用于鉴定和靶向异质群体中的个体细胞以选择性提取细胞内容物的系统的制作方法
用于鉴定和靶向异质细胞环境中的个体细胞用于裂解的装置，所述细胞裂解液经受进一步的下游分析。还提供了使用这些装置的方法以及包括这些装置的系统和试剂盒。这些装置、系统、方法和试剂盒可用于各种不同的应用，包括测试和诊断。
背景技术：
在过去十年中，已经清楚的是，被认为是相同的细胞群体实际上本质上可以是非常异质的。其两个实例是(a)构成肿瘤的癌细胞群体，和(b)干细胞及其后代。对使用方法以鉴定和研究复杂混合物中的个体细胞或细胞的小亚群非常感兴趣。此外，随着对罕见细胞群体(例如，血液中的癌细胞或免疫细胞，母体样品中的胎儿细胞等)的存在的发现，对开发方法来分离和表征个体细胞非常感兴趣。
先前已经研究了依赖于流式细胞术或基于微通道的分选的单细胞基因组分析[3-10]并且polaristm系统出于此目的在商业上发布。将基于流式细胞术或基于微通道的分选用于单细胞基因组分析对于各种应用是非常有用的，然而，这些技术的使用限于分析细胞在液体培养基中的悬浮液。此外，使用这些技术的装置在可以同时评估的细胞数量方面受到限制。
微流体技术与用于处理或操纵极小体积流体的小型化流体处理技术有关。这些技术包括数字微流体(dmf)(有时也称为“电润湿”或“电介质上的电润湿”)，其依赖于在开放阵列(没有通道)上以小滴操纵的流体，以及集成的流体电路(itc)，其依赖于通过封闭的微米尺寸通道泵送的流体。先前已经报道了激光微束细胞裂解与itc(在封闭的微米尺寸通道中)的整合。quinto-su描述了使用这种方法的许多挑战，包括等离子体诱导的气泡阻塞，变形或损坏微通道的趋势，使得该方法对于常规使用是不实际的[17]。lai报道，通过将激光微束聚焦到较小的点，可以纠正其中一些问题[16]。然而，下游分析可能因为微通道中的细胞裂解液稀释而受到限制。
技术实现要素：
本文公开了一种用于鉴定和靶向细胞群体内的个体细胞以选择性提取细胞内容物的系统，其包括：
数字微流体装置，其具有至少一个用于接收细胞的位置；
包括用于接收所述数字微流体装置的平台的成像系统，所述成像系统包括用于鉴定所述至少一个位置处的细胞中的至少一个靶细胞的成像模块和用于激光裂解所述至少一个靶细胞从而释放细胞内容物以产生裂解液的脉冲激光源；以及
用于控制脉冲激光源、成像系统和数字微流体装置的控制系统，所述控制系统被编程有用于协调以下步骤的指令：
将小滴在所述数字微流体装置上移动，
选择位于所述至少一个位置处的至少一个待裂解的靶细胞，
通过脉冲激光源照射所述至少一个选定的靶细胞以裂解所述至少一个选定的靶细胞以产生裂解液，以及
收集裂解液。
至少一个位置可以是亲水的、部分亲水的或在蛋白质从样品中结垢/吸附后变成亲水的。
数字微流体装置可包括顶板和底板，其间限定一空间，并且其中至少一个位置中的每一个具有外周边，所述至少一个位置中的每一个限定在至少一个板的表面上，用于形成相应的虚拟微孔，每个相应的虚拟微孔具有从所述位置的外周边在顶板和底板之间延伸的虚拟壁，并且在通过脉冲激光源照射至少一个选定的靶细胞时，在虚拟微孔中形成等离子体气泡，并且在形成等离子体气泡时，虚拟壁变形，从而吸收由膨胀的等离子体气泡释放的能量。
至少一个位置可以是多个位置，并且其中控制系统被编程有用于协调以下的指令
将小滴移动到多个位置，
选择位于所述多个位置中的每一个处的至少一个待裂解的细胞，
选择第一位置以用脉冲激光源照射所述位置处的至少一个选定的细胞，
移动平台以将数字微流体装置顺序地从第一位置移动到另一位置以使每个位置进入脉冲激光源的视场内，以裂解所述至少一个选定的细胞从而在每个位置处产生裂解液，以及
收集每个位置处的裂解液。
在这方面，控制系统可以被编程用于计算平台行进的最短距离，以使多个位置中的每一个顺序地进入脉冲激光的视场内。
至少一个选定的靶细胞可以是多个选定的靶细胞，其中控制系统被编程用于
鉴定待裂解的所选定靶细胞的顺序以最小化执行协调步骤的时间，以及
其中多个所选定的靶细胞在一个视场内，或多个视场内，或在多个位置内。
在这方面，选定的靶细胞的顺序基于多个选定的靶细胞之间的最短路径。
成像系统可包括用于移位平台的平移机构，所述平移机构由控制系统控制。
控制系统可包括用于控制流体小滴从流体贮存器向至少一个位置移位的小滴控制机构或系统。
脉冲激光源可以是纳秒脉冲激光器。
脉冲激光源可以是纳秒脉冲激光器，其输送至少1μj的脉冲。
脉冲激光源可以是q开关激光器。
纳秒脉冲激光器可以是基于nd的激光器。
可以选择纳秒脉冲激光器以产生可见光谱内的脉冲激光束。
本公开还提供了一种用于鉴定和靶向细胞群体内的个体细胞以选择性提取细胞内容物的方法，其包括：
将包含细胞的样品加载到数字微流体装置的至少一个位置上，从而在所述至少一个位置的每一个处形成虚拟微孔；
在所述至少一个位置上固定化所述细胞；
选择至少一个固定化的细胞；
使用脉冲激光源裂解至少一个选定的细胞以在其相应的虚拟微孔内产生裂解液；
将一个液体小滴移位到相应的虚拟微孔中以收集裂解液；以及
将含有裂解液的小滴从相应的虚拟微孔移动到指定的位置。
至少一个位置是亲水的、部分亲水的或在蛋白质从样品中结垢/吸附后变成亲水的。
所述方法可以进一步包括生成固定化的细胞的位置图谱的步骤，并且其中选择至少一个固定化的细胞的步骤包括从图谱中选择至少一个细胞。
所述方法可以进一步包括标记固定化的细胞的步骤。标记固定化的细胞的此步骤可以进一步包括固定细胞。
所述方法可以进一步包括以下步骤：
沿着水平轴和竖直轴移动数字微流体装置，用于定位数字微流体装置，以从固定化的细胞中裂解另一个至少一个选定的细胞；
使用脉冲激光源裂解所述另一个至少一个选定的细胞，以在其相应的虚拟微孔内产生另一个裂解液；
将另一个液体小滴移位到相应的虚拟微孔中以收集另一个裂解液；以及
将含有另一个裂解液的另一个小滴从相应的虚拟微孔移动到指定的位置。
所述方法还包括在初始位置引入含有细胞的样品并将所述样品移位到至少一个位置的步骤。
至少一个位置是多个位置，并且包括以下步骤
将小滴移动到所述多个位置，
在所述多个位置中的每一个处选择一个待裂解的细胞，
选择第一位置以照射该位置处的选定细胞，
移动平台以顺序地移动数字微流体装置以便使每个位置进入脉冲激光源的视场内，以裂解所选定的细胞从而在每个位置处产生裂解液，以及
收集每个位置处的裂解液。
在这方面中，所述方法可以包括计算平台行进的最短距离，以使多个位置中的每一个顺序地进入脉冲激光源的视场内。
至少一个选定的靶细胞可以是多个选定的靶细胞，并且所述方法可以进一步包括
鉴定待裂解的所选定靶细胞的顺序以最小化对所有选定的靶细胞执行裂解的时间，并且其中多个所选定的靶细胞在一个视场内，或多个视场内，或在多个位置内。
在所述方法中，脉冲激光源可以是纳秒脉冲激光器。
在所述方法中，脉冲激光源可以是纳秒脉冲激光器，其输送至少1μj的脉冲。
在所述方法中，纳秒脉冲激光器可以是基于nd的激光器。
可以选择纳秒脉冲激光器以产生可见光谱内的脉冲激光束。
脉冲激光源可以是q开关激光器。
所述方法可以进一步包括对指定位置处的裂解液进行芯片上分析的步骤，并且可以进一步包括从指定位置收集含有裂解液的小滴用于芯片外分析的步骤。
所述方法可以用于个体细胞是胎儿细胞的情况，并且可以被配置用于产前基因测试或筛选，或产前病症的检测或诊断。
本文还公开了用于检测和/或分离胎儿细胞和/或胎儿分析物的方法，所述方法包括：
将包含细胞的样品加载到数字微流体装置的至少一个位置上，从而在所述至少一个位置的每一个处形成虚拟微孔；
将细胞固定到所述至少一个位置上；
选择至少一个固定化的胎儿细胞；
使用脉冲激光源裂解至少一个选定的细胞以在其相应的虚拟微孔内产生裂解液；
将一个液体小滴移位到相应的虚拟微孔中以收集裂解液；以及
将含有裂解液的小滴从相应的虚拟微孔移动到指定的位置，并任选地检测和/或分离裂解液中的胎儿分析物。
附图说明
现在将参考附图仅通过举例的方式描述实施方案，其中：
图1是根据本公开的实施方案的用于鉴定和靶向细胞群体内的个体细胞以选择性提取细胞内容物的系统的示意图；
图2显示了根据本公开的实施方案的a)用于细胞培养的组装的dmf装置的示意图，b)组装的dmf装置的放大部分，其显示了用于被动和主动分配的电极和亲水位置的阵列，以及c)组装的dmf装置的放大部分的侧视图；
图3a和3b是描绘根据本公开的实施方案的使用系统来鉴定和靶向细胞群体内的个体细胞以选择性提取细胞内容物的示意图。
图4a显示了描绘根据本公开的实施方案的细胞作图步骤的示意图；
图4b显示了描绘根据本公开的实施方案激光微束裂解所选细胞的示意图；
图5显示了根据本公开的实施方案的被动分配小滴以从虚拟微孔中去除细胞裂解裂解液的捕获图像。
图6显示了根据本公开的实施方案在a)激光微束裂解前和b)激光微束裂解后的滋养层细胞的明视场图像。
图7显示了根据本公开的实施方案在a)激光微束裂解前和b)激光微束裂解后的表达gfp的u87细胞的免疫荧光图像。
图8显示了单个激光裂解细胞的pcr分析。a)由单个表达gfp的u87细胞的裂解通过全基因组扩增和pcr检测gfp基因。b)由1、3或5个激光裂解细胞检测四条染色体的短串联重复。
图9显示了仅裂解特异性靶细胞。红色(b16-tdtomato)和绿色(u87-gfp)细胞混合在一起，5个绿色(gfp)细胞被裂解。然后使用pcr检测细胞裂解液中gfp或tdtomato基因的存在。在裂解液中仅检测到gfp基因，这表明绿色细胞周围的红细胞未被裂解。
图10显示了a)芯片上激光裂解细胞的电子图，其显示了dna的大小和b)根据本发明的实施方案的激光裂解细胞的qf-pcrc)根据本公开的实施方案的激光裂解细胞的下一代测序；
图11是显示了根据本公开的实施方案的用于自动控制细胞加载、染色、图谱生成和细胞裂解的不同模块的相互作用的高级结构的流程图；
图12是显示了根据本公开的实施方案的细胞加载，培养和处理的自动化所需步骤的流程图；
图13是显示了根据本公开的实施方案的细胞染色自动化所需步骤的流程图；
图14是显示了根据本公开的实施方案的细胞图谱生成自动化所需步骤的流程图；以及
图15是显示了根据本公开的实施方案的细胞裂解自动化所需步骤的流程图。
具体实施方式
将参考下面讨论的细节描述本公开的各种实施方案和方面。以下描述和附图是对本公开的说明，而不应被解释为限制本公开。这些图不是按比例的。描述了许多具体细节以提供对本公开的各种实施方案的透彻理解。然而，在某些情况下，没有描述众所周知的或传统的细节以便提供对本公开的实施方案的简明讨论。
如文中所使用的，术语“包括(comprises)”和“包括(comprising)”应被解释为包含性的和开放式的，而不是排他性的。具体地，当在说明书和权利要求书中使用时，术语“包括(comprises)”和“包括(comprising)”及其变体意味着包括指定的特征、步骤或部件。这些术语不应被解释为排除其他特征，步骤或部件的存在。
如本文所使用的，术语“示例性的”，“说明性的”和“例如”意味着“用作实施例，实例或说明”，并且不应被解释为比本文公开的其他配置更优选或更具优势。
如本文所用，术语“约”和“近似”旨在涵盖可能存在于数值范围的上限和下限中的变化，例如性质，参数和尺寸的变化。在一个非限制性实施例中，术语“约”和“近似”意味着加或减10％或更少。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
