专利名称：新型人补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物,其编码序列及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的编码人补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物分子(C1r-like serine protease analog，简称为CLSPa蛋白)的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本发明的多肽是一种新的补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物分子。
背景技术：
补体(Complement)作为天然免疫(Innate immunity)中的一类重要和保守的体系，为机体提供了快速和高效地清除入侵微生物的途径。补体系统除了补体的直接杀伤机制外，在补体活化过程中释放的多种小片断分子具有广泛的生物学效应，包括趋化中性粒细胞和淋巴细胞、调理吞噬、参与调节细胞和体液免疫应答等。这些功能得以实现的基础就是补体系统中各成分具有丝氨酸蛋白酶活性，能活化下游底物，激发了补体级联反应。C1是补体系统经典激活途径中的起始部分，由C1q、C1r和C1s三个亚单位组成，C1q为具有识别作用的亚单位，而C1r和C1s为具有催化作用的亚单位。C1r为单肽链，由约700个氨基酸残基组成，分子量约为83kDa，在C端有约250个氨基酸残基的丝氨酸蛋白酶结构域，且与非补体性丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶和糜蛋白酶)高度同源；在N端有约450个氨基酸，含有两个CUB和一个EGF结构域，是一种丝氨酸蛋白酶原。C1r广泛存在于血浆及体液中，在溶液中，C1r为双体，编码C1r的基因定位于人的12号染色体短臂12p13。C1rN端的CUB-EGF结构域在Ca2+的存在下对C1s-C1r-C1r-C1s四聚体构成起了主要作用，进而组成稳定的C1复合体。而其C端的CCP1、CCP2、SP结构域是其具有催化作用的活性部分，能够裂解C1s，使其活化，进一步活化C3转化酶，从而激活整个经典途径。在一般情况下，C1r与C1INH(C1 inhibitor)结合着，而一旦有IC结合到C1q上时，C1INH的抑制作用即行移除，C1r的构象发生改变，具有酶活性。
丝氨酸蛋白酶是机体最重要的酶分子之一，约占机体蛋白酶的三分之一，其生理特征就是具备了His-Asp-Ser催化环，近年来还发现了其它催化环如Ser-His-Glu、Ser-Lys/His、His-Ser-His、和N-terminal Ser。较熟知的丝氨酸蛋白酶包括C1r/C1s、甘露糖结合丝氨酸蛋白酶、ovochymase、spermadhesin和II型跨膜丝氨酸蛋白酶等，它们参与了补体活化、排卵、授精、组织重建、细胞迁移、肿瘤浸润和转移、消化、胚胎发育、器官形成等多项生理功能。已知道机体的各项生命活动都在精密的网络调控下进行着，其机制有反馈调节、中和抑制、竞争抑制等，丝氨酸蛋白酶作用体系亦维持着这种动态平衡。丝氨酸蛋白酶和它们的抑制剂普遍存在于自然界动、植物及微生物中，并且在许多重要的生理体系中起了关键性的调控作用，如凝血、纤溶、补体联级反应及多肽或蛋白质激素的释放等。目前，大约有20多个丝氨酸蛋白酶抑制剂家族已被证实，其基本结构特征有α-螺旋、β-折叠、α-螺旋/β-折叠及多二硫键折叠。这些抑制剂在结构上与丝氨酸蛋白酶的作用底物非常相近，能够结合酶的活性位点，起到封闭或降解破坏的作用。
由于补体途径与众多生理过程有关，因此，本领域迫切需要开发与补体途径有关的各种物质。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的人补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物分子CLSPa蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的CLSPa多肽，它包括具有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制蛋白酶活性的功能的由(a)衍生的多肽；(c)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有补体介导杀伤效应的功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码上述人CLSPa多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中18-1478位的序列(ORF序列)；(b)具有SEQ ID NO1中1-3345位的序列(全长序列)；或(c)具有SEQ ID NO1中126-1478位的序列(成熟多肽的编码序列)。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有人CLSPa蛋白活性的多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达人CLSPa蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人CLSPa蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的人CLSPa多肽特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人CLSPa多肽活性的化合物，以及抑制人CLSPa多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人CLSPa多肽的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在CLSPa蛋白的方法，它包括将样品与CLSPa蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CLSPa蛋白。
在本发明的第八方面，提供了一种检测与人CLSPa多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。
