213n、t213r、t213s、t213w、t213y、a216f、a216l、s219m、i228f、i228h、i228l、i228m、i228q、i228v、i228y、y231f、y231s、s237f、s237i、s237k、s237l、g244l、g244n、g244p、g244r、g249c、n252f、n252k、n252s、r253c、v261a、v261g、v266c、v266r、d267s、s272i、s272k、s272l、s272m、s272q、s272r、s272t、s272y、q275a、q275f、q275k、q275l、q275r、q275v、t276f、t276r、t276v、i277l、i277v、d280f、d280h、d280m、d280n、d280s、d280t、a285l、a285s、t288c、t288i、t288v、s291v、v292c、i293m、i293y、s294t、s294v、v296l、r299p、a303c、a303f、a303h、a303s、a303v、g304h、g304k、g304p、g304r、g304s、g304y、k305c、k305f、k305h、k305i、k305l、k305m、k305s、k305t、k305y、s306l、s306m、s306r、p307c、l308p、l308t、f310m、f310p、f310y、s317a、s317c、s317g、s317h、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、s317y、s318n、s318r、a319f、a319w、k321r、k321s、d326p、v327c、v327t、s336r、n338h、n338s、n338t、p341i、p341n、p341r、a344k、a344l、a344p、g345k、g345s、p348g、p348l、p348s、n356l、n356y、a358f、a358l、a358p、k359c、k359l、k359s、k359w、l361e、l361m、l361p、l361r、l361s、l361t、l361v、t362a、t362c、t362h、t362i、t362k、t362l、t362m、t362p、t362q、t362r、t362v、t362y、a363e、a363f、a363l、a363m、a363v、v364f、v364i、v364l、v364m和v364s，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代与亲本蛋白酶相比，提供具有作为改进因子aif测量的至少1.37的比活性的增加的蛋白酶变体。在另一个具体实施例中，本发明涉及一种蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置39、57、59、66、102、111、115、267、272、275或280处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体包含选自下组的取代，该组由以下组成：i39l、k57p、i59m、s66t、t102v、f111h、n115k、d267n、s272y、q275k、d280s，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。具体地，本发明涉及一种蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置39、57、59、66、102、111、115、267、272、275或280处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体包含选自下组的取代，该组由以下组成：i39l、k57p、i59m、s66t、t102v、f111h、n115k、d267n、s272y、q275k、d280s，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有作为在56℃下热应力持续20min后残余活性测量的增加的热稳定性。在另一个实施例中，本发明涉及一种蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置39、57、59、66、102、111、115、267、272、275或280处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体包含选自下组的取代，该组由以下组成：i39l、k57p、i59m、s66t、t102v、f111h、n115k、d267n、s272y、q275k、d280s，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有作为在56℃下热应力持续20min后残余活性测量的增加的热稳定性，其中残余活性为至少50％，具体是至少60％、至少70％、至少80％。在另一个实施例中，本发明涉及一种蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置39、57、59、66、102、111、115、267、272、275或280处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体包含选自下组的至少三个取代，该组由以下组成：i39l、k57p、i59m、s66t、t102v、f111h、n115k、d267n、s272y、q275k、d280s，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有作为在56℃下热应力持续20min后残余活性测量的增加的热稳定性，其中残余活性为至少50％，具体是至少60％、至少70％、至少80％。在另一个实施例中，本发明涉及包含对应于seqidno:3的多肽的i39l+s66t+t102v或d267n+s272y+q275k+d280s的取代的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有作为在56℃下热应力持续20min后残余活性测量的增加的热稳定性，其中残余活性为至少50％，具体是至少60％、至少70％、至少80％。在另一个实施例中，本发明涉及包含对应于seqidno:3的多肽中的以下的取代的蛋白酶变体：i39l+s66t+t102v；i39l+s66t+t102v+d267ns272y+d280s；i39l+k57p+i59m+s66t+t102vf111h+n115k+d267n+s272y、i39l+k57p+i59m+s66t+t102v+f111h+n115k+d280s；或d267n+s272y+q275k+d280s，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有作为在56℃下热应力持续20min后残余活性测量的增加的热稳定性，其中残余活性为至少50％，具体是至少60％、至少70％、至少80％。本发明提供蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置2、17、22、41、41、42、45、46、54、55、57、59、60、61、62、63、64、66、69、80、82、84、87、98、99、102、103、112、114、115、129、131、134、149、159、167、169、199、200、205、207、209、211、213、217,242、250、266、267、269、270、271、272、274、278、279、280、284、288、291、292、294、296、301、307、314、329、331、333、336、362和363中的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性。在一个实施例中，这些变体与seqidno:3的蛋白酶相比具有作为改进因子eif测量的增加的表达水平。在一个实施例中，该变体与成熟亲本蛋白酶的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:3的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在一方面，在本发明的变体中的取代数目是1至20，例如1至10和1至5，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。在一个特定的方面，本发明涉及一种蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置2、17、22、41、41、42、45、46、54、55、57、59、60、61、62、63、64、66、69、80、82、84、87、98、99、102、103、112、114、115、129、131、134、149、159、167、169、199、200、205、207、209、211、213、217、242、250、266、267、269、270、271、272、274、278、279、280、284、288、291、292、294、296、301、307、314、329、331、333、336、362和363处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体与seqidno:3的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体与seqidno:3的蛋白酶相比具有作为改进因子eif测量的增加的表达水平。更具体地说，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：i2l、a17p、p22v、q41l、q41t、q41v、q41y、f42r、k45s、a46l、a46w、q54r、q54s、q54v、q54y、f55l、f55n、f55t、f55y、k57h、k57l、k57v、i59d、i59k、i59r、i59s、i59v、s60i、s60l、s60q、s60r、s60y、s61a、s61f、s62h、s62i、s62l、s62r、s62v、t63a、t63e、t63g、t63r、t63v、t64c、t64d、t64m、s66g、t69a、t69f、t69p、t69r、t69y、s80g、s80l、s80n、s80t、a82h、i84g、n87p、t98c、g99v、t102a、t102h、t103f、t103i、t103v、q112h、q112m、q112r、q112s、g114a、g114c、g114l、g114p、n115y、e129l、e129s、e129v、e129y、n131i、n131s、n131v、q134a、q134l、q134r、a149d、y159f、y159l、t167a、t167l、t167s、t167w、i169s、f199y、m200l、a205s、q207n、v209p、p211f、p211s、t213s、f217i、a242e、k250r、v266a、v266f、v266l、v266s、v266t、v266y、d267f、d267l、d267t、d267v、q269c、q269f、q269i、q269s、q269t、q269v、q269x、i270a、i270c、i270l、i270s、v271f、v271i、v271k、v271m、v271s、v271y、s272a、s272n、g274r、g278s、v279i、d280y、c284a、t288a、t288c、t288g、s291v、v292s、s294g、v296p、v296r、v296t、i301t、p307t、f314l、s329d、s329v、s331a、s331g、s331t、p333v、s336g、s336l、s336t、t362r和a363t，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子eif测量的至少1.38的表达水平的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：i2l、a17p、p22v、q41l、q41y、f42r、q54r、q54s、q54y、f55n、f55t、k57l、k57v、i59d、i59s、i59v、s60l、s60q、s60r、s60y、s61f、s62l、s62v、t63a、t63e、t63r、t64c、t64d、t64m、q112h、q112m、q112r、q112s、g114a、g114c、g114l、g114p、n115y、e129l、e129s、e129v、e129y、n131i、n131s、n131v、q134a、q134l、q134r、a149d、t167a、t167s、t167w、f199y、a242e、k250r、v266a、v266f、v266l、v266s、v266t、v266y、d267f、d267l、d267t、d267v、q269c、q269f、q269i、q269s、q269t、q269v、q269x、i270a、i270c、i270l、i270s、v271f、v271i、v271k、v271m、s272a、g274r、g278s、t288a、t288c、t288g、v296p、v296r、v296t、f314l、s329d、s329v、s331a、s331g、s331t、p333v、s336g、s336l和s336t，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子eif测量的至少1.6的表达水平的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：i2l、a17p、p22v、q41y、f42r、k57l、i59s、t63a、t63r、q112h、q112m、q112r、q112s、g114a、g114l、g114p、e129l、e129s、e129y、n131i、n131s、n131v、q134l、q134r、t167w、k250r、v266a、v266l、v266t、d267f、d267l、d267t、d267v、q269c、q269f、q269i、q269t、q269v、q269x、i270a、i270l、i270s、v271i、v271m、g274r，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子eif测量的至少1.75的表达水平的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一个具体实施例中，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：q112m、q112s、g114l、e129y、n131i、q134r、k250r、d267f、d267l、d267v、q269c、q269v、i270a、i270l、v271i、g274r，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子eif测量的至少1.9的表达水平的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。在另一方面，该变体包含选自下组的一个取代或由其组成，该组由以下组成：i2l、a17p、p22v、q41l、q41t、q41v、q41y、f42r、k45s、a46l、a46w、q54r、q54s、q54v、q54y、f55l、f55n、f55t、f55y、k57h、k57l、k57v、i59d、i59k、i59r、i59s、i59v、s60i、s60l、s60q、s60r、s60y、s61a、s61f、s62h、s62i、s62l、s62r、s62v、t63a、t63e、t63g、t63r、t63v、t64c、t64d、t64m、s66g、t69a、t69f、t69p、t69r、t69y、s80g、s80l、s80n、s80t、a82h、i84g、n87p、t98c、g99v、t102a、t102h、t103f、t103i、t103v、q112h、q112m、q112r、q112s、g114a、g114c、g114l、g114p、n115y、e129l、e129s、e129v、e129y、n131i、n131s、n131v、q134a、q134l、q134r、a149d、y159f、y159l、t167a、t167l、t167s、t167w、i169s、f199y、m200l、a205s、q207n、v209p、p211f、p211s、t213s、f217i、a242e、k250r、v266a、v266f、v266l、v266s、v266t、v266y、d267f、d267l、d267t、d267v、q269c、q269f、q269i、q269s、q269t、q269v、q269x、i270a、i270c、i270l、i270s、v271f、v271i、v271k、v271m、v271s、v271y、s272a、s272n、g274r、g278s、v279i、d280y、c284a、t288a、t288c、t288g、s291v、v292s、s294g、v296p、v296r、v296t、i301t、p307t、f314l、s329d、s329v、s331a、s331g、s331t、p333v、s336g、s336l、s336t、t362r和a363t，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代与亲本蛋白酶相比，提供具有作为改进因子eif测量的至少1.38的表达水平的增加的蛋白酶变体。所述变体可以进一步包含在一个或多个(例如，若干个)其他位置处的一个或多个另外的改变。这些氨基酸改变可以具有次要性质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多至20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。因此，尽管根据本发明的蛋白酶变体可以仅包含一种特定的取代(该取代提供根据本发明的改进的特性)，但是它可能仍然具有另外的修饰，这些修饰导致变体蛋白酶与成熟亲本蛋白酶(例如seqidno:3的蛋白酶)的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列同一性。这些另外的修饰应优选不显著改变变体蛋白酶的改进的特性。保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及甲硫氨酸)。通常不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由h.neurath和r.l.hill,1979,于theproteins[蛋白质],academicpress[学术出版社],纽约中描述。常见取代为ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly。可以根据本领域中已知的程序，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(cunningham和wells,1989,science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，hilton等人，1996，j.biol.chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contractsite)氨基酸进行突变。参见，例如，devos等人,1992,science[科学]255:306-312；smith等人,1992,j.mol.biol.[分子生物学杂志]224:899-904；wlodaver等人,1992,febslett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。在一个实施例中，该变体与亲本酶相比具有改进的(增加的)比活性。在一个实施例中，该变体与亲本酶相比在储存条件下具有改进的(增加的)稳定性。在一个实施例中，该变体与亲本酶相比具有改进的(增加的)热稳定性。在一个实施例中，该变体在重组表达宿主细胞中具有改进的(增加的)表达水平。亲本蛋白酶亲本蛋白酶可以是(a)与seqidno:2的成熟多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(b)由以下多核苷酸所编码的多肽，该多核苷酸在高严格条件下与(i)seqidno:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cdna序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；或(c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与seqidno:1的成熟多肽编码序列具有至少80％的序列同一性。