根据一个实施方案，本发明提供了一种用于鉴定和靶向细胞群体内的个体细胞以选择性提取细胞内容物的系统。根据另一个实施方案，本发明提供了一种用于鉴定和靶向异质细胞群体内的个体粘附细胞以选择性提取细胞内容物的系统。所述系统可包括dmf装置和具有裂解模块和成像模块的成像系统。
根据一个实施方案，本发明提供了一种使用包括dmf装置和具有裂解模块和成像模块的成像系统的系统，用于鉴定和靶向细胞群体内的个体细胞以选择性提取细胞内容物的方法。根据另一个实施方案，还提供了一种用于鉴定和靶向异质细胞群体内的个体粘附细胞以选择性提取细胞内容物的方法。所述方法可以使用包括dmf装置和具有裂解模块和成像模块的成像系统的系统。可以将粘附细胞样品引入dmf装置上，在其中可以使用微流体免疫细胞化学培养和询问他们。可以鉴定和选择所关注细胞，并通过激光微束裂解选择性地提取他们的内容物。可以将选定的细胞裂解液内容物收集到小滴中，其可以在芯片上或芯片外分析。
在一个实施方案中，提供了一种用于鉴定和靶向细胞群体内的个体细胞以选择性提取细胞内容物的系统。所述系统包括具有至少一个用于接收细胞的位置的数字微流体装置和包括用于接收数字微流体装置的平台的成像系统，所述成像系统包括用于鉴定在所述至少一个位置处的所述细胞中的至少一个靶细胞的成像模块，和用于激光裂解所述至少一个靶细胞从而释放细胞内容物以产生裂解液的脉冲激光源。所述系统包括用于控制脉冲激光源、成像系统和数字微流体装置的控制系统。控制系统被编程有用于协调以下步骤的指令
将小滴在数字微流体装置上移动，
选择位于至少一个位置处的至少一个待裂解的靶细胞，
通过脉冲激光源照射至少一个选定的靶细胞以裂解所述至少一个选定的靶细胞以产生裂解液，以及
收集裂解液。
在一些实施方案中，用于接收细胞的至少一个位置可以是亲水的、部分亲水的或在蛋白质从样品中结垢/吸附后变成亲水的。
在一个实施方案中，数字微流体装置可包括顶板和底板，限定顶板和底板之间的空间，并且其中至少一个位置中的每一个具有外周边，所述至少一个位置中的每一个限定在至少一个板的表面上，用于形成相应的虚拟微孔，每个相应的虚拟微孔具有从所述位置的外周边在顶板和底板之间延伸的虚拟壁。在通过脉冲激光源照射至少一个选定的靶细胞时，在虚拟微孔中形成等离子体气泡，并且在形成等离子体气泡时，虚拟壁变形，从而吸收由膨胀的等离子体气泡释放的能量。
在一个实施方案中，至少一个位置是多个位置，并且其中控制系统被编程有用于协调以下的指令
将小滴移动到所述多个位置，
选择位于所述多个位置中的每一个处的至少一个待裂解的细胞，
选择第一位置以用脉冲激光源照射所述位置处的至少一个选定的细胞，
移动平台以将数字微流体装置顺序地从第一位置移动到另一位置以使每个位置进入脉冲激光源的视场内，以裂解所述至少一个选定的细胞从而在每个位置处产生裂解液，以及
收集每个位置处的裂解液。
在具有多个位置的实施方案中，控制系统可以被编程用于计算平台行进的最短距离，以使多个位置中的每一个顺序地进入脉冲激光的视场内。
在一个实施方案中，至少一个选定的靶细胞是多个选定的靶细胞，并且可以对控制系统进行编程用以
鉴定待裂解的所选定靶细胞的顺序以最小化执行协调步骤的时间，以及
其中多个所选定的靶细胞在一个视场内，或多个视场内，或在多个位置内。
所选定的靶细胞的顺序可以基于多个选定的靶细胞之间的最短路径。
在一个实施方案中，成像系统可包括用于移位平台的平移机构，所述平移机构由控制系统控制。
在一个实施方案中，控制系统可包括用于控制流体小滴从流体贮存器向至少一个位置移位的小滴控制构件。
在一个实施方案中，脉冲激光源是纳秒脉冲激光器。
在一个实施方案中，脉冲激光源可以是纳秒脉冲激光器，其输送至少1μj的脉冲。
在一个实施方案中，纳秒脉冲激光器可以是基于nd的激光器。
在一个实施方案中，纳秒脉冲激光器产生可见光谱内的脉冲激光束。
在一个实施方案中，脉冲激光源可以是q开关激光器。
根据一个实施方案，参考图1，用于鉴定和靶向细胞群体内的个体细胞以选择性提取细胞内容物的系统1可以包括dmf装置40和成像系统30。
成像系统30可以配备有裂解模块10和成像模块20。成像系统30可以是本领域已知的任何合适的光学成像系统，其可以捕获明场和荧光图像并且可以将激光束导入聚焦激光束中，用于在同一成像平面上形成等离子体气泡。根据一个实施方案，成像系统30可以是显微镜，例如倒置显微镜。成像系统30可以具有用于细胞定位、图像倾斜和自动聚焦的电动平台32和配置用于明场和荧光成像的光学单元31。倒置显微镜的一个可能但非限制性的实例是olympusix-71系列型号。根据另一个实施方案，成像系统可以具有固定平台以及用于细胞定位、图像平铺(imagetiling)和自动聚焦的电动透镜和镜子，而不是配备有电动平台32。
裂解模块10可包括脉冲激光源11，其发射激光微束120。脉冲激光源11使用二向色镜21对准放大物镜24和电动平台32的开口321。脉冲激光源11可以是能够产生高能脉冲激光束的激光源。根据一个实施方案，脉冲激光源11可以是输送至少1μj脉冲的纳秒脉冲激光器。根据另一实施方案，脉冲激光源11可以是纳秒脉冲激光器，其输送>4-6μj的脉冲并且能够产生约0.5至50ns的脉冲或者更快的激光，例如超快激光(飞秒脉冲激光或皮秒脉冲激光)。脉冲激光源11可以是q开关激光器、增益开关激光器、锁模激光器或脉冲泵浦激光器。根据另一实施方案，脉冲激光源11可以能够发射可见光谱内的脉冲激光束。更具体地，脉冲激光源11可以是基于nd的激光器，例如532nmq开关nd：yag激光器。根据一个实施方案，纳秒脉冲激光器可以产生可见光谱内的脉冲激光束。
成像模块20可以包括发射光束220的光源22。光源22可以使用二向色镜21对准放大物镜24和电动平台32的开口321。成像模块可以进一步包括激发滤光器25和发射滤光器26。
系统1可以进一步包括控制系统3，其可以允许小滴操纵和靶细胞裂解的协调管理。电动平台32可以被配置成由控制系统3控制，以编程和管理小滴在dmf装置40上的运动。例如，电动平台32可以用弹簧引脚阵列401修改，其允许控制系统3控制小滴运动，如图2所示。
根据另一实施方案，控制系统3可包括小滴控制系统或机构、计算机和控制板。这种系统的一个实例是开源“dropbot”系统(在http://microfluidics.utoronto.ca/dropbot/中描述)，其可以通过计算机和控制板集中控制，允许小滴操纵和靶细胞裂解的协调管理。电动平台32可以被配置成由小滴控制系统控制，以编程和管理小滴在dmf装置40上的运动。例如，电动平台32可以用弹簧引脚阵列401修改，其允许控制板通过小滴控制系统的界面控制小滴运动。
dmf装置40可搁置在电动平台32上，所述电动平台32被设计成横向移动以重新定位靶细胞并竖直移动以聚焦在选定的靶细胞上。
dmf是一种流体处理技术，其中样品和试剂在疏水表面上作为离散小滴进行操纵。dmf系统通过在绝缘电极的一般阵列上施加电势来致动小滴。这种格式能够允许软件可重新配置的并行小滴操作，包括从贮存器中合并、混合、分流和计量。复杂的多步骤过程可以在dmf装置如dmf装置40上进行，例如，整合的多重elisa、长期多代细胞培养和免疫细胞化学。基于dmf的免疫细胞化学方法具有提供原位评估粘附细胞的可能性的优点。
如图2所示，dmf装置40可以是包括底板41和顶板42的双板dmf装置。底板41可以包括图案化有电极43的玻璃或塑料基板46，电极43涂有介电材料431和疏水材料45。顶板42可包括玻璃或塑料基板46，其涂有导电层，即电极43，其图案涂覆有疏水材料45。图案化涂层可以是这样的，使得顶板42包括图案化的亲水位置44。介电材料431和疏水材料45可以分别是本领域技术人员已知的任何合适的介电材料和疏水材料，例如，用于介电材料431的parylenetmc和用于疏水材料45的teflontmaf。贮存器48位于底板41的两个末端处。可以包含试剂或样品的小滴49可以在dmf装置40上通过主动分配或被动分配从贮存器48移位或移位到贮存器48。通过致动电极43以静电拉伸、颈缩和挤压小滴49来实现主动分配。这种主动分配使得可以在微升级别的细胞样品和试剂上进行可靠且精确的按需分配。通过利用dmf装置40的表面上的表面能的变化来实施被动分配，所述表面主要是疏水的但是图案化有亲水区域。当小滴49在亲水位置44上平移时，被动分配自发地发生。当小滴49在亲水位置44上平移时，表面张力效应导致在所述位置上自发形成子滴。被动分配对粘附的哺乳动物细胞培养是特别有用的，允许细胞100接种到干燥的亲水位置44上，以及允许在具有小滴的位置44上随后的培养基和/或试剂交换。被动分配的一个优点是在亲水位置44处形成虚拟微孔47。虚拟微孔47不像传统孔那样被限制在侧面上，而是由底板41和顶板42以及虚拟竖直壁471的表面特性限定，其通过小滴49的气液界面简单地限定，小滴49通过液体的表面张力保持在亲水位置44处(参见[19]eydelnant等人(2012)labchip12(4):750-757)。虚拟微孔47的体积由亲水位置44的直径和底板41与顶板42之间的距离决定。根据一个实施方案，位置44可以是亲水的、部分亲水的或在蛋白质从样品中结垢/吸附后变成亲水的。
如图2所示，使来自待分析样品的细胞100位于dmf装置40的底板41和顶板42之间。由于细胞100不能在疏水材料上生长，因此细胞100在顶板42的亲水位置44上和在虚拟微孔47中培养。
根据一个实施方案，如图3a所示，可以将含有异质细胞100的样品引入到dmf装置40上。可以将样品以小滴49a的形式引入贮存器48中。然后，将包含细胞100的小滴49a通过主动分配在dmf装置40上从贮存器48向亲水位置44移位。一旦细胞100到达亲水位置44，通过被动分配形成虚拟微孔47，并且可以将细胞100培养足够量的时间以在亲水位置44上实现细胞粘附。替代地，通过将顶板42组装到底板41上预先组装dmf装置40，可以将取样的细胞100引入到顶板42的亲水位置44上，并且任选地进行培养，然后将dmf装置40组装并安装到电动平台32上。在该实施方案中，取样的细胞100可以是作为小滴、活检组织样品的一部分或涂片(例如细胞包含在具有高细胞外基质含量、高度粘性的样品中)引入到亲水位置44上的细胞悬浮液。
如图3a所示，然后用成像试剂标记存在于虚拟微孔47内的细胞100，所述成像试剂与细胞特异性标记在表面和/或细胞内相互作用或结合，以使用文献中熟知的技术鉴定靶细胞110。成像试剂可包括但不限于细胞染色剂如dapi和曙红和/或荧光染料如荧光素衍生物、bodipy衍生物、花青衍生物等。成像试剂可包括结合细胞特异性标记物的结合剂，包括但不限于与可检测标记缀合的抗体，例如上面列出的荧光染料。可以使用技术人员认为合适的用于dmf应用的免疫荧光染色方案。例如，出于本发明的目的，ng等人描述的方案可以用于免疫细胞化学标记细胞[15]。
本领域技术人员将理解，任何可以通过物理、化学、光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、电磁和其他相关分析方法检测的标记可以与成像试剂缀合，特别是结合剂。可以使用的可检测标记包括但不限于放射性同位素、荧光团、发色团、质量标记、电子致密颗粒、磁性颗粒、自旋标记、化学发光分子、电化学活性分子、酶、辅因子和酶底物。在本公开的多个方面中，标记是本文公开的或本领域已知的结合剂。在本公开的多个方面中，标记是免疫细胞化学标记，特别是抗体。