在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人CLSPa多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人CLSPa多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人CLSPa蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。一种优选的用途是将CLSPa多肽用作抑制蛋白酶活性的抑制剂。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人CLSPa多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。还提供了非药用的组合物，该组合物含有0.001-99.99wt％的CLSPa多肽和可接受的载体(如溶剂)。这些组合物可用于抑制蛋白酶的活性(更佳地抑制丝氨酸蛋白酶的活性)，或用于抑制补体介导杀伤效应。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1是本发明的人CLSPa的cDNA序列，其中非编码序列用小写字母表示，编码序列用大写常规字母表示。
图2是本发明的人CLSPa的全长氨基酸序列。
图3是人CLSPa的RT-PCR表达分析。图A为人CLSPa的在人肿瘤细胞系中的表达；图B为人CLSPa的正常人组织分布。
图4是人CLSPa的真核表达载体在真核细胞中表达的Western分析。
图5是本发明的人CLSPa的对补体介导溶血的抑制作用检测。*P＜0.01图6是本发明的人CLSPa蛋白的蛋白酶活性检测。
图7是本发明的人CLSPa蛋白的对蛋白酶活性抑制作用检测。其中图7A现实了纯化的CLSPa蛋白对胰蛋白酶的蛋白酶活性的抑制作用；图7B显示了CLSPa蛋白对内源性蛋白酶活性的抑制作用。*P＜0.05与对照载体组相比；**P＜0.01与胰蛋白酶相比。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，首次分离到一个新的补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物分子CLSPa。CLSPa与已知的丝氨酸蛋白酶——补体C1r/C1s有较高的同源性，并且具有抑制补体介导溶血效应和其他丝氨酸蛋白酶活性的作用。因此这表明CLSPa分子是一种新型、天然的丝氨酸蛋白酶类似物，可竞争性抑制丝氨酸蛋白酶的活性，从而补体介导的炎症反应起调控作用，因而可能在抗肿瘤、抗移植排斥、抗炎症反应等多个领域的免疫诊断和免疫治疗方面具有重要的开发和应用价值。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“CLSPa蛋白”、“CLSPa多肽”、“CLSPa蛋白多肽”或“补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物分子CLSPa”可互换使用，都指含有人补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物分子CLSPa氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物分子CLSPa。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的CLSPa蛋白或多肽”是指CLSPa多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CLSPa蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。CLSPa多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人CLSPa蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人CLSPa蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“人CLSPa多肽”指具有人CLSPa蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。该术语还包括具有与人CLSPa蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人CLSPa蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人CLSPa DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人CLSPa多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人CLSPa多肽或其片段的融合蛋白(如与GST等形成的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人CLSPa多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人CLSPa多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人CLSPa蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人CLSPa多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人CLSPa蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码CLSPa蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的人CLSPa核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或CLSPa蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的CLSPa多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码人CLSPa多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，人CLSPa多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人CLSPa编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人CLSPa蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗CLSPa蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗CLSPa蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人CLSPa蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人CLSPa蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本发明还包括对人CLSPa DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CLSPa基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CLSPa基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人CLSPa蛋白的分子，也包括那些并不影响人CLSPa蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人CLSPa基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人CLSPa基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人CLSPa蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人CLSPa蛋白功能的抗体以及不影响人CLSPa蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人CLSPa基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人CLSPa基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人CLSPa蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人CLSPa蛋白。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人CLSPa蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人CLSPa蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人CLSPa蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人CLSPa蛋白阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用人CLSPa蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CLSPa蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于抗肿瘤(如恶性血液肿瘤)、抗移植排斥、抗炎症反应(如肌肉失调疾病)方面的治疗。在使用本发明CLSPa蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如TNFα等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明CLSPa多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的CLSPa蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
人CLSPa蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于CLSPa蛋白的无表达或异常/无活性的CLSPa蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的CLSPa蛋白，以抑制内源性的CLSPa蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将CLSPa基因转移至细胞内。构建携带CLSPa基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人CLSPa基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。
抑制人CLSPa mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
能与人CLSPa蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人CLSPa蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测人CLSPa蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人CLSPa蛋白水平，可以用作解释人CLSPa蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断CLSPa蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在CLSPa蛋白的方法是利用CLSPa蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与CLSPa蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CLSPa蛋白。
CLSPa蛋白的多聚核苷酸可用于CLSPa蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，CLSPa蛋白的多聚核苷酸可用于检测CLSPa蛋白的表达与否或在疾病状态下CLSPa蛋白的异常表达。如CLSPa DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断CLSPa蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用CLSPa蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CLSPa蛋白的转录产物。