在一方面，该亲本与seqidno:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，这一成熟多肽具有蛋白酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:2的成熟多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。在另一方面，该亲本包含seqidno:3的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包含seqidno:2的氨基酸199至564或由其组成。在另一方面，该亲本由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)seqidno:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cdna序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交(sambrook等人，1989，molecularcloning,alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册]，第二版，冷泉港(coldspringharbor)，纽约)。可以使用seqidno:1的多核苷酸或其子序列、连同seqidno:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的dna。具体地，可以遵循标准dna印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组dna或cdna杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。dna和rna探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32p、3h、35s、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测对应的基因。此类探针涵盖于本发明中。可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的dna来筛选由此类其他菌株制备的基因组dna或cdna文库。来自此类其他菌株的基因组dna或其他dna可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可以将来自文库的dna或分离的dna转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其他适合的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与seqidno:1或其子序列杂交的克隆或dna，在dna印迹中使用该载体材料。出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)seqidno:1；(ii)seqidno:1的成熟多肽编码序列；(iii)其cdna序列；(iv)其全长互补体；或(v)其子序列；该杂交是在高至非常高严格条件下进行。可以使用例如x-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。在一方面，核酸探针是seqidno:1的成熟多肽编码序列。在另一方面，核酸探针是seqidno:1的核苷酸595至1692。在另一方面，核酸探针是编码以下的多核苷酸：seqidno:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，核酸探针是seqidno:1或其cdna序列。在另一个实施例中，该亲本是由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与seqidno:1的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一部分在另一种多肽的一部分的n-末端或c-末端处融合。该亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的n-末端或c-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。还可使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(cooper等人,1993,emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；dawson等人,1994,science[科学]266:776-779)。融合多肽可以进一步包含两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：martin等人,2003,j.ind.microbiol.biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；svetina等人,2000,j.biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；rasmussen-wilson等人,1997,appl.environ.microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；ward等人,1995,biotechnology[生物技术]13:498-503；和contreras等人,1991,biotechnology[生物技术]9:378-381；eaton等人,1986,biochemistry[生物化学]25:505-512；collins-racie等人,1995，biotechnology[生物技术]13:982-987；carter等人,1989,proteins[蛋白质]；structure,function,andgenetics[结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及stevens,2003,drugdiscoveryworld[世界药物发现]4:35-48。在另一方面，该亲本是大型亚灰树花菌s53蛋白酶，例如seqidno:2的蛋白酶或其成熟多肽(本文中披露为seqidno:3)。变体的制备可以使用本领域已知的任何诱变方法，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等制备变体。定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的pcr可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，scherer和davis，1979，proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和barton等人，1990，nucleicacidsres.[核酸研究]18:7349-4966。也可以通过本领域已知的方法在体内实现定点诱变。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；storici等人，2001，naturebiotechnol.[自然生物技术]19:773-776；kren等人，1998，nat.med.[自然医学]4:285-290；以及calissano和macino，1996，fungalgenet.newslett.[真菌遗传学通讯]43:15-16。可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可以用于制备变体的许多可商购的试剂盒。合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由tian等人(2004，nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由reidhaar-olson和sauer,1988,science[科学]241:53-57；bowie和sauer，1989，proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；wo95/17413；或wo95/22625中披露的那些。其他可以使用的方法包括易错pcr、噬菌体展示(例如lowman等人,1991,biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；wo92/06204)以及区域定向诱变(derbyshire等人,1986,gene[基因]46:145；ner等人,1988,dna7:127)。诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(ness等人,1999,naturebiotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的dna分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因的构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合pcr技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，然而还有其他区域可以进行易错pcr或非易错pcr扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。多核苷酸本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。核酸构建体本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组dna方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaa)、米曲霉taka淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(wo96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、镶片镰孢daria(wo00/56900)、镶片镰孢quinn(wo00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶i、里氏木霉纤维二糖水解酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶i、里氏木霉内切葡聚糖酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶iii、里氏木霉内切葡聚糖酶iv、里氏木霉内切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉β-木糖苷酶，以及na2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导序列已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列被可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。控制序列还可为启动子下游和基因的编码序列上游的mrna稳定子区域，其增加所述基因的表达。控制序列也可以是前导子，即对宿主细胞翻译很重要的mrna的非翻译区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉taka淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mrna上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化从针对以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶、和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的n-末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-端可含有对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉taka淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶v、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉(rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶。所述控制序列还可以是编码位于变体的n-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila)漆酶(wo95/33836)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶。在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻变体的n-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的n-末端。还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用adh2系统或gal1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉takaα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许用于基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。表达载体本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。重组表达载体可以是可以方便地经受重组dna程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的染色体一起复制。此外，可使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒一起含有待引入到宿主细胞的基因组中的总dna)或转座子。载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amds(乙酰胺酶)、argb(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niad(硝酸还原酶)、pyrg(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sc(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpc(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选地用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉niad、niia、amds和pyrg基因以及吸水链霉菌bar基因。载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，该载体可含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，所述复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是ama1和ans1(gems等人,1991,gene[基因]98:61-67；cullen等人,1987,nucleicacidsres.[核酸研究]15:9163-9175；wo00/24883)。可根据wo00/24883中披露的方法完成ama1基因的分离和包含所述基因的质粒或载体的构建。可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的拷贝数目的增加，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标志基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，sambrook等人，1989，见上文)。宿主细胞本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，所述一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。在一个具体实施例中，重组宿主细胞包含编码本发明的海藻糖酶多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸与宿主细胞是异源的(不同来源/物种)。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得所述构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。宿主细胞可以是真菌细胞。如本文使用的“真菌”包括子囊菌门(ascomycota)、担子菌门(basidiomycota)、壶菌门(chytridiomycota)和接合菌门(zygomycota)以及卵菌门(oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由hawksworth等人所定义的，在：ainsworthandbisby’sdictionaryofthefungi[ainsworth和bisby的真菌大词典],第8版,1995,cabinternational[国际cab],universitypress[大学出版社],cambridge[剑桥],英国)。真菌宿主细胞可为酵母细胞。如本文使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半知菌类(fungiimperfecti)(芽孢纲(blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如biologyandactivitiesofyeast[酵母的生物学与活性](skinner、passmore和davenport编辑，soc.app.bacteriol.symposiumseriesno.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)所描述那样定义。酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(candida)细胞、汉逊酵母属(hansenula)细胞、克鲁维酵母属(kluyveromyces)细胞、毕赤酵母属(pichia)细胞、酵母菌属(saccharomyces)细胞、裂殖酵母(schizosaccharomyces)或耶罗维亚酵母属(yarrowia)细胞、例如乳酸克鲁弗酵母(kluyveromyceslactis)细胞、卡尔酵母(saccharomycescarlsbergensis)细胞、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)细胞、糖化酵母(saccharomycesdiastaticus)细胞、道格拉氏酵母(saccharomycesdouglasii)细胞、克鲁弗酵母(saccharomyceskluyveri)细胞、诺地酵母(saccharomycesnorbensis)细胞、卵形酵母(saccharomycesoviformis)细胞或解脂耶罗维亚酵母(yarrowialipolytica)细胞。真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(eumycota)和卵菌门(oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由hawksworth等人,1995,同上)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(trametes)或木霉属细胞。