免疫细胞化学标记试剂或染色剂和染料或类似的成像试剂105可以小滴49b的形式引入贮存器48中。然后，含有试剂105的小滴49b可以通过主动分配在dmf装置40上从贮存器48向虚拟微孔47移位。然后可以通过虚拟微孔47致动小滴49b用于免疫细胞化学标记。一旦完成标记，含有过量免疫细胞化学标记试剂105的流体就作为小滴49b'被带到相对的贮存器48中。根据一个实施方案，免疫细胞化学标记细胞的步骤可以包括另外的步骤，例如引入另外的试剂、洗涤等。
根据一个实施方案，免疫细胞化学标记细胞100的步骤可包括在标记之前固定细胞的步骤。固定步骤可包括使用本领域已知的任何可接受的固定剂。固定步骤可包括使用变性固定剂或交联固定剂。非限制性实例包括多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮和戊二醛。系统1可以执行固定或活的细胞的裂解。活细胞具有有限的选择手段(例如，外部细胞标记和形态学)，但可以与广泛的分析相容，例如基因组学、蛋白质组学和代谢组学分析。固定细胞更适合选择(细胞内标记可以通过免疫细胞化学探测)，并且可以长时间稳定；然而，适合探测其内容物的分析技术可能是有限的。
根据一个实施方案，用绿色荧光蛋白(gfp)稳定转导粘附癌细胞系u87，然后在dmf装置上培养两天。如图7a和7b所示，用3纳秒激光脉冲靶向特定细胞，并在裂解后立即收集其裂解液内容物，表明细胞已经裂解并且不再可见。
图6a、6b和7a、7b示例了系统1在dmf装置上裂解固定和活细胞的灵活性。根据一个实施方案，图6a和6b显示了来自cvs分离的多聚甲醛固定的滋养层细胞的裂解(6a为裂解前和6b为裂解后)。对于激光裂解，用pbs替换培养基，并将细胞裂解到pbs小滴中，如图6a和6b所示。然后将裂解液用于基因分型。
根据另一个实施方案，图7a和7b显示活细胞的裂解，使用u87细胞系(7a为裂解前和7b为裂解后)。将用绿色荧光蛋白(gfp)稳定转导的u87细胞在dmf装置上培养两天。如图7a和7b所示，用3纳秒激光脉冲靶向特定细胞，并在裂解后立即收集其裂解液内容物，表明细胞已经裂解并且不再可见。收集由单个u87细胞产生的细胞裂解液，并通过mda扩增全基因组，并通过pcr分析所得样品的gfp基因，以显示可以从单个细胞获得结果，如图8a所示。图8b显示了四条染色体上短串联重复的pcr分析，这表明细胞的激光裂解产生了高水平的基因组覆盖。如图9所示，仅裂解靶向裂解的细胞。红色(b16-tdtomato)和绿色(u87-gfp)细胞混合在一起，5个绿色(gfp)细胞通过激光微束裂解。然后使用全基因组扩增和pcr来检测细胞裂解液中gfp或tdtomato基因的存在。在裂解液中仅检测到gfp基因，这表明绿色细胞周围的红色细胞未裂解。
一旦细胞100已经被免疫细胞化学标记，成像系统30可以使用成像模块20以在明场成像中生成虚拟微孔47的图像以用于尺寸和形状辨别，以及在荧光成像中用于检测标记有细胞特异性生物标志物的细胞核和标记细胞110。分别地，图6a和6b显示了明场成像中滋养层细胞的裂解，并且图7a和7b显示了荧光成像中u87细胞的裂解。图像分析软件，例如cellprofilertm(http://cellprofiler.org/)，可用于基于细胞标记的标记模式和细胞大小/形状确定所关注细胞。捕获的图像可以通过机器学习算法处理以鉴定靶细胞110并在虚拟微孔47中绘制他们的位置以生成靶细胞110的位置的图。可以实施依赖于生物标记物和细胞大小/形状的算法，以鉴定待裂解的靶细胞，例如细胞111、112和113(图3a)。
此外，可以基于细胞形态和表型靶向细胞，包括但不限于细胞大小、形状、表面标记物、细胞内标记物、染料/药物摄取等。
根据一个实施方案，可以基于阳性和/或阴性选择靶向细胞。
图4a示出了作图过程的实例，其中培养的细胞用生物标记物如胎儿细胞标记物1和胎儿细胞标记物2标记。然后对细胞成像并进行图像分析和细胞作图以鉴定和选择靶细胞，例如细胞111、112和113。在细胞作图期间，可以应用算法来确定细胞111、112和113之间的电动平台32的最佳位移路径。
一旦执行了作图并且已经选择了靶细胞，系统1可以将其操作模式从成像模式调整到细胞裂解模式。然后使用靶向图以移动dmf装置40，使得选定的靶细胞(例如细胞111、112或113)进入激光微束120路径用于裂解。在裂解选定的靶细胞后，可以使一个或多个小滴49通过虚拟微孔47以收集细胞内容物，并且自动靶向系统将dmf装置移动到下一个细胞。
现在参考图4b，一旦粘附细胞100已经培养并进行免疫细胞化学标记，就选择标记的细胞110。高能纳秒脉冲激光束120可以通过成像装置30的前后光学透镜聚焦，在靶向选定细胞110附近产生微观等离子体气泡121。等离子体气泡121快速膨胀并且具有足以破坏细胞膜110b的力并裂解选定的标记细胞110，将细胞内容物110c作为细胞裂解液114释放到虚拟微孔47的周围溶液中。根据一个实施方案，脉冲激光源11可以激发激光束120，持续3纳秒，导致等离子体气泡121的形成和靶向标记细胞110的塌陷。
根据另一个实施方案，裂解可以在非常短的时间内完成，例如每个细胞0.5秒或更少。虚拟微孔47或虚拟竖直壁471的“壁”可以简单地由小滴的气液界面限定，该小滴通过液体的表面张力保持在亲水位置44处。这意味着虚拟竖直壁471是柔性的和可变形的，这允许在气泡生长时通过膨胀/变形吸收膨胀的等离子体气泡的能量，然后基于气/液界面的最低能量状态再次弹回到原始形状，而不损坏dmf装置40。
替代地，等离子体气泡121可裂解选定的标记细胞110和焦斑的几微米(μm)内的其他细胞，将多个细胞的内容物作为细胞裂解液释放到虚拟微孔47的周围溶液中。
在一个特定的实施方案中，所述技术可以使用由光学透明材料(例如，类似于用于形成dmf装置的玻璃显微镜载玻片)形成的基板进行，以通过毛细管电泳[16-18]对粘附细胞内容物进行取样，如美国专利号6,156,576所示，其全部内容通过引用并入本文。
根据一个实施方案，可以根据细胞的类型、细胞的状态和要收集的所关注材料来调整脉冲激光源11的重复率(或脉冲重复频率)和脉冲能量。根据一个实施方案，可能需要一个或多个激光脉冲来裂解细胞110。
由于激光微束裂解过程取决于在受限体积中实现非常高的光学功率，因此如果物镜24的焦点没有正确地定位在与靶细胞110相同的距离处，则激光束120的散焦部分不能达到足够高的功率以导致细胞裂解。出于这个原因，优选(但不是必需的)保持正确焦点用以裂解每个所选标记细胞110。因为诸如温度变化和dmf顶板42的平面性偏差的因素可能影响物镜24的焦点或所选定的标记细胞110与物镜24之间的距离，所以必须使用自动聚焦系统为每个所选细胞110调整焦点。
根据一个实施方案，自动聚焦系统(未示出)可以使用简单的软件特征，该软件特征调整电动平台32的竖直位置，以最大化由耦合的成像模块20检测到的对比度。替代地，自动聚焦系统可以包括有源传感器，用以测量物镜24和dmf顶板42的内表面之间的距离，提高聚焦速度。另外，将激光微束120传送到物镜24的裂解模块10的微小变化，例如由于温度或振动，可以改变激光束120进入物镜24的角度，改变激光微束120的焦点。由于产生的等离子体气泡121仅影响小区域，因此冲击点的小变化可能损害适当的细胞裂解。为了防止这种情况，可以通过在电动平台上放置具有荧光涂层的测试基板并且施加低功率激光脉冲来对实际焦点成像来测量激光束120的焦点。通过根据需要更新此信息，可以通过控制系统3以将激光焦点定位在预期位置来校正平台32的放置。
为了有效有序地裂解多个细胞，可能希望使移动电动平台32到达所有细胞的距离最小化，减少每个样品所需的时间。使用在作图过程期间获取的数据，可以应用算法来确定电动平台32从一个选定的靶细胞移动到另一个选定的靶细胞110的最佳位移路径。
如图3b所示，在亲水位置44上培养细胞100后，通过激光微束裂解来裂解标记细胞110中选定细胞或多个选定细胞。如图3b和图5所示，一旦所选定的标记细胞或多个细胞110在虚拟微孔47内裂解，覆盖细胞的液体小滴就被新小滴替换。可以从贮存器48分配新的试剂小滴49，然后可以驱动通过虚拟微孔47，移位包含细胞裂解液的原始流体小滴49。原始流体被送到装置40的相对侧上的贮存器48中。
如图5的静止图像所示，如所示从装置40一侧上的贮存器48分配新的小滴49，然后驱动通过虚拟微孔47，从而移位虚拟微孔47中的包含细胞裂解液的原始流体。原始流体被送到装置40另一侧上的贮存器48中。小滴49在溶解之前和之后可移动的观察表明激光微束等离子体气泡121不会损坏dmf装置40的任何表面并且小滴49运动在裂解后不受阻碍。这表明使用裂解模块来提取在dmf装置内培养的靶细胞的细胞内容物可以与dmf技术相容。
在到达装置40另一侧上的贮存器48之前，可以在dmf装置40上进一步操纵包含细胞裂解液112的小滴49。一旦小滴49到达另一侧贮存器48，则可以收集小滴49用于下游芯片外分析或用于芯片上分析。通过使用控制系统3与小滴运动同步地仔细控制激光照射的时间选择，可以在短时间内产生包含单个细胞的内容物(或多个细胞的内容物，如果需要)的小滴阵列。根据一个实施方案，dmf装置40可以在装置的两侧上具有多个贮存器48(如图2所示)。一旦小滴49已经从虚拟微孔47收集细胞裂解液，就可以将小滴分隔开，并且所得到的小滴可以移位到相同的贮存器48或移位到不同的贮存器48。
根据一个实施方案，当连续地裂解多个细胞110(例如细胞111、112和113)时，小滴49c'、49d'和49e'可以被送到相同的贮存器48。在这种设置下，在将小滴49c'、49d'和49e'移位到贮存器48之前，可以将清洁小滴引到装置40上以清洁小滴路径和贮存器48。替代地，可以使用其他清洁手段来防止污染。根据另一个实施方案，当dmf装置40在装置的两侧上具有几个贮存器48时(如图2所示)，每个小滴49c'、49d'和49e'可以移位到不同的贮存器48，因此最小化污染。
根据本公开的实施方案，将裂解模块10与dmf装置40组合的优点是配合由控制系统3进行的小滴49在粘附细胞100上的移位，由控制系统3精确控制来自脉冲激光源11的激光微束120的照射时间选择。
对激光微束照射时间选择和小滴移位的这种协调控制使得用户能够快速生成小滴阵列，每个小滴可以包含单个细胞的内容物，同时使污染和降解最小化。替代地，多个细胞的内容物可以包含在小滴中。
在一个实施方案中，dmf装置40和包括裂解模块10和成像模块20的成像系统30都可以由编程有控制软件的控制系统3控制(或至少协调)，其中不干扰的步骤可以同时运行(例如，小滴可以在平台重新定位的同时移动)，但是应该满足某些条件以进行的检查点将确保系统在关键点处于正确状态，例如激光源11直到平台32、dmf装置40和小滴49就位才会发射。此外，小滴49直到在通过比较前后的相机图像确认裂解才会移开；等等。也可以执行自动错误处理：如果检测到系统未处于正确状态，则可以重试小滴移动或激光裂解，只在无法纠正错误时才通知操作员。
