现有技术
甲型流感病毒(负链有包膜正黏病毒)属于最严重的呼吸系统病原体。它们引起严重的和可能致死的疾病(cox等人,2004)。预期高度致病的禽流感病毒将会引起下一次全球大流行病威胁,这是由于容易由禽类宿主扩散以及其直接感染人类的能力(yen和webster,2009)。因此,开发出有效且廉价的疫苗接种策略是即将出现的需求。
处于研究的焦点中的是来自植物的亚单位疫苗。topp等人公开了在植物中重组地产生蛋白质(topp等人,2016)。一项最近开发出的策略是通过将血凝素基因克隆到经充分表征的载体中和瞬时表达来在烟草物种本氏烟草(n.benthamiana)中产生基于病毒样颗粒的疫苗(landry等人,2010;d’aoust等人,2008)。不利的是,该策略包括下游加工步骤,例如几次过滤、渗滤、连续流离心和切向流过滤,或者备选地,色谱方法。
备选地,在本氏烟草叶细胞的内质网(er)中瞬时产生三聚血凝素,以避开限制例如高的下游成本和低的病毒样颗粒的表达水平(phan等人,2013)。关于三聚化,将血凝素在c末端处与三聚基元gcn4-pii相融合(harbury等人,1993)。
czajkowsky等人公开了使用fc融合蛋白作为疫苗(czajkowsky等人,2012),其中所述fc融合物通过增加血浆半寿期、增加与fc受体的相互作用以及增加可溶性和稳定性而增加了抗原的治疗活性。louveiro等人描述了基于血凝素-fc融合蛋白的流感疫苗(人h1、h3流感病毒和禽h5流感病毒)(loureiro等人,2011)。
us7,067,110b1公开了用于增强蛋白质和肽抗原的免疫原性的fc-融合蛋白,其中将所述抗原与免疫球蛋白重链恒定区(ch2、ch3、ch4)相融合。进一步地,所述疫苗包含用于增强或调节特定免疫应答的佐剂,优选地人细胞因子。抗原选自前列腺特异性膜抗原、细胞因子受体的胞外结构域、病毒蛋白质或肿瘤特异性蛋白质。
备选地,通过使用具有s-标签的抗原融合蛋白,描述了用于在疫苗中使用的抗原的纯化。us7,311,918b2公开了轮状病毒亚单位疫苗,其包含具有选自麦芽糖结合蛋白、多组氨酸残基、s-标签、谷胱甘肽-s-转移酶等的融合伙伴(其防止轮状病毒融合蛋白发生复合物形成并且有助于纯化)的重组轮状病毒融合蛋白。us2013/0164296a1公开了作为亚单位疫苗免疫原的连接有例如麦芽糖结合蛋白、s-标签或谷胱甘肽-s-转移酶的融合蛋白,其中融合蛋白伙伴可以防止病毒融合蛋白装配成多聚形式。asai等人公开了在s-标签(源自人核糖核酸酶1的氨基末端15-氨基酸肽)(人s-标签)与s-蛋白(人核糖核酸酶1的残基21至124)之间的特异性相互作用的用途,所述用途为将酶位点特异性地缀合至抗体以便靶向药物递送以用于癌症治疗(asai等人,2005)。
相反地,us2013/0039942a1公开了关于针对微生物和肿瘤的自辅佐性疫苗的组合物和方法,其中将多聚化-细胞内细胞传导盒插入到病毒或载体中。
wei等人(wei等人,2008)描述了就其作为疫苗的潜在效力来比较各种形式的重组血凝素(ha)蛋白,单体、三聚和寡聚h5n1ha蛋白。在粉纹夜蛾(trichoplusiani)(hi5)细胞中(作为高分子量寡聚体(1,321kda)和三聚体(214kda))和在人胚胎肾细胞系293f中表达了重组单体、三聚和寡聚h5n1ha蛋白。ha的高分子量寡聚体引发了最强的抗体应答,接着是三聚ha,而单体ha显示出最小的效力。
因此,对于用于产生具有在诱导潜在中和抗体方面的经改善的免疫原性、低的下游成本和高的表达水平的疫苗的方法,仍然存在需要。
本发明的目标