例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌(chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(coprinuscinereus)、毛革盖菌(coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢(fusariumgraminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(phlebiaradiata)、刺芹侧耳(pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(trametesvillosa)、变色栓菌(trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。真菌细胞可以通过以下过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序描述于以下文献中：ep238023，yelton等人，1984，proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及christensen等人，1988，bio/technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰刀菌属物种的适合方法在malardier等人，1989，gene[基因]78:147-156和wo96/00787中描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：becker和guarente在abelson,j.n.和simon,m.i.编辑,guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology[酵母遗传学与分子生物学指南],methodsinenzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,academicpress,inc.[学术出版社有限公司],纽约；ito等人,1983,j.bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及hinnen等人,1978,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]75:1920。产生方法本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该变体。使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果变体被分泌到营养介质中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。可以使用本领域已知的对这些变体特异的方法检测这些变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定所述变体的活性。变体可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过多种常规程序从营养介质中回收变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、sds-page、或萃取(参见例如，proteinpurification[蛋白质纯化]，janson和ryden编辑，vch出版社(vchpublishers),纽约,1989)。在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。酶组合物本发明还涉及包含本发明的变体蛋白酶的组合物。优选地，这些组合物富集了这样一种蛋白酶。术语“富含”指示该组合物的支链淀粉酶活性已经增加，例如，富集因子为至少1.1。这些组合物可以包含变体s53蛋白酶作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如变体s53蛋白酶以及一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。在一个实施例中，该组合物包含本发明的变体s53蛋白酶和产碳水化合物源的酶以及任选地α-淀粉酶。在一个具体的实施例中，该组合物包含变体s53蛋白酶和葡糖淀粉酶。优选地，包含于组合物中的这些酶活性选自本发明的变体s53蛋白酶以及一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：葡糖淀粉酶、真菌α-淀粉酶。在一个实施例中，包含在组合物中的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选地来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株,优选瓣环栓菌(t.cingulata)；或密孔菌属的菌株，优选血红密孔菌；或粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属(nigrofomes)的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是源自栓菌属，如瓣环栓菌的菌株，如示于本文的seqidno:4中的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含本文的seqidno:4的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:4的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是源自篮状菌属，如埃默森篮状菌的菌株，如示于本文的seqidno:5中的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含本文的seqidno:5的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:5的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是源自密孔菌属的菌株，具体是描述于wo2011/066576中的血红密孔菌的菌株(seqidno2、4或6)，如示为wo2011/066576中的seqidno:4的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含本文的seqidno:6的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:6的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是源自粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，具体是如在wo2011/068803中描述的粘褶菌属的菌株(seqidno:2、4、6、8、10、12、14或16)。在一个优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是示于wo2011/068803中的seqidno:2或本文的seqidno:7中的篱边粘褶菌。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是源自篱边粘褶菌，如示于本文的seqidno:7中的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含本文的seqidno:7的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:7的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在另一个实施例中，葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，如示于本文的seqidno:8中的密粘褶菌。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含本文的seqidno:8的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:8的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自黑层孔属(nigrofomes)的菌株，具体是披露于wo2012/064351中的黑层孔属物种的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20agu/gds，优选0.001-10agu/gds，尤其是0.01-5agu/gds之间，如0.1-2agu/gds。包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括amg200l；amg300l；santmsuper、santmextral、spirizymetmplus、spirizymetmfuel、spirizymetmb4u、spirizymetmultra、spirizymetmexcel和amgtme(来自诺维信公司(novozymesa/s))；optidextm300、gc480、gc417(来自杜邦公司(dupont.))；amigasetm和amigasetmplus(来自帝斯曼公司(dsm))；g-zymetmg900、g-zymetm和g990zr(来自杜邦公司)。除了葡糖淀粉酶之外，该组合物可以进一步包含α-淀粉酶。具体地，该α-淀粉酶是酸性真菌α-淀粉酶。真菌酸性稳定的α-淀粉酶是在3.0至7.0的ph范围内，并且优选地在3.5至6.5的ph范围内具有活性的α-淀粉酶，包括在约4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0的ph时的活性。优选地，酸性真菌α-淀粉酶源自曲霉属，具体是土曲霉、黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、或白曲霉的菌株；或者源自根毛霉属，优选地微小根毛霉的菌株；或亚灰树花菌属，优选地大型亚灰树花菌的菌株。在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶源自根毛霉属的菌株，优选的是菌株微小根毛霉，例如示于wo2013/006756中的seqidno:3中的一种，例如具有黑曲霉连接子和淀粉结合域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，例如示于本文的seqidno:9中的一种，或其变体。在一个实施例中，该α-淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含本文的seqidno:9的多肽的α-淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:9的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶是示于seqidno:9中的具有以下取代或取代的组合中的至少一个的α-淀粉酶的变体：d165m；y141w；y141r；k136f；k192r；p224a；p224r；s123h+y141w；g20s+y141w；a76g+y141w；g128d+y141w；g128d+d143n；p219c+y141w；n142d+d143n；y141w+k192r；y141w+d143n；y141w+n383r；y141w+p219c+a265c；y141w+n142d+d143n；y141w+k192rv410a；g128d+y141w+d143n；y141w+d143n+p219c；y141w+d143n+k192r；g128d+d143n+k192r；y141w+d143n+k192r+p219c；g128d+y141w+d143n+k192r；或g128d+y141w+d143n+k192r+p219c(使用seqidno:9用于编号)。在一个实施例中，源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(sbd)的微小根毛霉的α-淀粉酶，优选如本文seqidno:9披露的，优选具有一个或多个以下取代：g128d、d143n、优选g128d+d143n(使用seqidno:9用于编号)，并且其中该α-淀粉酶变体与本文的seqidno:9的多肽具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％同一性。在一个优选实施例中，在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶与α-淀粉酶之间的比率优选地可以在500:1至1:1，如从250:1至1:1、如从100:1至1:1、如从100:2至100:50、如从100:3至100:70的范围内。组合物可以根据本领域已知的方法制备并且可以呈液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将变体稳定化。组合物可以根据本领域已知的方法制备并且可以呈液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域已知的方法稳定组合物。本发明的酶组合物可为任何适于使用的形式，例如像，去除或未去除细胞的粗发酵液，含有或不含细胞碎片的细胞裂解物，半纯化或纯化的酶组合物，或宿主细胞，作为酶的来源。该酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶组合物进行稳定化。本发明的变体蛋白酶的用途淀粉加工天然淀粉由室温下不溶于水的微观颗粒组成。加热水性淀粉浆料时，颗粒膨胀并且最后破裂，将淀粉分子分散至溶液中。在高达约50℃至75℃的温度时，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。在此“糊化(gelatinization)”过程中，粘度有显著地增加。有待加工的颗粒状淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，优选地至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯，或它可以为含更粗糙的淀粉的材料，这些材料包括(例如，经碾磨的)全谷物，全谷物包含非淀粉部分，如胚芽残留物和纤维。该原材料(如全谷物)可以例如经过碾磨减少粒度，以便展开结构并且允许进一步加工。在干式碾磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿式碾磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。干式和湿式碾磨两者是本领域中熟知的淀粉加工法并且可以用于本发明的方法中。用于减少该含淀粉的材料的粒度的方法为本领域的普通技术人员所熟知。由于典型工业过程中的固体水平为30％-40％，因此不得不稀释或“液化”淀粉以使其能够被适当加工。在当前商业实践中，这种黏度的降低主要通过酶促降解来实现。在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行液化。在一个实施例中，在液化过程中还存在植酸酶。在一个实施例中，在液化期间，还存在降低黏度的酶例如木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。在液化过程中，α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链以及线性的较短单元(麦芽糊精)。液化可以作为一个三步热浆料方法进行。将浆料加热至60℃-95℃之间(例如70℃-90℃，例如77℃-86℃、80℃-85℃、83℃-85℃)并且添加α-淀粉酶以开始液化(稀释)。在一个实施例中，可以将浆料在95℃-140℃(例如，105℃-125℃)之间喷射蒸煮约1-15分钟，例如约3-10分钟，尤其是5分钟左右。然后，将浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多的α-淀粉酶，以获得最终水解(二次液化)。在ph4.5-6.5，典型地在5与6之间的ph时进行喷射蒸煮过程。可以例如在喷射蒸煮之前，将α-淀粉酶以单一剂量添加。在70℃-95℃之间，例如80℃-90℃，例如85℃左右，将液化过程进行约10分钟至5小时，典型地是1小时-2小时。ph在4与7之间，例如在4.5与5.5之间。为了确保这些条件下最佳的酶稳定性，可以任选地添加钙(以提供1ppm-60ppm游离钙离子，例如约40ppm游离钙离子)。如此处理之后，液化淀粉将典型地具有10-15的“右旋糖当量”(de)。通常，液化和液化条件在本领域是熟知的。用于液化中的α-淀粉酶优选是细菌酸稳定型α-淀粉酶。具体地，α-淀粉酶来自微小杆菌属物种或芽孢杆菌属物种(例如像嗜热脂肪芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌)。在一个实施例中，该α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，具体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如wo99/019467中的seqidno:3或本文的seqidno:10中所示的α-淀粉酶。在一个实施例中，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更具体地在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处的双缺失，和任选地n193f取代(使用seqidno:10进行编号)。在一个实施例中，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置s242处具有取代，优选s242q取代。在一个实施例中，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置e188处具有取代，优选e188p取代。在一个实施例中，该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，所述变体具有以下突变：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-i181*+g182*+n193f+v59aq89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；以及-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用seqidno:10进行编号)。在一个实施例中，该α-淀粉酶变体与seqidno:10的多肽具有至少75％同一性，优选地至少80％，更优选地至少85％，更优选地至少90％，更优选地至少91％，更优选地至少92％，甚至更优选地至少93％，最优选地至少94％，并且甚至最优选地至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％同一性。应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式产生。具体地，截短可以为这样使得wo99/19467中的seqidno:3或本文的seqidno:10中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在c-末端截短以优选地具有大约490个氨基酸，如从482-493个氨基酸。优选地，嗜热脂肪芽孢杆菌变体α-淀粉酶优选地在seqidno:10的位置484之后，具体是在位置485之后、具体是在位置486之后、具体是在位置487之后、具体是在位置488之后、具体是在位置489之后、具体是在位置490之后、具体是在位置491之后、具体是在位置492之后，更具体是在位置493之后被截短。可以使用本领域熟知的条件，用产碳水化合物源的酶，具体是葡糖淀粉酶或β-淀粉酶以及任选地去分支酶(例如异淀粉酶或支链淀粉酶)进行糖化。例如，全部糖化步骤可以持续从约24至约72小时。然而，常见地在30℃-65℃之间的温度(典型地约60℃)进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵(ssf)方法中，在发酵期间进行完全糖化。典型地在20℃-75℃的范围内的温度(例如，25℃-65℃和40℃-70℃，典型地60℃左右)，并且在约4与5之间的ph，一般在约ph4.5时进行糖化。糖化步骤和发酵步骤可以依序或同时进行。在一个实施例中，糖化和发酵是同时进行的(称为“ssf”)。