根据一个实施方案，图3b示出了小滴移动和激光裂解之间的协调。当激光束120裂解靶细胞111释放细胞111c的细胞内容物时，小滴49c从贮存器48向虚拟微孔47移位。然后驱动小滴49c通过虚拟微孔47，将包含细胞裂解液111c的虚拟微孔47中的原始流体移位。原始流体作为小滴49c'被送到相对的贮存器48。随着小滴49c'到达贮存器48并被收集用于分析，当激光束120裂解靶细胞112释放细胞的内容物112c时，第二小滴49d从贮存器48向虚拟微孔47移位。
然后驱动小滴49d通过虚拟微孔47，将包含细胞裂解液112c的虚拟微孔47中的先前流体移位。含有裂解液112c的流体作为小滴49d'被送到相对的贮存器48。随着小滴49d'到达贮存器48并被收集用于分析，当激光束120裂解靶细胞113释放细胞的内容物113c时，第二小滴49e从贮存器48向虚拟微孔47移位。然后驱动小滴49e通过虚拟微孔47，将包含细胞裂解液113c的虚拟微孔47中的先前流体移位。含有裂解液113c的流体作为小滴49e'被送到相对的贮存器48。可以重复此过程直到所有靶细胞110被裂解并收集他们的内容物。对于不同裂解的裂解液可以被带到不同的贮存器，或者替代地收集在相同的贮存器中。
应当理解，小滴49c、49d和49e是非限制性实例，并且一个或多个小滴可以通过微孔以分别收集细胞111、112和113的裂解液内容物111c、112c和113c。当小滴49c、49d和49e在控制系统3的控制下通过虚拟微孔47时，控制系统3移位电动平台32以调节dmf装置40，从而定位并聚焦在下一个靶细胞用于裂解。为了最小化裂解液内容物的污染和降解，与裂解模块10连通的控制系统3及时协调小滴49的分配、电动平台32的竖直和水平位置的调节以及脉冲激光源11的发射。
根据一个实施方案，在控制系统3的控制下，裂解-平台移位-裂解-平台移位等可以在以下时间尺度上进行：对于在虚拟微孔内移动每个步骤为约5秒或更短，以及当在相邻的微孔之间移动时每步骤为15秒或更短。一旦收集所选细胞111、112和113的裂解液111c、112c和113c用于芯片外分析，就可以进行裂解细胞内容物的基因组学、代谢组学、转录组学和/或蛋白质组学分析，随后可以将获得的信息与分析之前编入目录的细胞形态和表型信息相关联。这些基于“组学”的分析对于研究干细胞及其分化以了解循环肿瘤细胞及其在转移性疾病中的作用的许多研究和临床应用非常重要。根据另一个实施方案，可以收集裂解液111c、112c和113c用于芯片上分析，例如通过电化学的elisa和mirna检测或可以与dmf装置连接的其他检测方式。用于鉴定和靶向细胞群体内的个体细胞以选择性提取细胞内容物1的系统也可以配置为一种在收集裂解液之前裂解多个细胞的模式。
根据一个实施方案，为了确保可以从外部源导入目标图谱或将其导出到其他仪器并且可以移动电动平台32以准确地定位dmf装置40，成像系统30的坐标空间必须与dmf装置40对准。因为在制造期间dmf装置40的位置和旋转总是存在微小的变化，所以可以将两个或更多个对准标记(未示出)添加到dmf顶板42以由成像系统30定位并可以用作参考点。为了定位标记，成像系统30扫描应该找到标记的区域，并且可以通过几种方法之一检测他们的位置，包括利用对准标记的模板图像或基于特征识别的方法找到自相关最大值[20]。由于对准标记内以及标记和虚拟微孔47之间的位置关系可以通过dmf装置40的设计来定义，所以假设装置40与电动平台32共面，可以由标记的位置计算在dmf装置40的坐标和成像系统30的坐标之间转换所需的平移和旋转。
根据一个实施方案，控制系统3可以编程有指令模块，所述指令模块定义系统1的操作参数。模块可以彼此独立，并且可以根据需要以不同的配置组装。根据正在进行的实验，可以生成多个模块。
根据一个实施方案，如图11所示，控制系统3可以编程有以下指令模块，所述指令模块装配在一起以鉴定和靶向群体内的个体细胞以选择性地提取细胞内容物：1)细胞加载和处理、2)细胞染色、3)图谱生成和4)激光细胞裂解。
自动细胞加载和处理模块的迭代显示在图12中。在图12以及下面描述的图13、14和15中，圆圈代表对系统的输入(例如，细胞、药物等)。矩形是动作，三角形是时间。如图12所示，模块可以通过将单个细胞悬浮液加载到dmf装置40中和将小滴49在亲水位置44上移动以形成虚拟微孔47的程序来将细胞加载到虚拟微孔47中。如果平台32配备有温度和co2控制以便调节dmf装置40的温度和co2水平，则控制系统3可以通过成像模块20监测细胞密度。对于活细胞成像和分析，37℃和5％co2是最佳的操作条件。请注意，对于固定细胞，室温和无co2可用于成像和分析。一旦达到所需的细胞密度，控制系统3将以各种模式(浓度、持续时间等的变化)自动用不同的试剂(药物、配体等)处理细胞。
可能的细胞处理的实例是用pdgf刺激，如ng等人所表明的(参考文献15)。细胞染色模块的迭代(图13)显示了在dmf装置40上进行免疫细胞化学和/或用染料或染色剂(例如dapi)处理细胞100所需的自动化步骤。图谱生成模块的迭代(图14)描述了控制系统3鉴定所关注细胞并生成其位置图谱所需的步骤。为了生成图谱，以鉴定所关注参数所需的最低分辨率取得细胞100的图像。例如，如果细胞大小和形状是参数，则将使用5x或10x放大倍数。然而，如果参数是蛋白质的亚细胞定位，则需要更高的放大倍数。将图像平铺在一起以作图整个虚拟微孔47，并且这可以用于定位所关注细胞110。可以预先确定用于鉴定所关注细胞110的参数并将其输入到程序中。在其最简单的形式中，参数可以是基于细胞大小的截止阈值。替代地，参数可以是基于若干因素的多参数阈值。这种情况的一个可能实例可以是机器学习，其中训练集可以用于开发用于鉴定所关注细胞的规则。
图15显示了细胞裂解模块的迭代，其控制激光裂解的步骤。在鉴定出所关注细胞110之后，用户可以选择告诉控制系统3将收集哪些细胞110(所关注细胞的全部或子集和/或对照细胞)，每个小滴裂解的细胞数量等。由此，控制系统3可以生成靶列表和细胞裂解模式(或路线)。此裂解模式可以使裂解事件之间行进的距离最小化，以最小化裂解所有靶细胞110所需的操作时间[21,22]。如果存在任何简单的装置上样品处理和分析，则这也可以通过程序自动执行，然后可以存储小滴49以从装置收集以进行进一步分析。复杂的装置上样品处理或分析可能有其自己的程序模块，其可以在细胞裂解模块之后运行。这些示例模块示出了工作流程的主要高级步骤和决策点，因此可能未示出一些步骤，并且流程图的每个框可具有未示出的若干子步骤。
根据一个实施方案，本发明的系统、方法和试剂盒可用于鉴定、分离和/或表征细胞材料/分析物作为非侵入性测试。在一个方面，系统、方法和试剂盒可以用作病理病症的非侵入性诊断或筛选。在另一方面中，系统、方法和试剂盒可用于非侵入性基因、基因组、代谢、转录组学和/或蛋白质组学诊断和/或筛选。在一个方面中，分析物可以包括但不限于核酸、蛋白质(例如，氨基酸、肽、酶、抗原、抗体、细胞因子、脂蛋白、糖蛋白、生长因子或激素)、脂质、碳水化合物、代谢物或其组合。可以使用本公开的系统、方法和试剂盒检测、诊断或筛选的病理病症的实例包括但不限于细胞增殖病症。细胞增殖病症的实例包括但不限于结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、淋巴结癌、结肠癌、前列腺癌、脑癌、头颈癌、皮肤癌、肝癌、肾癌和心脏癌；炎症，如皮肤的炎症症状；与肥胖有关的病症；如脂肪细胞的增殖；病毒病症和心脏病。
在一个方面中，分析物的分析(例如，检测和/或蛋白质的水平和/或表征)可以使用本领域技术人员已知的各种方法确定，例如各种形式的免疫测定，例如放射免疫测定(ria)、化学发光和荧光免疫测定、酶免疫测定(eia)、酶联免疫测定(elisa)、基于luminex的微球阵列、蛋白质微阵列测定和快速测试形式，如免疫层析条带测试和选择/多重反应监测(srm/mrm)。免疫测定可以是竞争性或非竞争性的同源或异源测定。用于分析蛋白质的其他方法的实例包括光谱测定法、质谱法、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(maldi-tof)质谱、显微术、northern印迹、等电聚焦、sds-page、pcr、定量rt-pcr、凝胶电泳、dna微阵列、蛋白质测序、蛋白质组分析和抗体微阵列、或其组合。
在一个方面中，细胞分析物是核酸。核酸可以是dna(例如，来自rna的基因组、线粒体和互补cdna)或rna(例如，rrna、mrna和mirna)。在一方面中，核酸是核苷酸、寡核苷酸、dna、rna或dna-rna杂合体。在一个实施方案中，核酸是dna，特别是双链dna、单链dna、多链dna、互补dna、基因组dna或非编码dna。在一个实施方案中，核酸是rna，特别是信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、小核仁rna(snorna)、核糖体rna(rrna)、转移rna(trna)、小干扰rna(sirna)、异源核rna(hnrna)或小发夹rna(shrna)。
以下是使用本发明的系统或方法处理细胞的一般程序：
·获得细胞样品；
·由样品生成单细胞悬浮液
·将细胞悬浮液加载到dmf装置中
·将细胞悬浮液作为小滴在dmf装置的至少一个位置上移动，以在至少一个位置的每一个处形成虚拟微孔
·将所需位置处的细胞悬浮液小滴中的细胞固定化
·选择至少一个固定化的细胞
·使用脉冲激光源裂解至少一个选定的细胞，以在其相应的虚拟微孔内产生裂解液
·将一个液体小滴移位到相应的虚拟微孔中以收集裂解液
·将含有裂解液的小滴从相应的虚拟微孔移动到指定的位置。
在一个方面中，提供了一种用于使用罕见细胞和/或分析物检测异常在混合细胞群体的样品中的存在的方法，其包括将样品加载到本公开的数字微流体系统上以富集罕见细胞和/或分析物，并通过分析富集的罕见细胞和/或分析物来确定异常是否存在。
在一些方面中，本公开的系统、方法和试剂盒可用于检测罕见细胞，其在样品中的浓度小于样品中所有细胞的1:2、1:4、1:5、1:10、1:20、1:50、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:5000、1:10,000、1:20,000、1:50,000、1:100,000、1:200,000、1:500,000、1:1,000,000、1:2,000,000、1:5,000,000、1:10,000,000、1:20,000,000、1:50,000,000、1:100,000,000。在一些实施方案中，样品包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个罕见细胞。
根据一个实施方案，细胞样品可以按照从来源获得的原样直接使用或在预处理以改变样品的特征之后使用。样品可以衍生自任何生物来源，例如组织、提取物、细胞培养物和生理流体，例如全血、血浆和血清，并且可以从任何动物受试者获得。动物可以是人或驯养动物，例如牛、猪、马、兔、狗、猫或山羊。
根据一个实施方案，本公开的系统、方法和试剂盒可以与已经加工成富含罕见细胞的细胞样品一起使用。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于鉴定和靶向细胞群体内的个体细胞以选择性提取细胞内容物的方法。所述方法包括将包含细胞的样品加载到数字微流体装置的至少一个位置上，从而在至少一个位置的每一个处形成虚拟微孔；固定化至少一个位置上的细胞；选择至少一个固定化的细胞；使用脉冲激光源裂解至少一个选定的细胞以在其相应的虚拟微孔内产生裂解液；将一个液体小滴移位到相应的虚拟微孔中以收集裂解液；以及