检测CLSPa基因的突变也可用于诊断CLSPa蛋白相关的疾病。CLSPa蛋白突变的形式包括与正常野生型CLSPa DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明CLSPa蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
本发明还提供了非药用的组合物，该组合物含有0.001-99.99wt％(更佳地0.01-99.9wt％)的CLSPa多肽和可接受的载体(如溶剂)。这些组合物可用于抑制蛋白酶的活性(更佳地抑制丝氨酸蛋白酶的活性)，或用于抑制补体介导杀伤效应。
在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从人树突状细胞cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全长为3345个碱基，其开放读框位于18-1478位，编码全长为487个氨基酸的人CLSPa蛋白(SEQ ID NO2)。该CLSPa蛋白可抑制蛋白酶活性，并可抑制补体介导杀伤效应，因此可为治疗抗肿瘤、抗移植排斥、抗炎症反应等疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人CLSPa cDNA的克隆用Trizol试剂(Life Technologies)提取人树突状细胞总RNA。然后，从总RNA中分离poly(A)mRNA。将poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA后，用SuperScriptII克隆试剂盒(Life Technologies)将cDNA片段定向插入到载体的多克隆位点上，转化DH5a细菌形成cDNA质粒文库。用双脱氧法测定随机挑选克隆的5’末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较，结果发现有一个cDNA克隆的DNA序列为新的全长cDNA。通过合成一系列引物对新克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，克隆所含的全长cDNA是一个新的cDNA序列(如SEQ ID NO1和图1所示)，编码一个新的蛋白质(如SEQ ID NO2和图2所示)。此蛋白质被命名为人补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物分子(CLSPa)，其编码基因命名为人补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物分子基因。
序列SEQ ID NO1全长为3345bp，包括17bp的5′端非编码区和1864bp的3′端非编码区，编码含487个氨基酸的多肽。理论上计算未糖基化的成熟分子的分子量约为53.484道尔顿，计算等电点为6.75。结构分析显示CLSPa蛋白的1-36位包含一个分泌信号肽，39-164位包含一个CUB结构域(C1r/C1s，an embryonicsea urchin proteinUegf，andBone morphogenetic protein I domain)，在244-483位包含一个丝氨酸蛋白酶结构域(serine protease domain)，这表明CLSPa属于丝氨酸蛋白酶样分子。
BLAST分析表明其与已知基因不同，与人补体组分C1r有一定同源，相似性为40％，一致性为52％。二者相应的CUB结构域和丝氨酸蛋白酶结构域的相似性分别为为48％和58％。
实施例2 用RT-PCR方法进行人CLSPa的细胞表达分析用Trizol试剂提取处于对数生长期相应细胞系、人外周血单核细胞及经LPS刺激不同时间的人外周血单核细胞来源的树突状细胞总RNA，取5μg细胞总RNA与1μg Oligo-dT12-18混合，进行反转录。反转录体系为20μl，反应结束后加80μlddH2O进行稀释。PCR扩增CLSPa引物如下有义引物5’-ATGCCTGGACCCAGAGTGTGGG-3’(SEQ ID NO3)，反义引物5’-TCAATTCTTGCCATTCATCACTCCCTTGATCC-3’(SEQ ID NO4)，同时以β-actin作为阳性对照。PCR反应体积为50μl，其中含反转录模板10ul、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(Takara)，扩增参数为95℃15秒、57℃30秒、72℃90秒，32个循环后PCR产物行1.5％琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列分析结果表明该PCR产物的编码DNA序列与SEQ ID NO1所示的18-1481完全相同。
RT-PCR结果显示(图3)，在检测的所有实体肿瘤细胞和血液肿瘤细胞系中，CLSPa mRNA表达在人前列腺癌PC-3和卵巢癌SK-OV-3细胞中，其它细胞系均未见表达。在正常人组织中，人CLSPa mRNA广泛表达于成人正常组织中，在胎盘、肝脏、肾脏、胰腺中表达量较高，在肺、脾、前列腺、卵巢、结肠、外周血组织有中度表达，而在心脏、骨骼肌、胸腺、睾丸、小肠中表达较低，但在脑中未见表达。
实施例3人CLSPa重组表达在该实施例中，常规抽提的树突状细胞mRNA，并反转录成cDNA作为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人CLSPa DNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为5’-CAGGATCCATGCCTGGACCCAGAGTG-3’(SEQ ID NO5)该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是翻译起始子和人CLSPa的部分编码序列；3’端引物序列为5’-GTGAATTCTCAATTCTTGCCATTCATCACT-3’(SEQ ID NO6)该引物含有EcoR I限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人CLSPa的部分编码序列。
将获得的PCR产物纯化后经BamHI-EcoR I酶切再与质粒pGEM-3ZF按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌BL21，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。将正确序列的人CLSPa cDNABamHI-EcoR I酶切片段克隆至表达载体pGEX-2T(Pharmacia)，形成载体pGEX-2T-CLSPa，然后转化大肠杆菌BL21。阳性克隆用BamHI-EcoRI酶切鉴定，产物行0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。经测序证实，已插入了所设计的CLSPa编码序列。