然而，通常，在30℃至65℃、典型地约60℃的温度处执行一个预糖化步骤约30分钟至2小时(例如，30分钟至90分钟)，随后在被称为同时糖化和发酵(ssf)的发酵期间进行一个完全糖化。ph通常在4.2-4.8之间，例如，ph4.5。在同时糖化和发酵(ssf)过程中，没有糖化的保持阶段，而实际上是，酵母和酶是一起添加的。在典型糖化过程中，通过添加葡糖淀粉酶以及去分支酶，如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或支链淀粉酶，来将液化期间产生的麦芽糊精转化成右旋糖。添加葡糖淀粉酶以及去分支酶之前使温度降低至60℃。糖化过程进行24-72小时。在添加糖化酶之前，使ph降低至低于4.5，同时维持高温(高于95℃)，以便使液化α-淀粉酶失活。此过程减少了称为“潘糖前体”的短低聚糖的形成，这种短低聚糖不能通过去分支酶来适当水解。正常地，约0.2％-0.5％的糖化产物是分支三糖潘糖(glcpα1-6glcpα1-4glc)，它不能由支链淀粉酶降解。如果糖化过程中仍然存在来自液化步骤的活性淀粉酶(即未变性)，潘糖的量可以高至1％-2％，这是高度不希望的，因为它显著降低了糖化产率。其他发酵产物可以在本领域的普通技术人员熟知的、适于所讨论的发酵生物的条件和温度下发酵。可以通过本领域熟知的方法(例如，通过蒸馏)回收发酵产物。在下面的“酶”部分中披露了产碳水化合物源的酶的实例。在一个具体实施例中，本发明的方法在将含淀粉材料转化为糖/糊精之前进一步包含以下步骤：(x)减少该含淀粉材料的粒度；以及(y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。在一个实施例中，将该含淀粉材料碾磨，以减少粒度。在一个实施例中，该粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。该水性浆料可以包含含淀粉材料的从10-55wt.％干固体(ds)，优选25-45wt.％干固体(ds)，更优选30-40wt.％干固体(ds)。常规淀粉转化过程如液化以及糖化过程描述于例如美国专利号3,912,590、ep252730以及ep063909中，这些专利通过引用并入本文。在一个实施例中，转化方法将淀粉降解为较低分子量的碳水化合物成分，如糖或脂肪替代物，该方法包括一个脱支步骤。当将淀粉转化为糖时，淀粉被解聚。这类解聚过程由例如预处理步骤以及两个或三个连续过程步骤组成，即，液化过程、糖化过程并且取决于所需最终产物，任选的异构化过程。当所希望的最终糖产物是例如高果糖糖浆时，右旋糖糖浆可以被转化为果糖。糖化过程之后，将ph值增加至6-8范围内的值，例如ph7.5，并且通过离子交换除去钙。然后，使用例如固定化葡萄糖异构酶将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。发酵产物的生产可发酵的糖类(例如，糊精类、单糖类，具体是葡萄糖)由酶法糖化产生。这些可发酵的糖类可进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。另外，这些糖可在微生物发酵过程中用作发酵进料来产生最终产物，如醇(例如，乙醇以及丁醇)、有机酸(例如，丁二酸，3-hp以及乳酸)、糖醇(例如，甘油)、抗坏血酸中间物(例如，葡萄糖酸盐、2-酮基-d-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-d-葡萄糖酸盐以及2-酮基-l-古洛糖酸)、氨基酸(例如，赖氨酸)、蛋白质(例如，抗体及其片段)。在一个实施例中，将液化工艺步骤期间获得的可发酵的糖用于产生醇，并且具体是乙醇。在乙醇生产中，通常使用ssf过程，其中糖化酶以及发酵生物(例如，酵母)一起添加，并且然后在30℃-40℃温度下执行。发酵中所使用的生物取决于所需最终产物。典型地，如果乙醇是所需最终产物，则将酵母用作发酵生物。在一些优选实施例中，产乙醇微生物是酵母，并且尤其是酵母属如酿酒酵母菌株(美国专利号4,316,956)。各种酿酒酵母是可商购的并且这些包括(但不局限于)fali(弗莱希曼酵母公司(fleischmann’syeast))、superstart(奥泰公司(alltech))、fermiol(帝斯曼公司食品配料部(dsmspecialties))、redstar(乐斯福公司(lesaffre))以及angel醇酵母(天使酵母公司(angelyeastcompany)，中国)。这些方法中所使用的起始酵母的量是在合适时间内有效产生商业上有效量乙醇的量(例如，在小于72小时内从具有25％-40％之间ds的底物产生至少10％乙醇)。酵母细胞通常以约104至约1012、并且优选地从约107至约1010活酵母计数/ml发酵液的量来供应。在将酵母添加至醪液之后，使它典型地经受发酵约24-96小时，例如，35-60小时。温度在约26℃-34℃之间，典型地约32℃，并且ph是从ph3-6，例如，约ph4-5。除了发酵微生物(例如，酵母)以外，发酵还可包括营养物以及额外酶，这些额外酶包括植酸酶。酵母在发酵中的使用在本领域中是熟知的。在另外的实施例中，如本领域中已知的，适当发酵微生物的使用可产生发酵最终产物，包括例如甘油、1,3-丙二醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-d-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-d-葡萄糖酸盐、2-酮基-l-古洛糖酸、丁二酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更具体地说，当乳酸是所希望的最终产物时，可以使用乳酸杆菌属种(干酪乳杆菌(l.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是所希望的最终产物时，可以使用大肠杆菌；并且当2-酮基-d-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-d-葡萄糖酸盐以及2-酮基-l-古洛糖酸是所希望的最终产物时，柠檬泛菌可以用作发酵微生物。以上列举的列表只是实例并且本领域技术人员知道可用于获得所需最终产物的许多发酵微生物。由含经未经糊化的淀粉的材料生产发酵产物的工艺本发明涉及在含淀粉材料没有糊化(即，没有蒸煮)的情况下从含淀粉材料生产发酵产物的方法(通常被称为“粗淀粉水解”方法)。可在不使包含含淀粉材料以及水的水性浆料液化的情况下生产发酵产物如乙醇。在一个实施例中，本发明的方法包括：在低于初始糊化温度下、优选地在α-淀粉酶和/或产碳水化合物源的酶的存在下将(例如碾磨的)含淀粉的材料(例如颗粒状淀粉)糖化，以产生可以通过适合的发酵生物发酵成发酵产物的多种糖。在此实施例中，所希望的发酵产物例如乙醇是从未经糊化的(即，未蒸煮)，优选地经碾磨的谷粒如玉米中产生的。因此，在一方面，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，该方法包括使用产碳水化合物源的酶和发酵生物，在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度处，在本发明的变体蛋白酶的存在下将含淀粉材料同时糖化和发酵。糖化和发酵还可以是分开的。因而，在另一方面，本发明涉及生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在低于初始糊化温度的温度处使用产碳水化合物源的酶(例如葡糖淀粉酶)糖化含淀粉材料；以及(ii)使用发酵生物进行发酵；其中使用至少葡糖淀粉酶和本发明的变体蛋白酶进行步骤(i)。在一个实施例中，该发酵生物表达本发明的变体蛋白酶。在一个实施例中，在步骤(i)中还添加α淀粉酶。可以同时进行步骤(i)和(ii)。发酵之后，可以任选地例如通过蒸馏来回收发酵产物(例如乙醇)。典型地，在发酵期间存在淀粉酶如葡糖淀粉酶、和/或其他产碳水化合物源的酶、和/或α-淀粉酶。葡糖淀粉酶以及其他产碳水化合物源的酶的实例包括使原料淀粉水解的葡糖淀粉酶。α-淀粉酶的实例包括酸性α-淀粉酶如酸性真菌α-淀粉酶。发酵生物的实例包括酵母例如，酿酒酵母的菌株。术语“初始糊化温度”指淀粉的糊化发生的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始糊化；糊化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可根据植物物种、植物物种的具体品种、以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定的含淀粉材料的初始糊化温度是使用gorinstein和lii，1992，starch[淀粉]44(12):461-466所描述的方法，使5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。在开始该方法之前，可以制备具有10-55w/w％干固体(ds)、优选25-45w/w％干固体、更优选30-40w/w％干固体的含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)的浆料。该浆料可以包括水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水。由于本发明的工艺是在低于该初始糊化温度下进行的并且因此没有发生显著的粘度增加，所以如果希望的话，可以使用高水平的釜馏物。在一个实施例中，水性浆料含有约1至约70vol.％、优选15-60vol.％、尤其是约30至50vol.％的水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧线汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水，或其组合等。含淀粉的材料可以优选地通过干式或湿式碾磨来将粒度降低至0.05至3.0mm，优选地0.1-0.5mm而制备。在经受本发明的方法之后，含淀粉材料中至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或优选地至少99％的干固体被转化成可溶的淀粉水解产物。本发明此方面中的方法是在低于初始糊化温度的温度下进行的，意味着温度典型地在30℃-75℃之间、优选地在45℃-60℃之间的范围内。在一个优选的实施例中，该方法在从25℃至40℃，如从28℃至35℃，如从30℃至34℃，优选地约32℃的温度处进行。在一个实施例中，执行该方法以使得糖水平，如葡萄糖水平保持在低水平，如低于6w/w％，如低于约3w/w％，如低于约2w/w％，如低于约1w/w％，如低于约0.5w/w％，或低于0.25w/w％，如低于约0.1w/w％。通过简单地采用调整量的酶和发酵生物就可以实现这样的低水平的糖。本领域的普通技术人员可容易地确定有待使用的酶和发酵生物的剂量/数量。还可以选择酶和发酵生物的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，麦芽糖水平可保持低于约0.5w/w％，如低于约0.2w/w％。本发明的方法可以在从约3与7之间、优选地从ph3.5到6、或更优选地从ph4到5的ph下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，具体是24至96小时。由含经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法在此方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的方法，这些方法包括：液化步骤，以及依序地或同时地进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；(b)使用产碳水化合物源的酶来使步骤(a)中获得的液化材料糖化；(c)使用发酵生物进行发酵；其中本发明的变体蛋白酶在步骤b)或c)期间存在。在一个实施例中，该发酵生物表达本发明的变体蛋白酶。发酵产物，如尤其是乙醇，可以可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。发酵生物优选地是酵母，优选地是酿酒酵母菌株。在一个具体实施例中，本发明的方法在步骤(a)之前进一步包括以下步骤：x)优选地通过研磨(例如，使用锤磨机)来减小含淀粉材料的粒径；y)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。在一个实施例中，粒度是小于#7筛，例如#6筛。#7筛通常用于常规现有技术过程中。水性浆料可包含从10-55，例如25-45以及30-40w/w％干固体(ds)的含淀粉材料。将浆料加热至高于糊化温度并且可添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在一个实施例中，该浆料在步骤(a)中经受α-淀粉酶之前可以进行喷射蒸煮以进一步使该浆料糊化。在一个实施例中，液化可作为三步骤热浆料方法来执行。在ph4-6、优选地4.5-5.5下，将浆料加热至60℃-95℃之间、优选地70℃-90℃之间、如优选地80℃-85℃之间，并且任选地连同支链淀粉酶和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶一起添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在一个实施例中，然后，可将浆料在95℃-140℃、优选地100℃-135℃、如105℃-125℃之间的温度处喷射蒸煮约1-15分钟、优选地约3-10分钟、尤其是约5分钟。浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多α-淀粉酶变体以及任选地支链淀粉酶变体和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶，以完成水解(二次液化)。通常在ph4.0-6、具体是在从4.5至5.5之间的ph下进行液化过程。可使用本领域熟知的条件来进行糖化步骤(b)。例如，全部糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在介于30℃到65℃之间的温度处，典型地约60℃处进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(ssf过程)中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、优选地从40℃-70℃，典型地约60℃的温度处并且在4与5之间的ph下、一般在约ph4.5下进行。在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(ssf)方法，在该方法中，该糖化不存在保持阶段，意味着发酵生物(如酵母)和酶可以一起添加。ssf可典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、优选地约32℃℃的温度处执行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，具体是24至96小时。在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶在一个实施例中，在糖化期间存在的产碳水化合物源的酶可以是葡糖淀粉酶。在本发明的方法中，在糖化和/或发酵，优选同时糖化和发酵(ssf)(即，未经糊化的或经糊化的淀粉材料的糖化和发酵)中，存在和/或添加葡糖淀粉酶。在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选地来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株，优选瓣环栓菌(t.cingulata)；或密孔菌属的菌株，优选是血红密孔菌；或粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属(nigrofomes)的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是源自栓菌属，如瓣环栓菌的菌株，如示于本文的seqidno:4中的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含本文的seqidno:4的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:4的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是源自篮状菌属，如埃默森篮状菌的菌株，如示于本文的seqidno:5中的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含本文的seqidno:5的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:5的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是源自密孔菌属的菌株，具体是描述于wo2011/066576中的血红密孔菌的菌株(seqidno2、4或6)，如示为wo2011/066576中的seqidno:4的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含本文的seqidno:6的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:6的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是源自粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，具体是如在wo2011/068803中描述的粘褶菌属的菌株(seqidno:2、4、6、8、10、12、14或16)。在一个优选的实施例中，该葡糖淀粉酶是示于wo2011/068803中的seqidno:2或本文的seqidno:7中的篱边粘褶菌。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶是源自篱边粘褶菌，如示于本文的seqidno:7中的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含本文的seqidno:7的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:7的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在另一个实施例中，葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，如示于本文的seqidno:8中的密粘褶菌。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含本文的seqidno:8的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:8的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自黑层孔属(nigrofomes)的菌株，具体是披露于wo2012/064351中的黑层孔属物种的菌株。在一个实施例中，该葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20agu/gds，优选0.001-10agu/gds，尤其是0.01-5agu/gds之间，如0.1-2agu/gds。包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括amg200l；amg300l；santmsuper、santmextral、spirizymetmplus、spirizymetmfuel、spirizymetmb4u、spirizymetmultra、spirizymetmexcel和amgtme(来自诺维信公司(novozymesa/s))；optidextm300、gc480、gc417(来自杜邦公司(dupont.))；amigasetm和amigasetmplus(来自帝斯曼公司(dsm))；g-zymetmg900、g-zymetm和g990zr(来自杜邦公司)。根据本发明的一个优选实施例，在糖化和/或发酵中，葡糖淀粉酶是与α-淀粉酶相结合存在的和/或添加的。下面描述了适合的α-淀粉酶的实例。在糖化和/或发酵中存在和/或添加的α-淀粉酶在一个实施例中，在本发明的方法中，在糖化和/或发酵中存在和/或添加的α-淀粉酶。在一个优选实施例中，α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。在一个优选实施例中，α-淀粉酶是真菌酸稳定的α-淀粉酶。