将含有裂解液的小滴从相应的虚拟微孔移动到指定的位置。
术语“固定化”和“固定化的”的含义不限于“诱导细胞粘附”和“粘附的(adhered)/粘附(adherent)”。
在一些实施方案中，用于接收细胞的至少一个位置可以是亲水的、部分亲水的或在蛋白质从样品中结垢/吸附后变成亲水的。
在一个实施方案中，所述方法可以包括生成固定化的细胞的位置图谱的步骤，并且其中选择至少一个固定化的细胞的步骤包括从图谱中选择至少一个细胞。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括标记固定化的细胞的步骤，并且这还可以包括固定细胞。
在一个实施方案中，所述方法还可以包括以下步骤：
沿着水平轴和竖直轴移动数字微流体装置，用于定位数字微流体装置，从而用于裂解固定化的细胞中另一个至少一个选定的细胞；
使用脉冲激光源裂解另一个至少一个选定的细胞，以在其相应的虚拟微孔内产生另一个裂解液；
将另一个液体小滴移位到相应的虚拟微孔中以收集另一个裂解液；以及
将含有另一个裂解液的另一个小滴从相应的虚拟微孔移动到指定的位置。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括在初始位置引入含有细胞的样品并将样品移位到至少一个位置的步骤。
在一个实施方案中，至少一个位置是多个位置，并且包括以下步骤
将小滴移动到所述多个位置，
选择所述多个位置中的每一个处待裂解的细胞，
选择第一位置以照射该位置处的选定细胞，
移动平台以顺序地移动数字微流体装置以便使每个位置进入脉冲激光源的视场内，以裂解所选定的细胞从而在每个位置处产生裂解液，以及
收集每个位置处的裂解液。
在其中至少一个位置是多个位置的此实施方案中，所述方法可以包括计算平台行进的最短距离，以使多个位置中的每一个顺序地进入脉冲激光源的视场内。
在其中至少一个位置是多个位置的另一个实施方案中，至少一个选定的靶细胞是多个选定的靶细胞，所述方法可以进一步包括
鉴定待裂解的所选定靶细胞的顺序以最小化对所有选定的靶细胞进行裂解的时间，以及
其中多个所选定的靶细胞在一个视场内，或多个视场内，或在多个位置内。
在所述方法的一个实施方案中，脉冲激光源可以是纳秒脉冲激光器。
在所述方法的一个实施方案中，脉冲激光源可以是纳秒脉冲激光器，其输送至少1μj的脉冲。
在所述方法的一个实施方案中，纳秒脉冲激光器可以是基于nd的激光器。
在所述方法的一个实施方案中，纳秒脉冲激光器可以产生可见光谱内的脉冲激光束。
在所述方法的一个实施方案中，脉冲激光源可以是q开关激光器。
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括对指定位置处的裂解液进行芯片上分析的步骤并且在此实施方案中，所述方法可以进一步包括从指定位置处收集含有裂解液的小滴用于芯片外分析的步骤。
产前和新生儿诊断
本发明的系统和方法可用于广泛的应用，包括但不限于：鉴定罕见胎儿细胞用于非侵入性产前基因诊断筛选的基因组分析，鉴定循环肿瘤细胞用于癌症诊断，对药物有反应(或不反应)的细胞之间的区分，基于蛋白质定位变化的细胞分析，在不同分化阶段的干细胞评估和先天异常的鉴定。在一个方面，本发明的系统和方法用于染色体异常和单基因病症的非侵入性产前基因诊断。
在一个方面，提供了一种用于使用罕见细胞和/或分析物检测异常在混合细胞群体的样品中的存在的方法，包括将样品加载到本公开的数字微流体系统上以富集罕见细胞和/或或分析物，并通过分析富集的罕见细胞和/或分析物来确定异常是否存在。
在一些方面，本公开的系统、方法和试剂盒可用于检测罕见细胞，其在样品中的浓度小于样品中所有细胞的1:2、1:4、1:5、1:10、1:20、1:50、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:5000、1:10,000、1:20,000、1:50,000、1:100,000、1:200,000、1:500,000、1:1,000,000、1:2,000,000、1:5,000,000、1:10,000,000、1:20,000,000、1:50,000,000、1:100,000,000。在一些实施方案中，样品包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个罕见细胞。在本公开的实施方案中，罕见细胞是胎儿细胞，特别是胎儿细胞和母体细胞样品中的胎儿细胞。
本公开的系统、方法和试剂盒可以用于检测胎儿细胞或胎儿分析物，特别是他们可以用于检测、诊断或帮助诊断产前或新生儿病症。在一个方面，本公开的系统、方法和试剂盒用于诊断或帮助产前诊断基因病症。分析物包括但不限于核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、代谢物或其组合。
可以使用本公开的系统、方法和试剂盒检测或诊断的病症的实例包括但不限于常染色体显性病症，例如软骨发育不全、成骨不全、马凡(marfan)综合征、多囊肾病、waardenburg综合征等，常染色体隐性病症，例如cockayne综合征、囊性纤维化、tay-sachs病、镰状细胞贫血症、先天性肾上腺增生、α-和β-地中海贫血；x连锁障碍，例如脆性x综合征、杜兴氏(duchenne)肌营养不良症、血友病a和b；印迹障碍，例如angelman综合征/praderwilli综合征和显微镜和亚显微镜染色体异常等。(还参见，例如，milunskya,和milunsky,jm编.geneticdisordersandthefetus:diagnosis,preventionandtreatment,第7版johnwiley&sons,2015,关于产前基因病症)
在本公开的实施方案中，产前病症是染色体异常。染色体异常包括但不限于整个染色体或包含一个或多个基因的染色体区域的获得或损失或异常数目的染色体。
涉及染色体异常的病症的实例包括但不限于唐氏(down)综合征和digeorge综合征、13三体性、18三体性、21三体性(唐氏综合征)、单体性、三倍性、四倍性、克氏(klinefelter)综合征(xxy)和其他性染色体非整倍体或常染色体异常及其组合。
在一个实施方案中，产前病症是单基因障碍。
在一个实施方案中，产前病症包括、选自或选自由以下组成的群组：digeorge综合征、13三体性、18三体性、21三体性(唐氏综合征)、克氏综合征(xxy)、单体性、三倍性、四倍性和其他性别染色体或常染色体非整倍体，及其组合。
在一个实施方案中，产前病症是三体性，更具体地，21三体性、18三体性、13三体性或其组合。
可以使用本公开的系统、方法和试剂盒检测或诊断的其他病症的实例包括但不限于细胞增殖病症。细胞增殖病症的实例包括但不限于结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、淋巴结癌、结肠癌、前列腺癌、脑癌、头颈癌、皮肤癌、肝癌、肾癌和心脏癌；炎症，如皮肤的炎症；与肥胖有关的病症；如脂肪细胞的增殖；病毒病症和心脏病。
在一个方面，提供了一种用于富集含有混合细胞群体(例如胎儿和母体细胞)的样品中的胎儿细胞和/或胎儿分析物的方法，其包括使样品经受本公开的微流体系统，所述微流体系统具有用于分开和分离胎儿细胞和/或分析物的元件。
在一个方面中，提供了一种用于从样品获得和使用胎儿细胞和/或胎儿分析物以进行产前诊断的方法，所述方法包括本公开的微流体装置，其具有用于从样品中分开和分离胎儿细胞和/或分析物的元件。
可以在本公开的方法中使用阳性和/或阴性选择。在一个具体方面中，所述方法包括诊断装置，其包括本公开的微流体装置，所述微流体装置具有从异质样品中分开和分离胎儿细胞和/或胎儿分析物的元件，其中所述元件包含结合胎儿细胞特异性标记物和/或母体细胞特异性标记物的结合剂，包括表面或细胞内标记物。在一个具体方面中，所述方法包括诊断装置，其包括本公开的微流体装置，所述微流体装置具有从异质样品中分开和分离胎儿细胞和/或胎儿分析物的元件，其中所述元件包含结合胎儿细胞特异性标记物(包括表面或细胞内标记物)的结合剂。在一个具体方面中，所述方法包括诊断装置，其包括本公开的微流体装置，所述微流体装置具有从异质样品中分开和分离胎儿细胞和母体细胞的元件。在一个实施方案中，胎儿细胞特异性标纪物可包含、选自以下或选自由以下组成的群组：胎儿细胞标记物1、胎儿细胞标记物2、5t4、hla-g、cd227、绒毛膜促性腺激素β亚基(β-cg)、胎盘催乳素、细胞角蛋白7、胎盘碱性磷酸酶、ndog1、psg1、psg9、mmp14、mcam、kcnq4、cldn6、f3、peg10、flt1、cbg、gcm1、gpa、cd45、egfr、apob、cd71、cd36、cd34、hbf、fb3-2、h3-3、hae9、fb3-2、hbe、apoc3、ambp、cpb2、itih1、apoh、hpx、ahsg、apob、bpg、碳酸酐酶(ca)和胸苷激酶。在一个实施方案中，母体细胞特异性标记物包含、挑自以下、选自以下，或选自由以下组成的群组：cd90、cd73、cd44、cd105和cd29。
本公开的方法还可以基于诸如大小和形状的形态特征来选择胎儿细胞(胎儿细胞的形态特征参见例如，james等人,humanreproduction22(8):2111-2119,2007；bulmer等人,prenataldiagnosis23:34-39,2003；moser等人,placenta32:197-199,2011；以及caruso等人,intjmolcellmed.1(2):64–74,2012)。
所述方法能够从怀孕受试者中非侵入性地获取胎儿细胞和胎儿分析物，其可用于多种目的，包括但不限于宫颈样品中胎儿细胞的鉴定、胎儿细胞密度的测定以预测高风险妊娠、胎儿核酸的基因分析、胎儿核型的确定、胎儿细胞中胎儿dna的基因分析、胎儿异常的检测、妊娠可能的并发症的检测，以及生物标记物或生长因子的测定以预测产前和产后病症。
样品可以按照从来源获得的原样直接使用或在预处理以改变样品的特征之后使用。样品可以衍生自任何生物来源，例如组织、提取物、细胞培养物和生理流体，例如全血、血浆和血清，并且可以从任何动物受试者获得。动物可以是人或驯养动物，例如牛、猪、马、兔、狗、猫或山羊。在一个实施方案中，样品可以从疑似怀孕、怀孕或已怀孕的动物获得，以检测产前病症的存在。
本公开的系统、试剂盒和方法特别适用于从宫颈内样品获得胎儿细胞和胎儿分析物。宫颈内样品或宫颈粘膜样品可使用本领域技术人员已知的标准非侵入性程序获得，包括但不限于子宫内灌洗、宫颈粘液的抽吸，或从宫颈或宫颈内管中去除表面组织。在一个实施方案中，使用细胞刷从宫颈内管获得宫颈粘膜样品。宫颈内样品可以用市售的试剂盒如
在一个实施方案中，宫颈内样品在妊娠初期期间从受试者获得。在一个实施方案中，宫颈内样品在妊娠的孕中期早期期间从受试者获得。
样品可以在不同时间(例如，在整个妊娠期间)重复地从受试者收集，并且可以用于验证早期检测结果和/或鉴定例如治疗引起的变化。