挑表达CLSPa的阳性BL21克隆接种于100ml 2×YTA培养基中，37℃300rpm振荡培养12-15hr，1∶10稀释于预热的2×YTA培养基继续振荡培养1.5hr，加100mMIPTG至0.1mM后30oC诱导2-6hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM.2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，过1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱，1×PBS充分洗涤后，加入500ul谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到人CLSPa-GST融合蛋白。
电泳检测表明，融合蛋白的分子量与预测值相符。
实施例4抗人CLSPa抗体的产生将实施例3中获得的重组人CLSPa融合蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人CLSPa基因翻译产物的能力加以评估。
结果发现，抗体可特异性地与实施例3制备的重组人CLSPa融合蛋白发生结合。
实施例5人CLSPa真核表达载体的构建及基因转染在该实施例中，常规抽提的树突状细胞mRNA，并反转录成cDNA作为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人CLSPa全长编码区DNA作为插入片段。PCR反应参数为95℃15秒，57℃30秒，72℃90秒，25循环后72℃延伸10分钟，上游引物为5’-GGAATTCATGCCTGGACCCAGAGTGTGG-3’(5′端含EcoR I位点，以及人CLSPa编码区的起始码)(SEQ ID NO7)，下游引物为5’-CTAAGCTTCAATTCTTGCCATTCATCACTCC-3’(5′端含Hind III位点)(SEQ ID NO8)。
PCR产物纯化后直接与pGEM-T载体(Promega公司)按常规方法重组并转化至感受态细菌DH5 o。挑取白色克隆进行鉴定、纯化并测序(测序引物为T7和SP6)。将正确序列的EcoR I-Hind III酶切片段经纯化后克隆至表达载体pcDNA3.1/Myc-His(-)B(Invitrogen公司)。经酶切鉴定阳性克隆后，重组子记为pCLSPa。经测序证实，已插入了所设计的人CLSPa编码序列。
将人CLSPa真核表达载体质粒DNA和对照质粒pcDNA3.1/Myc-His(-)B以LipofectAMINE试剂(Invitrogen公司)共转染市售的293T人胚肾细胞，转染后48小时进行检测。
实施例6人CLSPa真核表达产物的Western检测转染后48小时，收集细胞(5×106细胞/样品)，用PBS洗一遍后，用T-PER组织蛋白提取试剂(Pierce公司)提取全蛋白，具体操作按试剂盒说明进行。之后用BCA法(Pierce公司)测定蛋白浓度，调节至一致后，样品每20μl与4μl 6倍上样缓冲液(100mmol/L Tris-HCL，200mmol/L DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，PH6.8)混匀，于100℃水浴煮沸5分钟后，行12％SDS-PAGE电泳，随后以100V恒定电压于4℃把聚丙烯酰胺中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，丽春红染色并标记方向，标出Marker所在位置。室温阻断4小时(10％脱脂奶粉的TBST溶液)，将鼠源抗His标签抗体按1∶1000稀释于脱脂奶粉溶液中，与硝酸纤维素薄膜于室温反应2小时后，用TBST(0.05％Tween20的TBS溶液)洗涤3次，每次10分钟。然后加以辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗(1∶2000稀释)，室温孵育60分钟，TBST洗三次，每次10分钟，将Western印迹荧光检测试剂(Cell Signaling公司)中的A液和B液以等体积混和，室温孵育1分钟后，甩干，压膜，曝光，显影。
结果显示，在人CLSPa真核表达载体转染的293T人胚肾细胞中能够检测到带His标签的人CLSPa重组蛋白的表达，分子量约为70kD，为单一特异性条带，比CLSPa预期分子量稍大。由于CLSPa蛋白包含N糖基化位点，因此可能是对蛋白的糖基化修饰导致其表观分子量的增大。而在对照质粒pcDNA3.1/Myc-His(-)B转染的细胞中未检测到表达(图4)。
实施例7补体介导的溶血抑制试验收集转染了pCLSPa的293T细胞，用PBS洗一遍，重悬(4×105细胞/ml)于100μl GVB2+缓冲液(Sigma公司)，将之反复冻融，从而裂解细胞，15,000g 4℃离心10分钟，收集细胞裂解上清。在96孔板中，每300μl GVB2+缓冲液中含10％人补体血清(Sigma公司)，10％抗体致敏的羊红细胞(Sigma公司)和不同稀释度的含CLSPa裂解上清液，混匀，置37℃孵育30分钟。酶联仪采用415nm波长检测各样品OD值，裂解百分比通过以下公式计算裂解度(％)＝100×(实验组OD值-自发释放组OD值)/(最大释放组OD值-自发释放组OD值)。最大释放组和自发释放组分别用双蒸水和GVB2+缓冲液替代含CLSPa裂解上清液。
结果显示，两种浓度(1∶3和1∶10)的含CLSPa细胞裂解上清液能显著降低补体介导的细胞毒作用，而转染了对照质粒的细胞裂解上清液没有作用，提示CLSPa在补体活化系统中起了调节性抑制作用(图5)。
实施例8CLSPa的蛋白酶活性检测收集转染了pCLSPa的293T细胞，裂解后利用交联在固相化protein G(Pierce公司)的抗myc抗体(Invitrogen公司)纯化带有myc标签的CLSPa蛋白。之后用BCA法(Pierce公司)测定蛋白浓度，调节至一致。纯化的CLSPa蛋白400ng与pNA交联的蛋白酶底物混合液(Bz-Arg-pNA，MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA，Boc-Gly-Gly-Leu-pNA，Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA)(Calbiochem公司)在0.2ml的0.025M MES，125mM NaCl，2mM EGTA(pH7.2)溶液中37℃共孵育2小时，同时以胰蛋白酶(trypsin)(0.25％)作为阳性对照。在405nm波长下检测生色产物的量，以反映蛋白酶的活性。