真菌酸性稳定的α-淀粉酶是在3.0至7.0的ph范围内，并且优选地在3.5至6.5的ph范围内具有活性的α-淀粉酶，包括在约4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0的ph时的活性。在一个优选实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶是源自根毛霉属的菌株，优选菌株微小根毛霉，如示于wo2013/006756中的seqidno:3中的菌株，如具有黑曲霉连接子和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，如示于本文的seqidno:9中的杂合体或其变体。在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含本文的seqidno:9的多肽的α-淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:9的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶是示于seqidno:9中的具有以下取代或取代的组合中的至少一个的α-淀粉酶的变体：d165m；y141w；y141r；k136f；k192r；p224a；p224r；s123h+y141w；g20s+y141w；a76g+y141w；g128d+y141w；g128d+d143n；p219c+y141w；n142d+d143n；y141w+k192r；y141w+d143n；y141w+n383r；y141w+p219c+a265c；y141w+n142d+d143n；y141w+k192rv410a；g128d+y141w+d143n；y141w+d143n+p219c；y141w+d143n+k192r；g128d+d143n+k192r；y141w+d143n+k192r+p219c；g128d+y141w+d143n+k192r；或g128d+y141w+d143n+k192r+p219c(使用seqidno:9用于编号)。在一个实施例中，源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(sbd)的微小根毛霉的α-淀粉酶，优选如本文seqidno:9披露的，优选具有一个或多个以下取代：g128d、d143n、优选g128d+d143n(使用seqidno:9用于编号)，并且其中糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶变体与本文的seqidno:9的多肽具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％同一性。在一个优选实施例中，在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶与α-淀粉酶之间的比率优选地可以在500:1至1:1，如从250:1至1:1、如从100:1至1:1、如从100:2至100:50、如从100:3至100:70的范围内。含淀粉材料可以在本发明的方法中使用任何适合的含淀粉起始材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适于在本发明的方法中使用的含淀粉起始材料的实例包括大麦、豆类、树薯(cassava)、谷物、玉米、买罗高梁(milo)、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、木薯(tapioca)、小麦以及全谷物或其任何混合物。该含淀粉材料还可以是蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。在一个优选的实施例中，该含淀粉材料是玉米。在一个优选的实施例中，该含淀粉材料是小麦。发酵产物术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物的发酵方法或过程生产的产品。发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、丁二酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，h2和co2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、b12、β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选的实施例中，该发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(maltliquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。在优选的实施例中，该发酵产物是乙醇。发酵生物术语“发酵生物”是指适于生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，例如酵母和丝状真菌。适合的发酵生物能够将可发酵糖(如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖或木糖)直接或间接地发酵(即，转化)为所希望的发酵产物。发酵生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母菌(saccharomyces)，具体是酿酒酵母或葡萄汁酵母(saccharomycesuvarum)；毕赤酵母属(pichia)，具体是树干毕赤酵母(pichiastipitis)的菌株，如树干毕赤酵母cbs5773，或巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)的菌株；假丝酵母属(candida)，具体是阿拉伯糖发酵假丝酵母(candidaarabinofermentans)、博伊丁假丝酵母(candidaboidinii)、迪丹斯假丝酵母(candidadiddensii)、休哈塔假丝酵母(candidashehatae)、萨纳瑞西斯假丝酵母(candidasonorensis)、假热带假丝酵母(candidatropicalis)、或产朊假丝酵母(candidautilis)。其他发酵生物包括汉逊酵母属的菌株，具体是异常汉森酵母或多形汉逊酵母；克鲁弗酵母属的菌株，具体是脆壁克鲁弗酵母或马克斯克鲁弗酵母(kluyveromycesmarxianus)；以及裂殖酵母属的菌株，具体是粟酒裂殖酵母。优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属的菌株，具体是大肠杆菌；发酵单胞菌属的菌株，具体是运动发酵单胞菌；发酵杆菌属的菌株，具体是棕榈科发酵杆菌(zymobactorpalmae)；克雷伯菌属的菌株，具体是产酸克雷伯菌；明串珠菌属的菌株，具体是肠膜状明串珠菌；梭菌属的菌株，具体是丁酸梭菌；肠杆菌属的菌株，具体是产气肠杆菌；以及高温厌氧杆菌属的菌株，具体是高温厌氧杆菌bg1l1(appl.microbiol.biotech.[应用微生物学与生物技术]77:61-86)、产乙醇高温厌氧杆菌(thermoanarobacterethanolicus)、产甲烷高温厌氧杆菌(thermoanaerobactermathranii)或热解糖高温厌氧杆菌(thermoanaerobacterthermosaccharolyticum)。乳杆菌属的菌株也被预期，如谷氨酸棒状杆菌r、嗜热葡糖苷酶芽孢杆菌(bacillusthermoglucosidaisus)和嗜热葡糖苷酶土芽孢杆菌(geobacillusthermoglucosidasius)的菌株。在一个实施例中，该发酵生物是c6糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。在一个实施例中，该发酵生物是c5糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。在一个实施例中，将该发酵生物添加至发酵介质中，这样使得每ml的发酵介质的活发酵生物(如酵母)计数在从105至1012个的范围内，优选从107至1010个，尤其是约5x107个。酵母是用于乙醇发酵的优选发酵生物。优选的是酵母属的菌株，尤其是酿酒酵母种的菌株，优选是对高水平的乙醇(即，直到例如约10、12、15或20vol.％或更多的乙醇)耐受的菌株。在一个实施例中，利用c5的酵母是披露于wo2004/085627中的酿酒酵母菌株。在一个实施例中，发酵生物是wo2010/074577(内达尔科(nedalco))中关注的c5真核微生物细胞。在一个实施例中，发酵生物是披露于us2008/0014620中的能够直接将木糖同分异构化为木酮糖的经转化c5真核细胞。在一个实施例中，发酵生物是披露于wo2009/109633中的c5糖发酵细胞。可商购的酵母包括lnfsa-1、lnfbg-1、lnfpe-2和lnfcat-1(可获得自巴西的lnf)，redstartm和ethanolredtm酵母(可获得自富酶泰斯/乐斯富(fermentis/lesaffre)，美国)，fali(可获得自弗莱施曼酵母(fleischmann’syeast)，美国)，superstart和thermosacctm新鲜酵母(可获得自乙醇技术(ethanoltechnology)，威斯康星州(wi)，美国)，biofermaft和xr(可获得自nabc-北美生物产品集团(nabc-northamericanbioproductscorporation)，佐治亚州(ga)，美国)，gertstrand(可获得自格特·斯特兰德ab公司(gertstrandab)，瑞典)以及fermiol(可获得自帝斯曼食品配料部(dsmspecialties))。能够从可发酵糖生产所希望的发酵产物的发酵生物优选在精确条件下以具体生长速率生长。当将该发酵生物引入进/添加至发酵培养基中时，接种的发酵生物经过多个阶段。不出现原始生长。此时期称为“停滞期”并且可以被认为是适应时期。在称为“对数期”的接下来的阶段过程中，生长速率逐渐增加。在最大生长期间后，速率停止并且发酵生物进入“静止期”。在另外的时间段后，发酵生物进入“死亡期”，其中活细胞的数目下降。发酵基于例如植物材料的种类、可获得的可发酵糖、发酵生物和/或所希望的发酵产物确定发酵条件。本领域的普通技术人员可以容易地确定适合的发酵条件。发酵可以在常规使用的条件下进行。优选的发酵过程是厌氧过程。例如，发酵可以在高达75℃，例如40℃-70℃之间，如50℃-60℃之间的温度处进行。然而，还已知的是细菌具有低至室温左右(20℃左右)的显著较低的最适温度。适合的发酵生物的实例可以发现于上面的“发酵生物”部分中。对于使用酵母生产乙醇，发酵可以持续24至96小时，具体是持续35至60小时。在一个实施例中，在20℃至40℃，优选26℃至34℃之间，具体是32℃左右的温度处进行发酵。在一个实施例中，ph是从ph3至6，优选ph4至5左右。其他发酵产物可以在本领域的普通技术人员已知的、适于所讨论的发酵微生物的温度处发酵。典型地在3与7之间的范围内的ph，优选从ph3.5至6，如ph5左右下进行发酵。发酵典型地持续6-96小时。本发明的方法可以作为分批过程或作为连续过程进行。发酵可以在超滤系统中进行，其中将渗余物在固体、水和发酵生物的存在下保持在再循环之下，并且其中渗透物是含有所希望的发酵产物的液体。同样考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中执行的方法/工艺，并且其中将渗余物在固体、水和发酵生物的存在下保持在再循环之下，并且其中渗透物是含有发酵产物的液体。发酵后，可以将发酵生物与发酵的浆料分开并再循环。发酵培养基短语“发酵培养基(fermentationmedia)”或“发酵培养基(fermentationmedium)”是指进行发酵的环境并且包括发酵底物，即被发酵生物代谢的碳水化合物来源。发酵培养基可以包括针对发酵生物的其他营养素和生长刺激剂。营养物和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，且包括氮源如氨；维生素和矿物质或其组合。回收继发酵之后，可以将发酵产物从发酵培养基分离。可以将发酵介质蒸馏以提取所希望的发酵产物或可以通过微滤或膜过滤技术从发酵介质中提取所希望的发酵产物。可替代地，可以通过汽提回收发酵产物。回收方法在本领域中是熟知的。在以下编号的段落中进一步定义本发明：段落1.一种蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置1、5、9、25、29、30、32、38、39、40、41、42、45、46、49、50、53、54、55、57、59、60、61、62、64、67、68、69、74、76、77、78、79、80、81、82、87、93、94、96、99、102、103、105、109、111、112、114、115、117、122、123、124、128、130、136、141、142、145、146、147、150、153、154、157、159、161、167、169、175、182、185、199、200、205、207、209、210、213、216、217、225、228、231、234、237、242、244、245、246、248、258、262、266、267、269、271、272、276、278、280、284、289、293、296、299、305、308、313、314、317、318、319、321、322、324、325、326、329、330、331、333、336、338、341、343、345、347、348、355、358、359、361、362、363和364处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体与seqidno:3的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体与seqidno:3的蛋白酶相比具有作为改进因子hif测量的增加的热稳定性。段落2.如段落1所述的变体，其包含在选自下组的一个或多个位置处的取代，该组由以下组成：a1t、s5i、s5k、s5l、s5y、t9h、k25p、s29i、s29p、s29r、s30e、k32w、f38l、i39g、i39l、i39v、i39y、d40f、d40g、d40h、d40n、d40p、q41i、q41v、f42c、f42k、f42s、f42y、k45l、k45m、k45y、a46c、a46e、k49p、s50c、s50i、s50l、s50m、s50q、a53c、a53e、a53v、q54i、q54l、q54m、q54v、f55h、f55l、k57p、k57s、i59g、i59m、i59p、s60p、s61l、s61p、s62c、s62n、s62p、t64g、t64i、l67v、q68v、q68y、t69c、e74h、e74r、d76l、d76r、q77l、s78d、p79y、s80l、e81a、e81h、e81k、e81l、e81p、e81y、a82f、a82l、a82m、a82p、n87s、t93l、t93s、v94s、l96w、g99c、t102l、t102v、t103i、t103k、t103v、i105q、d109h、d109k、d109m、d109y、f111h、f111k、f111s、f111y、q112r、g114l、n115a、n115c、n115k、n115p、n115r、n115t、n115y、e117d、e117g、e117h、e117n、e117q、e117s、i122k、i122r、i123a、n124l、n124v、g128a、g128e、g128f、g128l、g128s、s130d、s130g、s130l、s130n、s130p、l136k、g141t、q142a、q142f、q142l、q142n、n145v、t146a、t146i、t146l、t146n、i147s、k150f、k150l、k150r、n153a、n153l、n153m、n153p、n153r、n153y、q154a、q154i、q154l、q154m、q154n、q154t、q154v、n157i、n157l、y159h、q161e、t167f、i169f、i169s、d175i、d175n、q182c、q182t、q182v、h185p、f199l、f199m、m200s、a205s、q207h、q207l、v209f、s210t、t213l、t213r、a216r、f217i、f217y、v225y、i228l、i228t、i228w、y231i、s234q、s237f、s237q、a242i、a242l、a242v、g244s、s245p、t246s、s248y、f258p、s262p、v266k、v266r、d267a、d267h、d267l、d267n、q269l、v271r、s272i、s272k、s272l、s272r、s272t、s272v、s272y、t276l、t276y、g278p、d280n、d280s、d280t、d280y、c284a、c284g、f289y、i293t、v296a、v296i、r299n、k305s、l308v、p313l、f314i、f314l、s317e、s317n、s317w、s318p、a319f、a319q、k321l、k321q、k321s、a322d、l324q、l324s、n325l、d326p、s329c、s329h、s329i、s329l、s329n、s329t、s329v、s329w、g330q、s331w、s331y、p333r、s336k、s336n、n338m、n338q、n338r、p341s、k343a、k343h、k343s、k343t、k343v、g345s、d347i、p348y、p355i、p355r、a358l、a358p、a358r、a358y、k359l、k359s、l361m、t362l、t362n、a363g、a363l和v364i，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子hif测量的至少1.4的热稳定性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落3.如段落1所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：s5k、s5l、s5y、t9h、k25p、s29r、s30e、k32w、f38l、i39g、i39l、i39v、i39y、d40f、d40g、d40h、d40n、d40p、q41i、q41v、f42c、f42k、f42s、f42y、k45l、k45m、k45y、a46c、k49p、s50i、s50l、s50m、s50q、a53c、a53e、a53v、q54i、q54l、q54m、q54v、f55h、f55l、k57p、k57s、i59g、i59m、i59p、s60p、s61l、s61p、s62c、s62n、s62p、t64g、t64i、l67v、q68v、q68y、t69c、e74r、d76l、d76r、q77l、s78d、p79y、s80l、e81a、e81h、e81k、e81l、e81p、e81y、a82m、a82p、n87s、t93l、v94s、g99c、t102l、t102v、t103i、t103k、t103v、i105q、d109h、d109k、d109m、d109y、f111h、f111k、f111s、q112r、g114l、n115c、n115k、n115r、n115t、n115y、e117d、e117g、e117h、e117n、e117q、e117s、i122r、n124l、g128f、g128s、s130g、s130n、s130p、l136k、g141t、q142a、q142f、q142l、q142n、n145v、t146a、t146l、t146n、i147s、k150l、n153m、n153p、n153r、q154i、q154l、q154n、q154t、q154v、n157l、q161e、t167f、i169f、d175n、q182c、q182t、q182v、f199l、f199m、m200s、a205s、q207h、q207l、v209f、s210t、t213r、f217i、v225y、i228l、i228t、i228w、s234q、s237f、g244s、s245p、t246s、s248y、f258p、s262p、v266k、v266r、d267a、d267h、d267l、d267n、q269l、v271r、s272k、s272l、s272r、s272v、s272y、t276y、g278p、d280n、d280s、d280t、c284g、f289y、i293t、v296a、r299n、k305s、l308v、f314l、s317e、s317w、s318p、a319f、a319q、k321l、k321q、k321s、a322d、l324q、l324s、d326p、s329c、s329h、s329i、s329l、s329n、s329w、g330q、s331w、s331y、s336k、s336n、p341s、k343a、k343h、k343s、k343t、g345s、d347i、p348y、p355i、a358l、a358p、a358r、a358y、k359l、k359s、l361m、t362l、a363g、a363l和v364i，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子hif测量的至少1.6的热稳定性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落4.