在一个方面中，所述方法包括诊断装置，其包括本公开的微流体装置，所述微流体装置具有在宫颈内样品中从母体细胞分开和分离胎儿细胞或胎儿分析物的元件，其中所述元件包含结合胎儿细胞特异性标记物和/或母体标记物的结合剂，包括表面或细胞内标记物。在一个实施方案中，胎儿细胞特异性标记物包含、可以挑自，或选自由以下组成的群组：胎儿细胞标记物1、胎儿细胞标记物2、5t4、hla-g、cd227、绒毛膜促性腺激素β亚基(β-cg)、胎盘催乳素、细胞角蛋白7、胎盘碱性磷酸酶、ndog1、psg1、psg9、mmp14、mcam、kcnq4、cldn6、f3、peg10、flt1、cbg、gcm1、gpa、cd45、egfr、apob、cd71、cd36、cd34、hbf、fb3-2、h3-3、hae9、fb3-2、hbe、apoc3、ambp、cpb2、itih1、apoh、hpx、ahsg、apob、bpg、碳酸酐酶(ca)和胸苷激酶。在一个实施方案中，母体细胞特异性标记物包含、挑自，选自或选自由以下组成的群组：cd90、cd73、cd44、cd105和cd29。
结合胎儿细胞特异性标记物或母体细胞特异性标记物的结合剂包括如下物质，如与一种或多种细胞特异性标记物特异性结合的多肽或抗体，或在某些情况下细胞内细胞器(例如核糖体、内质网)或细胞核酸。如果物质以可检测的水平与一种或多种细胞特异性标记物反应，并且不与含有不相关或不同序列的多肽或肽以可检测方式反应，则物质“特异性结合”。可以使用本领域已知的方法(例如elisa)评估结合特性，其可以由本领域技术人员容易地进行(参见例如，newton等人,develop.dynamics197:1-13,1993)。结合剂的实例包括但不限于(具有或不具有肽组分的)核糖体、适体、rna分子和多肽，特别是抗体。抗体可以是合成抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗体片段(例如fab、fab'、f(ab')2)、dab(结构域抗体；参见ward等人,1989,nature,341:544-546)、抗体重链、胞内体、人源化抗体、人抗体、抗体轻链、单链fvs(scfv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、抗独特型(ant-id)抗体、包含抗体部分的蛋白质、嵌合抗体(例如，含有鼠抗体结合特异性但其余部分是人源的抗体)、衍生物，如酶缀合物或标记衍生物、双抗体、线性抗体、二硫键连接fvs(sdfv)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、任何上述的表位结合片段、以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构造。抗体包括任何类型(例如iga、igd、ige、igg、igm和igy)、任何类别(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或任何亚类(例如igg2a和igg2b)的抗体，并且抗体不必是任何特定类型、类别或亚类。抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物(例如人、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、马或鸡)。可以用本文公开的可检测标记来标记结合剂。用可检测标记来标记的结合剂有时在本文中称为成像试剂。
在一个方面中，本公开提供了一种从样品，特别是宫颈内样品中获取胎儿分析物的方法，包括(i)获得样品，特别是宫颈内样品；(ii)将样品引入本公开的微流体系统中，其允许分开和分离胎儿细胞，和(iii)由胎儿细胞产生包含胎儿分析物的裂解液。
在一个方面中，本公开提供了一种用于从样品，特别是宫颈内样品中检测和/或分离胎儿分析物的方法，所述样品包含混合的细胞群体，特别是胎儿细胞和母体细胞，所述方法包括将样品引入微流体系统，其允许(i)分开和分离样品中的胎儿细胞，(ii)裂解分离的胎儿细胞，和(iv)从裂解的胎儿细胞中检测和/或分离胎儿分析物。微流体系统可任选地包括在样品中培养细胞以富集胎儿细胞。在一个实施方案中，所述系统包括本公开的数字微流体装置，以及将胎儿细胞与宫颈内样品中的其他细胞分开和分离的元件，所述元件挑自、选自或选自由以下组成的群组：结合一种、两种或更多种胎儿细胞特异性标记物和/或母体细胞特异性标记物的结合剂。在一个实施方案中，胎儿细胞特异性标记物包含、可以挑自或选自由以下组成的群组：胎儿细胞标记物1、胎儿细胞标记物2、5t4、hla-g、cd227、绒毛膜促性腺激素β亚基(β-cg)、胎盘催乳素、细胞角蛋白7、胎盘碱性磷酸酶、ndog1、psg1、psg9、mmp14、mcam、kcnq4、cldn6、f3、peg10、flt1、cbg、gcm1、gpa、cd45、egfr、apob、cd71、cd36、cd34、hbf、fb3-2、h3-3、hae9、fb3-2、hbe、apoc3、ambp、cpb2、itih1、apoh、hpx、ahsg、apob、bpg、碳酸酐酶(ca)和胸苷激酶。在一个实施方案中，母体细胞特异性标记物包含、挑自、选自或选自由以下组成的群组：cd90、cd73、cd44、cd105和cd29。结合剂可用如上公开的可检测标记来标记。
在一个方面中，胎儿分析物是胎儿蛋白质(例如，氨基酸、肽、酶、抗原、抗体、细胞因子、脂蛋白、糖蛋白、生长因子或激素)。在一个实施方案中，胎儿分析物是生长因子。
在一个方面中，提供了一种用于从包含胎儿细胞的样品中检测或分离胎儿蛋白质的方法，所述方法包括将样品引入微流体系统，所述微流体系统允许(i)分开和分离样品中的胎儿细胞；(ii)裂解分离的胎儿细胞，(iii)从裂解的胎儿细胞中检测或分离胎儿蛋白质，和(iv)任选地分析胎儿蛋白质。微流体系统还可以包括在样品中培养细胞以富集胎儿细胞。
蛋白质的分析(例如，蛋白质的检测和/或水平)可以使用本领域技术人员已知的各种方法来确定，如各种形式的免疫测定，如放射免疫测定(ria)、化学发光和荧光免疫测定、酶免疫测定(eia)、酶联免疫测定(elisa)、基于luminex的微球阵列、蛋白质微阵列测定和快速测试形式，如免疫层析条带测试和选择/多重反应监测(srm/mrm)。免疫测定可以是同源或异源测定，竞争性或非竞争性。用于分析蛋白质的其他方法的实例包括光谱测定法、质谱法、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(maldi-tof)质谱、显微术、northern印迹、等电聚焦、sds-page、pcr、定量rt-pcr、凝胶电泳、dna微阵列、蛋白质测序、蛋白质组分析和抗体微阵列、或其组合。
在一个方面中，胎儿分析物是胎儿核酸。在一个方面中，提供了一种用于从包含胎儿细胞的样品中检测和/或分离胎儿核酸的方法，所述方法包括将样品引入微流体系统，所述微流体系统允许(i)分开和分离样品中的胎儿细胞；(ii)裂解分离的胎儿细胞，(iii)从裂解的胎儿细胞中检测和/或分离胎儿核酸，和(iv)任选地分析胎儿核酸。微流体系统还可以包括在样品中培养细胞以富集胎儿细胞。
胎儿核酸可以是dna(例如，来自rna的基因组、线粒体和互补cdna)或rna(例如，rrna、mrna和mirna)。在一方面中，胎儿核酸是核苷酸、寡核苷酸、dna、rna或dna-rna杂合体。在一个实施方案中，胎儿核酸是dna，特别是双链dna、单链dna、多链dna、互补dna、基因组dna或非编码dna。在一个实施方案中，胎儿核酸是rna，特别是信使rna(mrna)、微小rna(mirna)、小核仁rna(snorna)、核糖体rna(rrna)、转移rna(trna)、小干扰rna(sirna)、异源核rna(hnrna)或小发夹rna(shrna)。
本文公开的方法和系统可用于检测靶序列的存在或不存在、多态性的检测、单多核苷酸多态性分析、单倍型分析、用于序列鉴定的序列扩增、基因表达分析、核酸的定量、分析以及本领域技术人员显而易见的其他应用。
在一个实施方案中，胎儿分析物，特别是核酸、胎儿蛋白质或生长因子，与产前病症相关。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测或诊断样品，特别是宫颈内样品中的产前病症的方法，其包括：(a)将样品引入本公开的微流体系统中以分开、分离和裂解样品中的胎儿细胞；(b)从裂解的胎儿细胞中分离胎儿蛋白质；(c)分析胎儿蛋白质；和(c)检测或诊断产前病症，其中特定胎儿蛋白质的存在或不存在指示产前病症。
在一个实施方案中，提供了一种用于检测或诊断样品，特别是宫颈内样品中的产前病症的方法，其包括：(a)将样品引入微流体系统上以分开、分离和裂解样品中的胎儿细胞；(b)从裂解的胎儿细胞中分离胎儿核酸；(c)分析胎儿核酸；和(c)检测或诊断产前病症，其中特定胎儿核酸的存在或不存在指示产前病症。
在一个实施方案中，本公开提供了一种用于诊断宫颈内样品中的产前病症的方法，其包括将样品引入微流体系统上，所述微流体系统允许(i)培养样品中的细胞以富集胎儿细胞，(ii)分开和分离富集的胎儿细胞，(iii)裂解分离的胎儿细胞，(iv)从裂解的胎儿细胞中分离胎儿核酸，和(iv)分析胎儿核酸。
检测和/或分离胎儿核酸的本公开的方法或系统可以包括分析胎儿核酸的胎儿特异性核苷酸序列。在一个实施方案中，胎儿特异性核苷酸序列是y染色体序列。
在一些方面中，微流体系统包括微流体装置和将胎儿细胞和/或母体细胞与样品(特别是宫颈内样品)中的其他细胞分开和分离的元件，这些元件包括、挑自、选自或选自由以下组成的群组：结合一种、两种或多种胎儿细胞特异性标记物和/或母体细胞特异性标记物的结合剂。在一个特定实施方案中，胎儿细胞特异性标志物可包含、选自或选自由以下组成的群组：胎儿细胞标记物1、胎儿细胞标记物2、5t4、hla-g、cd227、绒毛膜促性腺激素β亚基(β-cg)、胎盘催乳素、细胞角蛋白7、胎盘碱性磷酸酶、ndog1、psg1、psg9、mmp14、mcam、kcnq4、cldn6、f3、peg10、flt1、cbg、gcm1、gpa、cd45、egfr、apob、cd71、cd36、cd34、hbf、fb3-2、h3-3、hae9、fb3-2、hbe、apoc3、ambp、cpb2、itih1、apoh、hpx、ahsg、apob、bpg、碳酸酐酶(ca)和胸苷激酶。在一个实施方案中，母体细胞特异性标记物包含、挑自以下、选自以下，或选自由以下组成的群组：cd90、cd73、cd44、cd105和cd29。结合剂可以用本文公开的可检测标记来标记。
本文公开的包括检测或分离胎儿核酸的方法或系统可以进一步包括在核酸分离和/或分析之前或同时或在分离核酸之后扩增胎儿核酸。可以检测扩增的核酸，然后合并用于分析，合并用于随后的检测和分析，或检测而随后不合并。
在一个实施方案中，本文公开的系统、方法或试剂盒包含扩增所需胎儿核酸所必需的扩增试剂。可以基于扩增方法选择扩增试剂，但可以包括引物、聚合酶、逆转录酶、核苷酸、辅因子、金属离子、缓冲液和类似试剂。
在一个实施方案中，扩增在本公开的系统中进行，其中通过在系统中预先定位试剂，通过将试剂与胎儿分析物组合，通过两者的组合，或通过任何其他合适的方法来提供扩增试剂。