结果显示，与阳性对照相比，纯化的CLSPa蛋白不具有明显的蛋白酶活性(图6)。
实施例9CLSPa对蛋白酶活性的抑制作用检测利用实施例8的蛋白酶活性检测体系检测CLSPa对胰蛋白酶的蛋白酶活性的抑制作用。方法如下将纯化的CLSPa蛋白、胰蛋白酶trypsin与蛋白酶底物混合液在0.2ml的0.025M MES，125mM NaCl，2mM EGTA(pH7.2)溶液中37℃共孵育2小时，然后在405nm波长下进行检测。
同时，利用实施例8的蛋白酶活性检测体系检测CLSPa对内源性蛋白酶活性的抑制作用。将等量的pCLSPa或对照载体转染293T细胞裂解上清按照不同的酶底物比例与蛋白酶底物混合液37℃共孵育2小时，结果在405nm波长下进行检测。
结果显示，纯化的CLSPa蛋白能够抑制胰蛋白酶trypsin的蛋白酶活性(图7A)。同时，两种比例(1∶3和1∶10)的含CLSPa细胞裂解上清液能显著降低内源性蛋白酶活性，而转染了对照质粒的细胞裂解上清液没有作用(图7B)。这表明，CLSPa不仅可抑制丝氨酸蛋白酶的酶活性，而且可以抑制其他蛋白酶的酶活性，并且在补体活化系统中起了调节性抑制作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国人民解放军第二军医大学<120>新型人补体C1r样丝氨酸蛋白酶类似物，其编码序列及用途<130>044558<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3345<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1cagatgtcca gttccagatg cctggaccca gagtgtgggg gaaatatctc tggagaagcc 60ctcactccaa aggctgtcca ggcgcaatgt ggtggctgct tctctgggga gtcctccagg 120cttgcccaac ccggggctcc gtcctcttgg cccaagagct accccagcag ctgacatccc 180ccgggtaccc agagccgtat ggcaaaggcc aagagagcag cacggacatc aaggctccag 240agggctttgc tgtgaggctc gtcttccagg acttcgacct ggagccgtcc caggactgtg 300caggggactc tgtcacaatc tcattcgtcg gttcggatcc aagccagttc tgtggtcagc 360aaggctcccc tctgggcagg ccccctggtc agagggagtt tgtatcctca gggaggagtt 420tgcggctgac cttccgcaca cagccttcct cggagaacaa gactgcccac cttcacaagg 480gctttctggc cctctaccaa accgtggctg tgaactatag tcagcccatc agcgaggcca 540gcaggggctc tgaggccatc aacgcacctg gagacaaccc tgccaaggtc cagaaccact 600gccaggagcc ctattatcag gccgcggcag caggggcact cacctgtgca accccaggga 660cctggaaaga cagacaggat ggggaggagg ttcttcagtg tatgcctgtc tgcggacggc 720cagtcacccc cattgcccag aatcagacga ccctcggttc ttccagagcc aagctgggca 780acttcccctg gcaagccttc accagtatcc acggccgtgg gggcggggcc ctgctggggg 840acagatggat cctcactgct gcccacaccg tctaccccaa ggacagtgtt tctctcagga 900agaaccagag tgtgaatgtg ttcttgggcc acacagccat agatgagatg ctgaaactgg 960ggaaccaccc tgtccaccgt gtcgttgtgc accccgacta ccgtcagaat gagtcccata 1020actttagcgg ggacatcgcc ctcctggagc tgcagcacag catccccctg ggccccaacg 1080tcctcccggt ctgtctgccc gataatgaga ccctctaccg cagcggcttg ttgggctacg 1140tcagtgggtt tggcatggag atgggctggc taactactga gctgaagtac tcgaggctgc 1200ctgtagctcc cagggaggcc tgcaacgcct ggctccaaaa gagacagaga cccgaggtgt 1260tttctgacaa tatgttctgt gttggggatg agacgcaaag gcacagtgtc tgccaggggg 1320acagtggcag cgtctatgtg gtatgggaca atcatgccca tcactgggtg gccacgggca 1380ttgtgtcctg gggcataggg tgtggcgaag ggtatgactt ctacaccaag gtgctcagct 1440atgtggactg gatcaaggga gtgatgaatg gcaagaattg accctggggg cttgaacagg 1500gactgaccag cacagtggag gccccaggca acagagggcc tggagtgagg actgaacact 1560ggggtagggg ttgggggtgg ggggttgggg gaggcaggga aatcctattc acatcactgt 1620tgcaccaagc cactgcaaga gaaaccccca cccggcaagc ccgccccatc ccagacagga 1680agcagagtcc cacagaccgc tcctcctcac cctctacctc cctgtgctca tgcactaggc 1740cccgggaagc ctgtacatct caacaacttt cgccttgaat gtccttagaa ccaccttccc 1800ctacttcatc tgttgacaca gcttttatac tcacctgtgg aagagtcagc tactcacccg 1860ctattagagt atggaggaag gggttttcat tgcattgcat ttctgaaaca ttcctaagac 1920