如段落1所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：s5k、s5l、s5y、t9h、k25p、s30e、f38l、i39g、i39l、i39v、i39y、d40f、d40g、d40h、d40n、d40p、q41i、q41v、f42k、f42y、k45l、k45m、k45y、a46c、k49p、s50i、s50l、s50m、s50q、a53c、a53e、a53v、q54l、q54m、f55h、f55l、k57p、k57s、i59g、i59m、i59p、s60p、s61p、s62n、s62p、t64g、t64i、l67v、q68v、q68y、t69c、e74r、d76l、d76r、q77l、s78d、p79y、e81a、e81k、e81l、e81p、e81y、a82p、n87s、t93l、v94s、g99c、t102l、t102v、t103i、t103k、t103v、i105q、d109h、d109k、d109m、d109y、f111h、f111k、f111s、q112r、g114l、n115r、e117g、e117h、e117n、e117q、e117s、i122r、n124l、g128s、s130g、s130n、s130p、l136k、q142a、q142l、q142n、n145v、t146a、t146l、i147s、k150l、n153m、n153r、q154i、q154l、q154n、q154t、q154v、n157l、q161e、t167f、i169f、d175n、q182c、q182v、f199l、f199m、m200s、q207h、s210t、t213r、f217i、i228l、i228t、i228w、s237f、g244s、t246s、s248y、f258p、s262p、v266k、v266r、d267a、d267h、d267n、v271r、s272k、s272l、s272r、s272v、s272y、t276y、g278p、d280n、d280s、d280t、c284g、f289y、i293t、v296a、k305s、l308v、f314l、s317e、s317w、s318p、a319f、a319q、l324s、d326p、s329c、s329i、s329l、s329n、s329w、g330q、s331w、s331y、s336n、p341s、k343h、k343s、k343t、g345s、d347i、p355i、a358p、a358r、a358y、k359l、k359s、t362l、a363l和v364i，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子hif测量的至少1.8的热稳定性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落5.如段落1所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：s5k、s5y、k25p、s30e、i39g、i39l、i39y、d40f、d40g、d40h、d40n、d40p、q41i、q41v、f42k、k45m、k45y、a46c、s50i、s50l、s50m、s50q、a53c、a53v、q54m、f55h、f55l、k57p、k57s、i59m、i59p、s60p、s61p、t64i、q68v、q68y、e74r、d76l、d76r、s78d、p79y、e81a、e81k、e81l、e81p、a82p、n87s、t93l、v94s、t102l、t102v、t103i、t103k、t103v、d109h、d109k、d109m、d109y、f111h、f111k、f111s、g114l、n115r、e117g、e117h、e117n、i122r、g128s、s130g、s130n、l136k、q142l、q142n、n145v、t146a、t146l、i147s、k150l、n153m、n153r、q154l、q154n、q154t、q154v、n157l、i169f、d175n、f199l、m200s、s210t、t213r、f217i、i228l、i228w、s237f、g244s、t246s、s262p、v266k、d267h、d267n、v271r、s272l、s272v、s272y、t276y、g278p、d280s、d280t、c284g、f289y、i293t、v296a、s317e、s317w、s318p、a319f、l324s、d326p、s329c、s329i、s329w、g330q、s331y、s336n、p341s、k343t、d347i、p355i、a358p、a358r、a358y、k359l、t362l和a363l，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子hif测量的至少2.2的热稳定性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落6.如段落1所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：s5k、i39g、i39l、i39y、d40h、f42k、k45m、a46c、s50i、s50m、a53c、q54m、f55h、f55l、k57p、k57s、i59m、i59p、t64i、q68y、e74r、d76l、s78d、p79y、e81k、e81l、n87s、t93l、t102v、t103i、t103k、t103v、d109h、d109y、f111h、f111k、f111s、n115r、e117g、e117h、i122r、l136k、q142l、q142n、t146l、i147s、n153r、q154l、q154n、q154t、n157l、i169f、d175n、f199l、m200s、s210t、t213r、i228l、s237f、t246s、s262p、d267n、v271r、s272v、s272y、t276y、d280s、d280t、c284g、f289y、i293t、v296a、s317e、s317w、a319f、l324s、s329i、s329w、s331y、s336n、p341s、d347i、p355i和t362l，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子hif测量的至少3.2的热稳定性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落7.如段落1所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：i39g、d40h、k45m、a46c、s50i、a53c、f55h、f55l、k57p、t64i、e74r、p79y、t102v、n115r、e117h、i147s、n157l、d175n、f199l、s210t、i228l、d267n、d280t、c284g、v296a、s317e、a319f、s329i、p341s、d347i和p355i，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子hif测量的至少6.4的热稳定性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落8.一种蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置20、27、29、34、40、42、45、46、50、53、54、55、58、59、60、61、62、66、69、76、81、87、93、96、98、101、102、103、109、110、115、117、122、124、125、127、128、130、136、141、142、145、146、148、149、150、153、154、157、159、161、164、167、182、183、184、185、188、199、200、207、208、209、210、211、213、216、219、228、231、237、244、249、252、253、261、266、267、272、275、276、277、280、285、288、291、292、293、294、296、299、303、304、305、306、307、308、310、317、318、319、321、326、327、336、338、341、344、345、348、356、358、359、361、362、363和364处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体与seqidno:3的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体与seqidno:3的蛋白酶相比具有作为改进因子aif测量的增加的比活性。段落9.如段落8所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：g20l、g20r、t27s、s29a、s29c、s29l、s29n、s29p、s29r、a34l、a34n、a34r、d40s、d40y、f42y、k45l、k45y、a46e、a46k、s50a、s50c、s50i、s50l、s50t、a53i、a53k、a53l、a53s、q54l、f55r、d58m、i59m、i59p、s60c、s60e、s60p、s61d、s61p、s62c、s62n、s66f、s66l、s66m、s66t、t69c、d76a、d76g、d76k、d76l、d76n、d76p、d76v、d76y、e81s、n87f、t93s、l96f、l96s、l96t、t98l、p101f、p101l、p101m、p101r、t102c、t102i、t103v、d109p、d110w、n115a、n115d、n115g、n115p、e117d、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117s、e117w、e117y、i122l、n124d、n124i、n124k、n124l、n124m、n124t、n124v、f125k、f125l、f125m、l127c、l127p、g128n、g128r、g128s、g128w、g128y、s130d、s130f、s130i、s130n、l136c、g141a、g141c、g141f、g141l、g141m、g141q、g141r、g141v、q142a、q142l、q142m、q142s、q142w、n145f、n145g、n145i、n145l、n145p、n145r、n145s、n145v、n145w、t146a、t146c、t146h、t146i、t146m、t146n、t146q、t146r、t146v、t146w、s148g、a149v、k150f、n153d、n153f、n153g、n153r、n153y、q154c、q154f、q154g、q154i、q154k、q154l、q154m、q154r、q154t、q154v、q154w、q154y、n157a、n157e、n157f、n157m、n157y、y159f、y159g、y159h、y159s、q161a、a164l、t167d、t167v、q182f、s183a、s183f、s183l、s183m、a184d、a184f、a184h、a184i、a184k、a184l、a184q、a184r、a184s、a184t、a184v、a184w、a184y、h185a、h185l、h185p、h185s、n188l、n188q、f199l、m200f、m200l、q207f、g208h、g208y、v209f、v209g、v209h、v209l、v209n、v209w、v209y、s210e、s210l、s210r、s210t、s210y、p211f、t213f、t213h、t213i、t213l、t213n、t213r、t213s、t213w、t213y、a216f、a216l、s219m、i228f、i228h、i228l、i228m、i228q、i228v、i228y、y231f、y231s、s237f、s237i、s237k、s237l、g244l、g244n、g244p、g244r、g249c、n252f、n252k、n252s、r253c、v261a、v261g、v266c、v266r、d267s、s272i、s272k、s272l、s272m、s272q、s272r、s272t、s272y、q275a、q275f、q275k、q275l、q275r、q275v、t276f、t276r、t276v、i277l、i277v、d280f、d280h、d280m、d280n、d280s、d280t、a285l、a285s、t288c、t288i、t288v、s291v、v292c、i293m、i293y、s294t、s294v、v296l、r299p、a303c、a303f、a303h、a303s、a303v、g304h、g304k、g304p、g304r、g304s、g304y、k305c、k305f、k305h、k305i、k305l、k305m、k305s、k305t、k305y、s306l、s306m、s306r、p307c、l308p、l308t、f310m、f310p、f310y、s317a、s317c、s317g、s317h、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、s317y、s318n、s318r、a319f、a319w、k321r、k321s、d326p、v327c、v327t、s336r、n338h、n338s、n338t、p341i、p341n、p341r、a344k、a344l、a344p、g345k、g345s、p348g、p348l、p348s、n356l、n356y、a358f、a358l、a358p、k359c、k359l、k359s、k359w、l361e、l361m、l361p、l361r、l361s、l361t、l361v、t362a、t362c、t362h、t362i、t362k、t362l、t362m、t362p、t362q、t362r、t362v、t362y、a363e、a363f、a363l、a363m、a363v、v364f、v364i、v364l、v364m和v364s，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少1.37的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落10.如段落8所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：g20l、g20r、t27s、s29a、s29c、s29l、s29n、s29p、s29r、a34l、a34n、a34r、f42y、k45l、k45y、a46e、a46k、s50a、s50l、a53l、q54l、f55r、i59m、i59p、s60e、s60p、s61d、s61p、s62n、s66m、s66t、t69c、d76a、d76g、d76k、d76l、d76n、d76p、d76v、d76y、e81s、n87f、t93s、l96f、l96s、l96t、t98l、p101f、p101l、p101m、p101r、t102c、t102i、t103v、d109p、d110w、n115a、n115d、n115g、n115p、e117d、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117s、e117w、e117y、n124d、n124i、n124k、n124l、n124m、n124t、n124v、f125k、f125l、f125m、l127c、l127p、g128n、g128r、g128s、g128w、g128y、s130d、s130f、s130i、s130n、l136c、g141a、g141c、g141f、g141l、g141m、g141q、g141r、g141v、q142a、q142l、q142m、q142s、q142w、n145f、n145g、n145i、n145l、n145p、n145r、n145s、n145v、n145w、t146a、t146c、t146h、t146i、t146m、t146n、t146q、t146r、t146v、t146w、s148g、a149v、k150f、n153y、q154i、q154k、q154l、q154m、q154r、q154w、n157f、n157y、y159h、y159s、q161a、t167d、q182f、a184f、a184i、a184k、a184v、a184w、h185a、n188l、f199l、m200f、m200l、q207f、g208h、g208y、v209f、v209g、v209h、v209l、v209n、v209w、v209y、s210e、s210l、s210r、s210t、s210y、p211f、t213f、t213i、t213l、t213n、t213r、t213s、t213w、a216f、s219m、i228f、i228h、i228l、i228m、i228q、i228v、i228y、y231f、y231s、s237f、s237i、s237k、s237l、g244n、g249c、n252f、v261a、v261g、v266c、v266r、d267s、s272i、s272l、s272m、s272q、s272r、s272t、s272y、q275f、q275k、q275l、q275r、q275v、t276f、t276r、t276v、i277l、i277v、d280f、d280h、d280m、d280n、d280s、d280t、a285s、t288c、t288v、i293y、s294t、s294v、a303f、g304h、g304k、g304p、g304r、g304s、k305c、k305f、k305h、k305i、k305s、k305t、s306l、s306r、p307c、l308p、l308t、f310m、f310p、f310y、s317a、s317c、s317g、s317h、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、s317y、s318n、s318r、a319f、a319w、k321r、k321s、d326p、v327c、v327t、s336r、n338h、n338s、n338t、p341i、p341n、p341r、a344k、a344l、a344p、g345k、g345s、p348g、p348l、p348s、n356l、n356y、a358l、k359s、k359w、l361p、l361r、t362c、t362h、t362i、t362k、t362m、t362r、t362y、a363f和v364m，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少2.0的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落11.