可以使用本领域已知的方法产生胎儿核酸的扩增子[关于已知扩增方法的讨论参见persing,davidh.,"invitronucleicacidamplificationtechniques",diagnosticmedicalmicrobiology:principlesandapplications(persing等人,编辑),第51-87页(americansocietyformicrobiology,washington,d.c.(1993))]。核酸扩增方法的说明性非限制性实例包括但不限于聚合酶链反应(pcr)[参见例如，dieffenbach和dvksler,1995,pcrprimer:alaboratorymanuel.cshl出版社.coldspringharbor,usa；美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159；mullis等人,meth.enzymol.155:335(1987)；以及murakawa等人,dna7:287(1988)]；逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)；链置换扩增(sda)[参见例如walker,g.等人,proc.natl.acad.sci.usa89:392-396(1992)；美国专利号5,270,184和5,455,166；欧洲专利号0684315]；转录介导的扩增(tma)(参见例如美国专利号5,480,784、5,399,491和5,824,518和美国公布申请号20060046265)；基于核酸序列的扩增(nasba)[参见例如sooknanan和malek,1995,biotechnology13:563；美国专利号5,130,238；lizardi等人,biotechnol.6:1197(1988)；kwoh等人,proc.natl.acad.sci.usa86:1173(1989)]；
可以使用本领域已知的常规方法对扩增子和未扩增的核酸进行分析(即，检测、定量、测序等)。方法的实例包括但不限于质量修饰的扩增子的质量检测(例如，基质辅助激光解吸电离(maldi)质谱和电喷雾(es)质谱)、引物延伸方法(参见例如iplextm；sequenom,inc.)、微测序方法、连接酶链反应、连接酶序列测定方法(参见例如美国专利号5,679,524和5,952,174，和wo01/27326)、错配序列测定方法(参见例如美国专利号5,851,770；5,958,692；6,110,684；和6,183,958)、直接dna测序、限制性片段长度多态性、等位基因特异性寡核苷酸分析、甲基化特异性pcr、焦磷酸测序分析、acycloprime分析、反向斑点印迹、genechip微阵列、动态等位基因特异性杂交、肽核酸(pna)和锁核酸(lna)探针、taqmantm、分子信标、嵌入染料(例如，sybrtm、picogreen(molecularprobes,inc.,eugene,oreg)、溴化乙锭)、荧光共振能量转移(fret)系统、alphascreen(perkinelmer)、snpstreamtm(beckmancoulter)、基因位分析(gba)、多重微量测序、snapshot、good测定、微阵列微量测序、阵列引物延伸(apex)、微阵列引物延伸(例如，微阵列序列测定方法)、标签阵列、编码微球、模板指导掺入(tdi)、荧光偏振、比色寡核苷酸连接测定(ola)、序列编码ola、微阵列连接、挂锁探针、invader测定、杂交方法、常规斑点印迹分析、单链构象多态性分析(sscp)(参见例如orita等人proc.natl.acad.sci.u.s.a.86:27776-2770(1989))、变性梯度凝胶电泳(dgge)、异源双链分析、错配切割检测、和克隆和测序、电泳、杂交探针和定量实时聚合酶链反应(qrt-pcr)、数字pcr、纳米孔测序、芯片、用于检测和定量等位基因或横向同源物的闭管方法(参见例如turner等人bmcmedicalgenetics(2015)16:115)。
本公开的系统可以与序列分析设备或序列分析件件结合使用，包括但不限于，illumina基因组分析仪(或solexa平台)、solid系统(appliedbiosystems)、helicostruesinglemoleculedna测序平台(harristd等人2008science,320,106-109)、pacificbiosciences的smrttm系统、或纳米孔测序平台(sonigv和mellera.2007clinchem53：1996-2001)。
本公开的方法可以用作临床实验室服务。在一个方面中，所述方法包括能够从受试者获得样品(例如宫颈内样品)的样品收集装置。
在一个方面中，本公开提供了一种包含诊断装置的试剂盒，所述诊断装置包含本公开的用于从样品，特别是宫颈内样品中分离胎儿细胞和/或胎儿分析物的微流体系统，其中所述系统允许分离胎儿细胞，裂解所裂解的胎儿细胞，以及任选地检测或分离胎儿分析物。所述试剂盒任选地包含用于培养样品中的细胞以富集胎儿细胞的组件。在一个实施方案中，试剂盒包含结合剂。在一个实施方案中，试剂盒包含成像剂。
在一个实施方案中，本公开提供了一种诊断试剂盒，其包括(a)诊断装置，所述诊断装置包括用于从宫颈内样品中分开和分离胎儿核酸的数字微流体系统，其中所述系统允许培养样品中的细胞以富集胎儿细胞，分开富集的胎儿细胞，裂解分开的胎儿细胞和任选地分离胎儿分析物，其中所述系统包含结合一种、两种或更多种胎儿细胞特异性标记物和/或母体细胞特异性标记物的结合剂。在一个特定实施方案中，胎儿细胞特异性标记物包含、挑自以下或选自由以下组成的群组：胎儿细胞标记物1、胎儿细胞标记物2、5t4、hla-g、cd227、绒毛膜促性腺激素β亚基(β-cg)、胎盘催乳素、细胞角蛋白7、胎盘碱性磷酸酶、ndog1、psg1、psg9、mmp14、mcam、kcnq4、cldn6和f3，促进胎儿细胞的分开。在一个特定实施方案中，母体细胞特异性标记物包含、挑自以下或选自由以下组成的群组：cd90、cd73、cd44、cd105和cd29。结合剂可以用本文公开的可检测标记来标记。
诊断试剂盒可另外包括能够从受试者获得宫颈内样品的样品收集装置。诊断试剂盒可另外包括用于扩增胎儿核酸的试剂。
涉及胎儿细胞和胎儿分析物的本公开的方法和试剂盒中的微流体装置或系统优选是本文公开的微流体装置或系统，然而，本领域技术人员将理解，可以利用其他合适的微流体装置或系统。(关于微流体装置和方法的描述参见例如wu,j等人,analyst.2017年1月26日；142(3):421-441；shieldscw等人,cytometrybclincytom.2017年3月；92(2):115-125；shields等人,labchip.2015年3月7日；15(5):1230-49)。
在一个方面中，本公开涉及一种dmf方法用于鉴定和分离样品内的胎儿细胞和/或胎儿分析物的用途。在另一方面中，本公开涉及一种用于从样品中检测和/或分离胎儿细胞和/或胎儿分析物的方法。在多个实施方案中，样品包含胎儿细胞和母体细胞。在多个实施方案中，样品是宫颈内或宫颈粘膜样品。在多个实施方案中，样品是来自怀孕受试者的宫颈内或宫颈粘膜样品。
在多个实施方案中，所述方法包括：
(a)将样品加载到数字微流体装置的至少一个亲水位置上，从而在至少一个亲水位置的每一个处形成虚拟微孔；
(b)固定化至少一个位置上的细胞；
(c)选择至少一个固定化的胎儿细胞；
(d)使用脉冲激光源裂解至少一个选定的胎儿细胞，以在其相应的虚拟微孔内产生裂解液，其中所述裂解液包含分析物；
(e)将一个液体小滴移位到相应的虚拟微孔中以收集所述裂解液；以及
(f)将含有裂解液的小滴从相应的虚拟微孔移动到指定位置，并任选地检测和/或分离裂解液中的分析物。
数字微流体装置通常包括成像系统，所述成像系统包括用于接收数字微流体装置的平台。成像系统包括用于鉴定所选定的胎儿细胞的成像模块和脉冲激光源。
在一个实施方案中，通过培养样品中的细胞从而在至少一个亲水位置上诱导细胞粘附以产生粘附细胞来在(b)中固定化细胞，并且在(c)中选择至少一个粘附的胎儿细胞。
本文公开的或本领域已知的阳性和/或阴性选择或形态学特征可用于在(c)中选择固定化的胎儿细胞。
在一个实施方案中，所述方法还包括生成固定化的(特别是粘附的细胞)的位置图谱，并且其中选择至少一个固定化的(特别是粘附的细胞)的步骤包括从图谱中选择至少一个细胞。
在另一个实施方案中，所述方法还包括免疫细胞化学标记样品中的细胞或标记粘附细胞，并任选地进一步包括固定细胞。
在另一个实施方案中，所述方法还包括：
(i)沿着水平轴和竖直轴移动数字微流体装置，用于定位数字微流体装置，以从固定化的细胞(特别是粘附的细胞)中裂解另一个至少一个选定的细胞；
(ii)使用脉冲激光源裂解所述另一个至少一个选定的细胞，以在其相应的虚拟微孔内产生另一个裂解液；
(iii)将另一个液体小滴移位到相应的虚拟微孔中以收集另一个裂解液；以及
(iv)将含有另一个裂解液的另一个小滴从相应的虚拟微孔移动到指定的位置。
在另一个实施方案中，所述方法还包括将含有细胞的样品引到初始位置，并将样品移位到至少一个亲水位置。
在一个实施方案中，所述至少一个亲水位置是多个亲水位置，并且所述方法包括：
(i)将小滴移动到所述多个亲水位置，
(ii)选择在所述多个亲水位置的每一个处待裂解的细胞，
(iii)选择第一亲水位置以照射所述亲水位置处的选定细胞，
(iv)移动平台以顺序地移动数字微流体装置以便使每个亲水位置进入脉冲激光源的视场内，以裂解所选定的细胞以在每个亲水位置处产生裂解液，以及
(v)收集每个亲水位置处的裂解液，并任选地计算平台行进的最短距离，以使多个亲水位置中的每一个顺序地进入脉冲激光源的视场内。
在一个实施方案中，所选定的胎儿细胞是多个胎儿细胞，并且所述方法包括鉴定待裂解的所选胎儿细胞的顺序以最小化对所有选定的胎儿细胞进行裂解的时间，并且其中所述多个选定的胎儿细胞在一个视场内，或多个视场内，或在多个亲水位置内。
在实施方案中，脉冲激光源是纳秒脉冲激光器。在特定实施方案中，脉冲激光源是纳秒脉冲激光器，其输送至少1μj的脉冲，更具体地是基于nd的激光器。在多个实施方案中，纳秒脉冲激光器产生在可见光谱内的脉冲激光束。在多个实施方案中，脉冲激光源是q开关激光器。
在一个实施方案中，所述方法还包括对指定位置处的裂解液进行芯片上分析。
在一个实施方案中，所述方法还包括从指定位置收集含有裂解液的小滴用于芯片外分析。裂解液，特别是胎儿分析物的分析可以使用本文公开的方法或本领域已知的方法进行。
以下非限制性实施例仅是使用本发明的系统和方法的实施例。
实施例
使用dmf/激光-微束裂解进行产前基因诊断测试
本公开的系统和方法与来自宫颈粘膜样品(cms)的滋养层细胞一起使用。粘附并嵌入在粘稠粘液内的滋养层细胞不适用于流式细胞术或微通道。
将cms样品加载到dmf装置上，在其中接种并培养。用标记物对样品进行染色以鉴定胎儿细胞。孵育后，更换培养基，激光裂解细胞，并且收集裂解液用于芯片外全基因组扩增和基因分型。如图10b所示，cvs对照样品(上图)和匹配的激光裂解的胎儿细胞样品(下图)通过qf-pcr显示相同的杂合等位基因模式。如圈出的等位基因所示，这同样是21三体性阳性。图10c显示了使用下一代测序进行分析的相同激光裂解的胎儿细胞样品的基因分析，并且其显示了相同的21三体性结果。执行的步骤如下：