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Ser Glu Asn Lys Thr Ala His Leu His Lys Gly Phe Leu Ala Leu Tyr145 150 155 160Gln Thr Val Ala Val Asn Tyr Ser Gln Pro Ile Ser Glu Ala Ser Arg165 170 175Gly Ser Glu Ala Ile Asn Ala Pro Gly Asp Asn Pro Ala Lys Val Gln180 185 190Asn His Cys Gln Glu Pro Tyr Tyr Gln Ala Ala Ala Ala Gly Ala Leu195 200 205Thr Cys Ala Thr Pro Gly Thr Trp Lys Asp Arg Gln Asp Gly Glu Glu210 215 220Val Leu Gln Cys Met Pro Val Cys Gly Arg Pro Val Thr Pro Ile Ala225 230 235 240Gln Asn Gln Thr Thr Leu Gly Ser Ser Arg Ala Lys Leu Gly Asn Phe245 250 255Pro Trp Gln Ala Phe Thr Ser Ile His Gly Arg Gly Gly Gly Ala Leu260 265 270Leu Gly Asp Arg Trp Ile Leu Thr Ala Ala His Thr Val Tyr Pro Lys275 280 285Asp Ser Val Ser Leu Arg Lys Asn Gln Ser Val Asn Val Phe Leu Gly290 295 300His Thr Ala Ile Asp Glu Met Leu Lys Leu Gly Asn His Pro Val His305 310 315 320Arg Val Val Val His Pro Asp Tyr Arg Gln Asn Glu Ser His Asn Phe325 330 335Ser Gly Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Gln His Ser Ile Pro Leu Gly340 345 350Pro Asn Val Leu Pro Val Cys Leu Pro Asp Asn Glu Thr Leu Tyr Arg355 360 365Ser Gly Leu Leu Gly Tyr Val Ser Gly Phe Gly Met Glu Met Gly Trp370 375 380Leu Thr Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Arg Leu Pro Val Ala Pro Arg Glu385 390 395 400Ala Cys Asn Ala Trp Leu Gln Lys Arg Gln Arg Pro Glu Val Phe Ser405 410 415Asp Asn Met Phe Cys Val Gly Asp Glu Thr Gln Arg His Ser Val Cys420 425 430Gln Gly Asp Ser Gly Ser Val Tyr Val Val Trp Asp Asn His Ala His435 440 445His Trp Val Ala Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Ile Gly Cys Gly Glu450 455 460Gly Tyr Asp Phe Tyr Thr Lys Val Leu Ser Tyr Val Asp Trp Ile Lys465 470 475 480Gly Val Met Asn Gly Lys Asn485<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3atgcctggac ccagagtgtg gg 22<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>8ctaagcttca attcttgcca ttcatcactc c3权利要求
1.一种分离的CLSPa多肽，其特征在于，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制蛋白酶活性的功能的由(a)衍生的多肽；(c)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有补体介导杀伤效应的功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它选自下组(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中18-1478位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-3345位的序列；(c)具有SEQ ID NO1中126-1478位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出人CLSPa蛋白多肽。
9.一种能与权利要求1所述的CLSPa多肽特异性结合的抗体。
10.权利要求1所述CLSPa多肽的用途，其特征在于，它被用作抑制蛋白酶活性的抑制剂，或用于制备抑制补体介导杀伤效应的药物。
全文摘要
本发明提供了一种新的补体Clr样丝氨酸蛋白酶类似物分子(Clr－like serine protease analog，CLSPa蛋白)，编码CLSPa蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种CLSPa蛋白的方法。本发明还公开了编码这种CLSPa蛋白的多核苷酸的用途。CLSPa蛋白具有抑制蛋白酶活性的功能。
文档编号A61K38/57GK1721528SQ20041002574
公开日2006年1月18日 申请日期2004年7月5日 优先权日2004年7月5日
发明者李楠, 曹雪涛, 刘书逊, 林乃松 申请人:中国人民解放军第二军医大学