如段落8所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：g20l、g20r、t27s、s29a、s29c、s29l、s29n、s29p、s29r、a34l、a34n、a34r、k45y、a46e、s50l、a53l、f55r、i59m、s60e、s60p、s61p、s62n、s66m、s66t、t69c、d76a、d76g、d76k、d76l、d76n、d76p、d76v、d76y、e81s、n87f、t93s、l96f、l96s、l96t、t98l、p101f、p101l、p101m、p101r、t102c、t102i、t103v、d109p、d110w、n115a、n115d、n115g、e117d、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117s、e117w、e117y、n124i、n124k、n124l、n124m、n124v、f125k、f125l、f125m、l127c、l127p、g128n、g128r、g128s、g128w、g128y、s130d、s130f、s130i、s130n、l136c、g141a、g141c、g141f、g141l、g141m、g141q、g141r、g141v、q142a、q142l、q142m、q142s、q142w、n145f、n145g、n145i、n145p、n145r、n145s、n145v、n145w、t146a、t146c、t146h、t146i、t146m、t146n、t146q、t146r、t146v、t146w、s148g、a149v、n153y、q154i、q154l、q154r、n157f、y159h、y159s、t167d、q182f、a184f、a184i、a184k、a184w、f199l、m200l、g208h、g208y、v209f、v209g、v209h、v209l、v209n、v209y、s210e、s210l、t213f、t213i、t213n、t213r、i228f、i228l、i228q、i228v、i228y、y231f、y231s、s237f、s237i、s237k、s237l、g244n、g249c、v261a、v266r、d267s、s272i、s272l、s272q、s272r、s272t、s272y、q275k、q275l、q275r、q275v、t276f、t276v、i277l、d280f、d280m、d280n、d280s、d280t、a285s、t288v、i293y、s294t、s294v、g304h、g304k、g304p、g304r、g304s、k305f、k305h、k305i、k305t、s306l、p307c、l308p、f310m、f310p、f310y、s317a、s317c、s317g、s317h、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、s317y、s318n、s318r、a319f、a319w、k321r、k321s、d326p、v327c、v327t、s336r、n338h、n338s、n338t、p341i、p341n、p341r、a344k、a344l、g345k、g345s、p348g、p348l、p348s、n356l、n356y、a358l、k359s、l361p、l361r、t362c、t362h、t362i、t362y和v364m，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少2.2的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落12.如段落8所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：g20l、g20r、s29a、s29c、s29n、s29p、a34n、a34r、a46e、s50l、f55r、i59m、s60e、s60p、s61p、s62n、s66m、d76a、d76g、d76k、d76l、d76n、d76p、d76v、d76y、e81s、n87f、l96f、l96s、l96t、t98l、p101f、p101l、p101m、p101r、t102c、t102i、t103v、d109p、n115a、n115d、n115g、e117d、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117w、e117y、n124i、n124k、n124v、f125l、f125m、l127p、g128n、g128s、g128w、g128y、s130d、s130f、g141a、g141f、g141l、g141m、g141q、g141r、q142a、q142l、q142m、q142s、q142w、n145g、n145i、n145s、n145w、t146a、t146h、t146n、t146v、t146w、q154r、y159h、y159s、t167d、q182f、f199l、g208h、g208y、v209f、v209g、v209h、v209l、v209n、v209y、s210l、t213i、i228l、i228q、i228y、y231f、y231s、s237f、s237i、s237k、s237l、g244n、v261a、v266r、d267s、s272l、s272t、s272y、q275k、q275r、t276f、t276v、i277l、d280f、d280n、d280s、d280t、a285s、s294t、g304h、g304k、g304p、g304r、g304s、k305h、k305i、l308p、f310m、f310p、s317c、s317g、s317h、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、s317y、a319f、k321s、d326p、v327c、s336r、n338h、p341i、p341n、p341r、g345k、g345s、p348g、p348s、n356y、a358l、l361p、t362i和v364m，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少2.6的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落13.如段落8所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：s29n、a34n、a34r、i59m、s60p、d76a、d76g、d76k、d76l、d76n、d76p、d76v、d76y、n87f、l96f、l96s、t98l、p101l、p101m、t102c、t102i、d109p、n115a、e117d、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117w、e117y、n124i、n124k、n124v、f125l、g128n、g128w、s130d、s130f、g141f、g141l、g141m、g141q、g141r、q142a、q142l、q142m、q142s、q142w、n145i、n145s、t146h、t146n、t146w、q154r、y159s、t167d、q182f、v209f、v209h、v209l、i228q、y231s、s237i、s237l、d267s、s272t、s272y、t276f、t276v、d280f、d280s、d280t、a285s、s294t、g304h、g304p、k305h、f310m、f310p、s317c、s317g、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、s317y、a319f、d326p、v327c、n338h、p341n、p341r、g345k、g345s、p348s、n356y和l361p，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少3.0的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落14.如段落8所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：s29n、a34n、a34r、i59m、s60p、d76a、d76k、d76l、d76n、d76p、d76y、n87f、l96f、d109p、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117w、e117y、n124v、g141f、g141l、g141m、g141r、q142l、q142m、q142s、q142w、t146h、t146n、q154r、v209f、v209h、i228q、t276f、d280t、a285s、s294t、f310m、f310p、s317c、s317i、s317k、s317l、s317r、s317w、d326p、n338h、p341n、p341r、g345k、g345s、p348s、n356y和l361p，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少3.8的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落15.如段落8所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：a34n、a34r、d76a、d76k、d76l、d76n、d76y、n87f、e117f、e117g、e117l、e117n、e117p、e117w、e117y、g141l、g141m、q142l、q142m、q142s、q142w、t146h、t146n、q154r、v209h、t276f、a285s、s294t、f310m、f310p、s317i、s317k、s317r、s317w、n338h和g345s，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子aif测量的至少4.5的比活性的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落16.如段落1-15中任一项所述的变体，其中该变体包含选自下组的取代，该组由以下组成：i39l、k57p、i59m、s66t、t102v、f111h、n115k、d267n、s272y、q275k、d280s，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落17.如段落16所述的变体，其中该变体具有作为在56℃下热应力持续20min后的残余活性测量的增加的热稳定性。段落18.如段落17所述的变体，其中该残余活性为至少50％，具体是至少60％、至少70％、至少80％。段落19.如段落16-18中任一项所述的变体，其中该变体包含至少三个选自下组的取代，该组由以下组成：i39l、k57p、i59m、s66t、t102v、f111h、n115k、d267n、s272y、q275k、d280s。段落20.如段落19所述的变体，其包含取代i39l+s66t+t102v或d267n+s272y+q275k+d280s。段落21.如权利要求20中任一项所述的变体，其包含如下取代：i39l+s66t+t102v；i39l+s66t+t102v+d267ns272y+d280s；i39l+k57p+i59m+s66t+t102vf111h+n115k+d267n+s272y、i39l+k57p+i59m+s66t+t102v+f111h+n115k+d280s；或d267n+s272y+q275k+d280s。段落22.一种蛋白酶变体，其在对应于seqidno:3的多肽的位置2、17、22、41、41、42、45、46、54、55、57、59、60、61、62、63、64、66、69、80、82、84、87、98、99、102、103、112、114、115、129、131、134、149、159、167、169、199、200、205、207、209、211、213、217、242、250、266、267、269、270、271、272、274、278、279、280、284、288、291、292、294、296、301、307、314、329、331、333、336、362和363处的一个或多个位置处包含取代，并且该变体具有蛋白酶活性，并且其中该变体与seqidno:3的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中该变体与seqidno:3的蛋白酶相比具有作为改进因子eif测量的增加的表达水平。段落23.如段落22所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：i2l、a17p、p22v、q41l、q41t、q41v、q41y、f42r、k45s、a46l、a46w、q54r、q54s、q54v、q54y、f55l、f55n、f55t、f55y、k57h、k57l、k57v、i59d、i59k、i59r、i59s、i59v、s60i、s60l、s60q、s60r、s60y、s61a、s61f、s62h、s62i、s62l、s62r、s62v、t63a、t63e、t63g、t63r、t63v、t64c、t64d、t64m、s66g、t69a、t69f、t69p、t69r、t69y、s80g、s80l、s80n、s80t、a82h、i84g、n87p、t98c、g99v、t102a、t102h、t103f、t103i、t103v、q112h、q112m、q112r、q112s、g114a、g114c、g114l、g114p、n115y、e129l、e129s、e129v、e129y、n131i、n131s、n131v、q134a、q134l、q134r、a149d、y159f、y159l、t167a、t167l、t167s、t167w、i169s、f199y、m200l、a205s、q207n、v209p、p211f、p211s、t213s、f217i、a242e、k250r、v266a、v266f、v266l、v266s、v266t、v266y、d267f、d267l、d267t、d267v、q269c、q269f、q269i、q269s、q269t、q269v、q269x、i270a、i270c、i270l、i270s、v271f、v271i、v271k、v271m、v271s、v271y、s272a、s272n、g274r、g278s、v279i、d280y、c284a、t288a、t288c、t288g、s291v、v292s、s294g、v296p、v296r、v296t、i301t、p307t、f314l、s329d、s329v、s331a、s331g、s331t、p333v、s336g、s336l、s336t、t362r和a363t，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子eif测量的至少1.38的表达水平的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落24.如段落22所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：i2l、a17p、p22v、q41l、q41y、f42r、q54r、q54s、q54y、f55n、f55t、k57l、k57v、i59d、i59s、i59v、s60l、s60q、s60r、s60y、s61f、s62l、s62v、t63a、t63e、t63r、t64c、t64d、t64m、q112h、q112m、q112r、q112s、g114a、g114c、g114l、g114p、n115y、e129l、e129s、e129v、e129y、n131i、n131s、n131v、q134a、q134l、q134r、a149d、t167a、t167s、t167w、f199y、a242e、k250r、v266a、v266f、v266l、v266s、v266t、v266y、d267f、d267l、d267t、d267v、q269c、q269f、q269i、q269s、q269t、q269v、q269x、i270a、i270c、i270l、i270s、v271f、v271i、v271k、v271m、s272a、g274r、g278s、t288a、t288c、t288g、v296p、v296r、v296t、f314l、s329d、s329v、s331a、s331g、s331t、p333v、s336g、s336l和s336t，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子eif测量的至少1.6的表达水平的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落25.如段落22所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：i2l、a17p、p22v、q41y、f42r、k57l、i59s、t63a、t63r、q112h、q112m、q112r、q112s、g114a、g114l、g114p、e129l、e129s、e129y、n131i、n131s、n131v、q134l、q134r、t167w、k250r、v266a、v266l、v266t、d267f、d267l、d267t、d267v、q269c、q269f、q269i、q269t、q269v、q269x、i270a、i270l、i270s、v271i、v271m、g274r，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子eif测量的至少1.75的表达水平的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落26.如段落22所述的变体，其包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：q112m、q112s、g114l、e129y、n131i、q134r、k250r、d267f、d267l、d267v、q269c、q269v、i270a、i270l、v271i、g274r，其中这些位置对应于在seqidno:3所示的氨基酸序列中的氨基酸位置；并且其中该在一个或多个位置处的取代提供具有作为改进因子eif测量的至少1.9的表达水平的增加的蛋白酶变体，并且进一步地其中这些变体与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落27.如段落1-26中任一项所述的变体，其与seqidno:3的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。段落28.如段落1-26中任一项所述的变体，其中取代的数目是1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个取代。段落29.一种多核苷酸，其编码如段落1-28中任一项所述的变体。段落30.一种核酸构建体，其包含如段落29所述的多核苷酸。段落31.一种表达载体，其包含如段落29所述的多核苷酸。段落32.一种重组宿主细胞，其包含如段落29所述的多核苷酸。段落33.一种产生蛋白酶变体的方法，该方法包括：在适合于表达该变体的条件下培养如段落32所述的宿主细胞；以及任选地回收该变体。段落34.一种组合物，该组合物包含如段落1-28中任一项所述的变体。段落35.如段落34所述的组合物，其进一步包含葡糖淀粉酶和任选的真菌α-淀粉酶。段落36.一种用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，该方法包括使用葡糖淀粉酶和发酵生物，在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度处，在如段落1-28中任一项所述的变体蛋白酶的存在下将含淀粉材料同时糖化和发酵。段落37.一种用于从含淀粉材料产生发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：(a)在α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；(b)使用葡糖淀粉酶使在步骤(a)中获得的液化材料糖化；(c)使用发酵生物进行发酵；其中如段落1-28中任一项所述的变体蛋白酶在步骤b)和/或c)期间存在。段落38.如段落36-37中任一项所述的方法，其中该发酵产物是乙醇并且该发酵生物是酿酒酵母。段落39.根据段落36-38中任一项所述的方法，其中α-淀粉酶是在糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的，具体地酸性真菌α-淀粉酶。段落40.根据段落39所述的方法，其中该α-淀粉酶是源自曲霉属，具体是土曲霉、黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、或白曲霉的菌株；或者毛霉属的菌株，优选是微小根毛霉的菌株；或者亚灰树花菌属，优选是大型亚灰树花菌的菌株。段落41.如段落40所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在的该α-淀粉酶是源自根毛霉属的菌株，优选微小根毛霉的菌株，如具有黑曲霉连接子和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，如示于seqidno:9中的杂合体。段落42.如段落41所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在的该α-淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含seqidno:9的多肽的α-淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与seqidno:9的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。