宫颈粘膜样品制备(产生单细胞溶液的具体方法的实施例)
1)用细胞刷收集宫颈粘膜样品；
2)将样品在4℃下在40mlpbs加10mlamniomax培养基和0.1至5mm(最终)碳酸氢钠中储存多达48小时；
3)将样品温热至室温，并将n-乙酰半胱氨酸加入样品中，使其达到25μm至500mm。
4)在搅拌下将样品在37℃下孵育30至60分钟。
5)将样品在室温下以300×g离心10分钟。
6)取上清液10ml。
7)加入15ml0.25％胰蛋白酶-edta。
8)在搅拌下将样品在37℃下孵育10至30分钟。
9)将样品在室温下以300×g离心10分钟。
10)除去上清液，将样品重悬浮于500μl含0.05％pluronicf-68的amniomax中。
11)将样品转移至1.5ml管中，并在室温下以300×g离心10分钟。
12)将样品重悬浮于200μl含有0.05％pluronicf-68的amniomax中。
样品操纵
13)组装具有顶板的dmf装置，所述顶板含有用于细胞培养的亲水位置。
14)将细胞刷细胞样品混合物加载到dmf装置上并加载到虚拟微孔中。
15)将加载的细胞样品在37℃和5％co2下在培养箱内在加湿烧瓶中孵育过夜。
16)使用交联或变性固定剂如4％多聚甲醛、clarke溶液、hope、乙醇等固定细胞。
17)使用标准染色和标记方法的免疫细胞化学标记使用两种或更多种胎儿细胞标记物(标记物包括但不限于5t4、hla-g、cd227、细胞角蛋白7、ndog1、psg1、mmp14、mcam、kcnq4、cldn6和f3)进行。
18)通过倾斜显微镜或阵列扫描仪对dmf装置成像。对于倾斜显微镜，对完全组装的装置直接成像。对于阵列扫描仪，拆卸该装置，并将顶板用水洗两次并风干以进行成像。
19)使用cellprofiler观察标记的细胞，以基于两种胎儿细胞标记物的染色模式以及细胞大小和形状来确定胎儿细胞。
20)生成虚拟微孔中的胎儿细胞的位置图谱
21)如果在阵列扫描仪上读取，则重新组装用于dmf-lcl的dmf装置。
22)将胎儿细胞裂解到pbs中(200μs激光泵脉冲，0-20μsq开关延迟)
23)将pbs小滴移动到裂解位置以收集胎儿细胞裂解液。
24)将含有胎儿细胞裂解液的小滴移动到贮存器。
25)从贮存器收集胎儿细胞裂解液用于全基因组扩增(wga)。
26)对胎儿细胞裂解液进行wga。
27)对来自wga的cdna进行标准的产前基因检测。这些测试可以是qf-pcr、acgh(阵列比较基因组杂交)、ngs等。
使用激光细胞裂解的细胞加载和分析的具体方法
u87-gfp和b16-tdtomato细胞方案
1)组装dmf装置的顶板和底板
2)在dmem加10％fbs、1％p/s和0.05％pluronicf-68中产生u87-gfp和/或b16-tdtomato细胞的单细胞悬浮液
3)将u87-gfp和/或b16-tdtomato细胞加载到dmf装置中
4)在培养箱内在加湿烧瓶中在37℃和5％co2下在装置上培养u87-gfp和/或b16-tdtomato细胞。
5)用pbs替换培养基
6)激光裂解细胞
7)收集细胞内容物
cvs样品
1)组装dmf装置的顶板和底板
2)用amniomax加0.05％pluronicf-68替换cvs样品上的培养基
3)将cvs样品加载到dmf装置中
4)在37℃和5％co2下在培养箱内在加湿烧瓶中在装置上培养cvs样品。
5)用pbs替换培养基
6)对胎儿细胞裂解液进行全基因组扩增(wga)。
7)对来自wga的cdna进行标准的产前基因检测。这些测试可以是qf-pcr、acgh(阵列比较基因组杂交)、ngs等。
本发明的范围不限于本文所述的具体实施方案，因为这些实施方案仅用于说明本发明的一个方面，并且任何功能上等同的实施方案都在本发明的范围内。实际上，除了本文所示和所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述和附图中变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式整体并入本文，其并入程度如同具体和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用整体并入一般。本文提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，用于描述和公开其中报道的可与本发明结合使用的方法、试剂等。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权凭借在先的发明而先于此类公开内容。
参考文献
1.tang，d.g.，understandingcancerstemcellheterogeneityandplasticity，cellres，2012.22(3)：p.457-72.
2.graf，t.andm.stadtfeld，heterogeneityofembryonicandadultstemcells.cellstemcell，2008.3(5)：p.480-3.
3.lecault，v.，etal.，high-throughputanalysisofsinglehematopoieticstemcellproliferationinmicrofluidiccellculturearrays.natmethods，2011.8(7)：p.581-6.
4.lecault，v.，etal.，microfluidicsinglecellanalysis：frompromisetopractice.curropinchembiol，2012.16(3-4)：p.381-90.
5.macaulay，i.c.，etal.，g&t-seq：parallelsequencingofsingle-cellgenomesandtranscriptomes.natmethods，2015.12(6)：p.519-22.
6.macaulay，i.c.andt.voet，singlecellgenomics：advancesandfutureperspectives.plosgenet，2014.10(1)：p.e1004126.
7.macosko，evanz.，etal.，highlyparallelgenome-wideexpressionprofilingofindividualcellsusingnanoliterdroplets.cell，2015.161(5)：p.1202-1214.
8.treutlein，b.，etal.，reconstructinglineagehierarchiesofthedistallungepitheliumusingsingle-cellrna-seq.nature，2014.509(7500)：p.371-375.
9.kolodziejczyk，a.a.，etal.，thetechnologyandbiologyofsingle-cellrnasequencing.molcell，2015.68(4)：p.610-20.
10.klein，a.m.，etal.，dropletbarcodingforsingle-celltranscriptomicsappliedtoembryonicstemcalls.cell，2015.161(5)：p.1187-201.
11.ng，a.h.，etal.，digitalmicrofluidicmagneticseparationforparticle-basedimmunoassays.analchem，2012.84(20)：p.8805-12.
12.ng，a.h.，etal.，digitalmicrofluidicplatfrormforthedetectionofrubellainfectionandimmunity：aproofofconcept.clinchem，2015.61(2)：p.420-9.
13.barbulovic-nad，i.，s.h.au，anda.r.wheeler，amicrofluidicplatformforcompletemammaliancellculture.labchip，2010.10(12)：p.1536-42.
14.srigunapalan，s.，etal.，adigitalmicrofluidicplatformforprimarycellcultureandanalysis，labchip，2012，12(2)：p.369-75.
15.ng，a.h.，etal.，digitalmicrofluidicimmunocytochemistryinsinglecells.natcommun，2015.6：p.7513.
16.lai，h.h.，etal.，charactenzationanduseoflaser-basedlysisforcellanalysison-chip.jrsocinterface，2008.5suppl2：p.s113-21.
17.quinto-su，p.a.，etal.，examinationoflasermicrobeamcelllysisinapdmsmicrofluidicchannelusingtime-resolvedimaging.labchip，2008.8(3)：p.408-14.
18.sims，c.e.，etal.，laser-micropipetcombinationforsingle-cellanalysis.analchem，1998.70(21)：p，4570-7.
19.eydelnant，i.a.，etal.，virtualmicrowellsfordigitalmicrofluidicreagentdispensingandcellculture.labchip，2012.12(4)：p.750-7.
20.kratschmer，e，etal.，imageprocessingusingshaperecognitionforalignmenttodamagedregistrationmarksinelectronbeamlithography.j.vac.sci.technol.，b：microelectron.nanometerstruct.-process.，meas.，phenorn.b，2009.27：p.2563-2568.
21.held，mandkarp，rm，adynamicprogrammingapproachtosequencingproblems.j.soc.ind.appl.math.196210(1)：p.196-210.
22.johnson，d.s.：mcgeoch，l.a.(1997).“thetravelingsalesmanproblem：acasestudyinlocaloptimization″.inaarts，e.h.l.；lenstra，j.k.local
searchincombinatorialoptimisation.london：johnwileyandsonsltd.pp.215-310.
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