段落43.如段落42所述的方法，其中该α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶连接子和淀粉结合域(sbd)的微小根毛霉，优选披露为seqidno:9，优选具有以下取代中的一个或多个：g128d、d143n，优选g128d+d143n。段落44.根据段落36-43中任一项所述的方法，其中葡糖淀粉酶源自曲霉属的菌株，优选黑曲霉或泡盛曲霉，篮状菌属的菌株，具体是埃默森篮状菌；或阿太菌属(athelia)菌株，具体是罗耳阿太菌(atheliarolfsii)；栓菌属的菌株，优选瓣环栓菌；粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株；密孔菌属的菌株，如血红密孔菌的菌株；或其混合物。段落45.如段落44所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含seqidno:4的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与seqidno:4的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。段落46.如段落44所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含seqidno:5的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与seqidno:5的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。段落47.如段落44所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含seqidno:6的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与seqidno:6的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。段落48.如段落44所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含seqidno:7的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与seqidno:7的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。段落49.如段落44所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下组成：(i)包含seqidno:8的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与seqidno:8的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。段落50.如段落36所述的方法，其中该含淀粉材料是颗粒状淀粉。段落51.如段落37-50中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料源自玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻或马铃薯。段落52.如段落32所述的宿主细胞，其表达如段落1-28中任一项所述的变体，其中该宿主细胞是酵母细胞，具体是酵母属，如酿酒酵母。段落53.如段落36-37中任一项所述的方法，其中如段落52所述的宿主细胞在发酵步骤中作为发酵生物应用并且该发酵产物是乙醇。本发明进一步通过以下实例进行描述。实例实例1：野生型大型亚灰树花菌蛋白酶iii在米曲霉中的克隆与表达wo2014/037438中描述了属于s53家族的大型亚灰树花菌野生型丝氨酸蛋白酶iii(mgp3)的克隆与表达。随后通过usertm克隆(新英格兰生物实验室公司(newenglandbiolabs)，伊普斯威奇(ipswich)，马萨诸塞州，美国)，将克隆的基因作为具有合适的突出端的聚合酶链反应(pcr)产物进行转移，以插入到wo2013/119302(实例18和图10)中披露的p_bgmh0016中，用于在米曲霉中表达。将质粒dna用作pcr反应中的模板。正向引物的序列是5’-agagcgauaccatggtcgccaccagc-3’(seqidno:11)，和反向引物的序列是5’-aacgtcacgutcacaggccgaccgcggt-3’(seqidno:12)。phusionudna聚合酶(赛默飞世尔科技公司(thermofischerscientific)，格兰德岛(grandisland)，纽约，美国)用于pcr反应。pcr反应由以下组成：10ng模板dna、0.5μm每种引物、1uphusionu聚合酶、0.25mmdntp、1xphusionhf缓冲液、水至50μl。pcr程序由以下组成：在98℃下初始变性30秒，35个扩增循环(在98℃下持续20秒；在60℃下持续20秒；在72℃下持续2分钟)，以及在72℃下最终延伸5分钟。纯化扩增的基因(qiaquick，凯杰公司(qiagen))并通过usertm克隆插入到p_bgmh0016。该反应包含：100ngp_bgmh0016载体作为pcr产物、500ng纯化的pcr产物、1μlusertm酶、1μlphusionhf缓冲液、水至10μl。该程序由在37℃下持续25分钟和在25℃下持续25分钟组成。将该混合物转化到50μl化学感受态大肠杆菌top10(dh10β)细胞中，通过对氨苄青霉素的抗性进行选择，并通过测序验证正确的克隆。将质粒转化到wo2013/119302中披露的米曲霉cols1300的原生质体中，通过在作为唯一氮源的硝酸盐上生长进行选择，并通过桑格测序(sangersequencing)验证正确的克隆。质粒bgmh0016的使用利用了所谓的双分裂标记物系统(dsms)或双分选择标记物系统(nielsen等人，2006，(efficientpcr-basedgenetargetingwitharecyclablemarkerforaspergillusnidulans[用针对构巢曲霉的可再循环标记物的有效的基于pcr的基因靶向]，fungalgeneticsandbiology[真菌遗传学和生物学]2006(43)54至64))。pbgmh0016中的双分裂标记物由米曲霉cols1300菌株中的两个分裂标记物组成：niadδ和niiaδ，其位于amds选择标记物的侧翼。只有在宿主细胞cols1300中通过双重同源重组分别在部分niad和niia基因中正确插入供体dna才能恢复两种基因的功能，并且这两种基因都是细胞在含有硝酸钠作为唯一氮源的培养基上生长所必需的。这也确保了靶向插入代替单拷贝中的amds基因。如上披露的，根据本发明的mgp3的每种特定变体可以被克隆和被表达。实例2：根据本发明的特定变体的稳定性测定相对于具有seqidno:3的氨基酸序列的mgp3，mgp3的取代变体的稳定性通过在缓冲液中在限定条件(“胁迫条件”)下孵育蛋白酶样品来确定。选择孵育的温度和持续时间，使得孵育后的野生型的剩余活性等于限定条件(“参照条件”)下孵育类似样品的活性的大约20％，该限定条件使相同持续时间的孵育时不会导致活性损失。使用下述suc-aapf-pna测定，来确定胁迫条件下或参照条件下孵育后的活性。a.使用suc-aapf-pna测定的蛋白酶活性确定为了确定mgp3蛋白酶及其变体的蛋白酶活性，测量n-琥珀酰-l-丙氨酰-l-丙氨酰-l-丙基-l-苯基-对硝基苯胺(suc-aapf-pna)的水解。使用的试剂溶液是：稀释缓冲液：100mm琥珀酸、1mmcacl2、150mmkcl、0.01％tritonx-100、ph4.5。测定缓冲液：具有1mmsuc-aapf-pna(n-琥珀酰-l-丙氨酰-l-丙氨酰-l-丙基-l-苯基-对硝基苯胺，巴亨(bachem)4002299.1000)的稀释缓冲液、12.5μlml-1dmso(amresco公司0231)。mgp3变体在96孔微量滴定板中生长以产生培养上清液。在每个板上，四个孔含有具有野生型mgp3的培养上清液(seqidno:3)。suc-aapf-pna测定在一次性聚苯乙烯平底384孔微板(perkin-elmer6007649)中进行。首先，将蛋白酶样品(培养上清液)在稀释缓冲液中稀释5倍。随后，将25μl稀释的蛋白酶样品添加到384孔微量测定板的每个孔中，随后添加25μl测定缓冲液。将溶液充分混合并在405nm下记录吸光度5分钟，并且从270秒的最大窗口速度计算出每孔的初始速率。b.稳定性测定mgp3变体在缓冲液中的稳定性通过确定蛋白酶变体的稳定性半衰期来确定，为按小时计的胁迫时间的负值除以不稳定条件(“胁迫条件”)下变体的蛋白酶活性与稳定条件(“参照条件”)下相同变体的蛋白酶活性的比率的以2为底数的对数。动力学斜率受到质量控制并且去除如下变体样品，这些变体样品1)显示在a)胁迫条件或b)非胁迫条件中低于野生型对照的r2拟合的25％四分位数的线性拟合的r2，或2)显示在a)胁迫条件或b)非胁迫条件中低于非表达对照的vmax的75％四分位数的vmax。来源于相同克隆的胁迫和非胁迫上清液的初始速率的比率定义为将显示高于野生型对照的90％分位数的比率的样品计数为命中，并且被挑取并再生长并测序。基于等式计算在60℃的半衰期，其中以分钟计提供半衰期。使用的试剂溶液是：稀释缓冲液：如a中描述的。测定缓冲液：如a中描述的。测定在一次性聚苯乙烯96孔pcr板(例如，赛默飞世尔科技公司ab-0601)中进行，除了在384孔微板中进行的a中所述的suc-aapf-pna测定。首先，将含有蛋白酶的25μl培养上清液转移到两个新鲜平板上：一个称为“胁迫板”，一个称为“参照板”。胁迫板装有盖子，并在热循环仪中在60℃下孵育5分钟。参照板装有盖子，并同时在21℃(环境温度)下孵育。孵育后，将胁迫板和参照板的培养上清液转移到384孔板中，并在胁迫板和参照板上的每个孔中添加25μl测定缓冲液，并将它们充分混合。半衰期改进因子(hif)半衰期改进因子(hif)与变体蛋白酶的稳定性半衰期和参考蛋白酶的稳定性半衰期相关。根据以下等式进行基于稳定性半衰期(sh)的改进因子的计算：hif＝(变体的sh)/(mgp3(seqidno:3)的sh)。半衰期改进因子大于1(hif>1)表明与参考相比，变体的改进的稳定性，而hif为1(hif＝1)鉴定与参考具有同等水平的变体，并且小于1(hif<1)的hif鉴定比参考更不稳定的变体。具有改进的稳定性的所有突变的hif显示在下表1中。如果观察到给定的取代不止一次，则显示所有观察的中值hif。表1.实例3：根据本发明的特定变体的比活性测定通过比较蛋白酶样品的总活性与样品中蛋白质的量来确定mgp3的取代变体相对于具有seqidno:3的氨基酸序列的mgp3的比活性。使用suc-aapf-pna测定确定培养上清液中的活性，并通过酶联免疫吸附测定(elisa)确定蛋白质浓度，两者均在下文描述。a.使用suc-aapf-pna测定的蛋白酶活性确定为了确定mgp3蛋白酶及其变体的蛋白酶活性，测量n-琥珀酰-l-丙氨酰-l-丙氨酰-l-丙基-l-苯基-对硝基苯胺(suc-aapf-pna)的水解。使用的试剂溶液是：稀释缓冲液：100mm琥珀酸、1mmcacl2、150mmkcl、0.01％tritonx-100、ph4.5。测定缓冲液：具有1mmsuc-aapf-pna(n-琥珀酰-l-丙氨酰-l-丙氨酰-l-丙基-l-苯基-对硝基苯胺，巴亨(bachem)4002299.1000)的稀释缓冲液、12.5μlml-1dmso(amresco公司0231)。mgp3变体在96孔微量滴定板中生长以产生培养上清液。在每个板上，四个孔含有具有野生型mgp3的培养上清液(seqidno:3)。suc-aapf-pna测定在一次性聚苯乙烯平底384孔微板(perkin-elmer6007649)中进行。首先，将蛋白酶样品(培养上清液)在稀释缓冲液中稀释5倍。随后，将25μl稀释的蛋白酶样品添加到384孔微量测定板的每个孔中，随后添加25μl测定缓冲液。将溶液充分混合并在405nm下记录吸光度5分钟，并且从270秒的最大窗口速度计算出每孔的初始速率。b.通过酶联免疫吸附测定(elisa)进行的蛋白质定量使用的试剂溶液是：tbs-t：20mmtris、150mmnacl、0,1％tween-20、ph7.5。pbs缓冲液：137mmnacl、2.7mmkcl、10mmna2hpo4、1.8mmkh2po4。tmbplus2(kementech诊断公司)已预制并准备使用。将蛋白酶样品(培养上清液)在tbs-t中稀释2000倍，并使用兔培养的hrp-缀合的mgp3-抗体通过elisa分析。elisa定量在用“蛋白a”纯化的兔多克隆抗mgp3抗体包被的封闭的384微量滴定板(nuncmaxisorp)中进行。将稀释的酶样品(以及标准品和对照)转移至抗体板，孵育，并且然后用pbs缓冲液反复剧烈洗涤。使用相同的多克隆抗体进行检测，但是以hrp标记的形式(ll-hrp缀合)进行。添加适当稀释的tbs-t中的抗mgp3:hrp缀合物，然后用pbs洗涤。在添加tmbplus2底物之后，信号读取为终点od-(620nm)。由使用源自位于外板上的含mgp3标准样品以及在筛选流程中添加到每个板的mgp3标准孔的非线性函数计算浓度。c.变体的蛋白酶比活性计算基于标准样品的初始速率和标准浓度计算每个板的线性拟合。去除了在拟合参数斜率和截距的2.5％-97.5％分位数范围之外的板。通过将其输入标准品(每个板)的反向线性拟合，从vmax衍生出浓度预测。比活性计算为对于命中选择，仅考虑显示<30μgml-1elisa浓度的样品。将显示高于野生型对照的95％分位数的比活性的样品计数为命中，并且测序。比活性改进因子(aif)比活性改进因子(aif)与变体蛋白酶的比活性和参考蛋白酶的比活性相关。根据以下等式进行基于比活性(sa)改进因子的计算：aif＝(变体的sa)/(mgp3(seqidno:3)的sa)。比活性改进因子大于1(aif>1)表明与参考相比，变体的改进的比活性，而aif为1(aif＝1)鉴定与参考具有同等水平的变体，并且小于1(aif<1)的aif鉴定比参考具有更低比活性的变体。具有改进的比活性的所有突变的aif显示在下表2中。如果观察到给定的取代不止一次，则显示所有观察的中值aif。表2.实例4：根据本发明的特定变体的表达水平的确定通过培养上清液中mgp3蛋白的总量来确定mgp3的取代变体相对于具有seqidno:3的氨基酸序列的mgp3的表达水平。使用一种系统，其中将变体的一个拷贝精确地整合到定义的基因座中，并且所述基因座对于所有变体是相同的，允许直接比较特定变体之间的表达水平。这样的系统可以是实例1中描述的dsms系统。通过酶联免疫吸附测定(elisa)确定蛋白质浓度，如下所述。a.通过酶联免疫吸附测定(elisa)进行的蛋白质定量使用的试剂溶液是：tbs-t：20mmtris、150mmnacl、0,1％tween-20、ph7.5。pbs缓冲液：137mmnacl、2.7mmkcl、10mmna2hpo4、1.8mmkh2po4。tmbplus2(kementech诊断公司)已预制并准备使用。将蛋白酶样品(培养上清液)在tbs-t中稀释2000倍，并使用兔培养的hrp-缀合的mgp3-抗体通过elisa分析。elisa定量在用“蛋白a”纯化的兔多克隆抗mgp3抗体包被的封闭的384微量滴定板(nuncmaxisorp)中进行。将稀释的酶样品(以及标准品和对照)转移至抗体板，孵育，并且然后用pbs缓冲液反复剧烈洗涤。使用相同的多克隆抗体进行检测，但是以hrp标记的形式(ll-hrp缀合)进行。添加适当稀释的tbs-t中的抗mgp3:hrp缀合物，然后用pbs洗涤。在添加tmbplus2底物之后，信号读取为终点od-(620nm)。由使用源自位于外板上的含mgp3标准样品以及在筛选流程中添加到每个板的mgp3标准孔的非线性函数计算浓度。表达水平改进因子(eif)表达水平改进因子(eif)与变体蛋白酶的表达水平和参考蛋白酶的表达水平相关。根据以下等式进行基于表达水平(el)的改进因子eif的计算：if＝(变体的el)/(mgp3(seqidno:3)的el)。表达水平改进因子大于1(eif>1)表明与参考相比，变体的改进的表达水平，而eif为1(eif＝1)鉴定与参考具有同等水平的变体，并且小于1(eif<1)的eif鉴定比参考具有更低表达水平的变体。具有改进的表达水平的所有突变的eif显示在下表3中。如果观察到给定的取代不止一次，则显示所有观察的中值eif。表3.实例5：如通过热应力后特定取代组合的残余活性确定的具有增加的热稳定性的变体基于根据本发明的单一取代变体获得的数据，若干种变体具有多个取代并且在选自56℃至70℃范围的温度下孵育20分钟后显示出残余活性的增加。构建了与表4中所示的野生型mgp3(seqidno:3)相比具有取代的变体，并且所述变体在米曲霉中表达。含有和表达mgp3组合变体的mgp3米曲霉菌株在mdu-2(225μl/mtp孔)中的微量滴定板(mtp)中，在不搅拌的情况下，在96孔带盖的mtp中在30℃下生长5天用以表达。表达板还含有在米曲霉中表达的野生型对照mgp3。通过将板向下压入孔中去除丝状材料。将上清液在测定缓冲液(100mm琥珀酸、1mmcacl2、150mmkcl、0.01％tritonx-100、ph4.5)中稀释。将一部分稀释的上清液转移到热循环仪96孔板中。将96孔板转移至热循环仪(biometra)中并在表4中注释的温度(56℃、60℃或70℃)下加热20min，然后冷却至25℃持续2min。将胁迫和非胁迫上清液的体积(25μl)转移至透明的384孔mtp板。将测定溶液(25μl、测定缓冲液、具有1mm琥珀酰-aapf-pna、12.5μlml-1dmso)分配至384孔mtp。在405nm下记录吸光度10分钟，并且从9min的最大窗口速度计算出每孔的初始速率。来源于相同克隆的胁迫和非胁迫上清液的初始速率的比率定义为该比率转化为残余活性(％)，该残余活性显示在表4中。表4.具有多个取代的变体。本申请中描述并且要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在说明本发明的若干方面。任何等效方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，对于本领域的技术人员而言本发明的各种修改将从前述的说明书变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。序列表<110>诺维信公司<120>丝氨酸蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸<130>14191-wo-pct<160>12<170>patentin版本3.5<210>1<211>1695<212>dna<213>大型亚灰树花菌<400>1atggtcgccaccagcttgctcgttgcctccctattcacgctcgccctcggcacgccgacg60ggtcgcaacctcaagctgcacgaggcgcgcgaagaccttcctgccggtttctcgctgcgc120ggcgccgcctcgcccgacacgacgctgaagctccgcatcgcgctcgtgcagaacaacttc180gccgagctcgaagacaagctctacgacgtcagcacaccgtccagcgccaactacggcaac240cacctctcgaaggaagaggttgagcagtacattgctccggctcccgagagcgtgaaagcc300gtgaatgcctggctcaccgagaacggactcgacgcgcacaccatttcgcccgccggcgac360tggctcgcattcgaggtccccgtcagcaaggcgaatgagctcttcgacgccgacttctcc420gtgtttacccacgatgagtccggcctcgaggctatccggacgctggcctactccatccct480gctgagcttcagggacacctcgaccttgttcaccccaccgtcacgttcccgaaccccaat540gcgcacctgcccgtcgtgcgctccacccagcccatccggaacctgaccggacgtgctata600ccggcctcttgcgcgagcaccatcacccctgcgtgcttgcaggccatctacggtatcccc660accaccaaggctactcagtcctcgaacaagctcgctgtcagcggcttcatcgaccagttt720gcgaacaaggctg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