本发明的目标为找到有效且快速的疫苗接种策略,以及用于产生寡聚蛋白质(优选地用作疫苗)的容易且快速的方法。
本发明的特征
本发明的目标通过用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法而得到解决,所述方法包括下列步骤:
a)在真核细胞中共表达两种融合蛋白,其包括
-包含蛋白质和s-标签的第一融合蛋白(在下文中也称为蛋白质-s-标签融合蛋白),其中所述蛋白质为抗原或抗原结合单元,和
-包含s-蛋白和尾片段(tp)的第二融合蛋白(在下文中也称为s-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白),其中所述尾片段(tp)为源自igm或iga抗体的重链的寡肽,
b)提取所述两种融合蛋白,
其中所述蛋白质-s-标签融合蛋白中的蛋白质的寡聚化在根据步骤a)在真核细胞中进行共表达后和/或在根据步骤b)进行提取后发生。
有利地,根据本发明的用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法是快速的且便宜的。
当在上文和下文中参考一些文献时,在需要的情况下,将这些文献合并。
在本文中所使用的术语“寡聚(体)”是指由少数单体单元组成的分子复合物,其中少数是指2至20,优选地2至9。根据本发明的寡聚蛋白质为蛋白质-s-标签融合蛋白-s-蛋白-尾片段融合蛋白复合物这一单体单元的同寡聚体。在本文中所使用的术语“寡聚化”是指将单体或单体混合物转变为寡聚体的过程。
根据本发明的真核细胞为包含细胞核和其他包封在膜内的细胞器的细胞。
有利地,真核细胞展现出蛋白质二硫键异构酶。在本文中所使用的术语“蛋白质二硫键异构酶”是指在真核生物中在内质网中的这样的酶,其催化在蛋白质内在半胱氨酸残基之间的二硫键的形成和断裂。
在一个实施方案中,所述真核细胞选自植物细胞或酵母细胞。在本文中所使用的术语“植物细胞”是指植物界的多细胞真核生物。在本文中所使用的术语“酵母细胞”是指真菌界的单细胞真核微生物。
在一个优选的实施方案中,真核细胞为植物细胞。有利地,在植物细胞中的表达提供低的生产成本、生产安全性、易于扩大规模、低的基础设施成本以及寡聚蛋白质的高的稳定性和保存期限。进一步有利地,植物细胞能够提供复杂的、经正确折叠的和经翻译后修饰的蛋白质。
在一个实施方案中,所述植物细胞为植物的叶或种子的细胞。在一个实施方案中,所述植物细胞为烟草、大豆或豌豆植物的细胞。在一个优选的实施方案中,所述植物细胞为本氏烟草的叶细胞。有利地,重组抗体显示出在种子中的高的积累和长期稳定性(fiedler和conrad,1995)。
在一个进一步的实施方案中,所述酵母细胞为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的细胞。
在本文中所使用的术语“共表达”是指两个或更多个基因的同时表达。
在本文中所使用的术语“融合蛋白”是指通过连接原来编码分开的蛋白质的两个或更多个基因而产生的蛋白质。该融合基因的翻译导致具有源自原始蛋白质中的每一个的功能特性的单个蛋白质。
根据本发明的抗原为能够在宿主生物中诱导免疫应答的蛋白质,其中免疫系统产生针对所述抗原的抗体。
在一个实施方案中,所述抗原为病毒粒子的膜蛋白或表面蛋白,优选地血凝素。
在一个进一步的实施方案中,血凝素为流感血凝素、麻疹血凝素、副流感血凝素-神经氨酸酶或腮腺炎血凝素-神经氨酸酶。
在一个优选的实施方案中,血凝素选自人h1、h3流感病毒或禽h5流感病毒,优选地选自禽h5流感病毒(特别地,seqidno.1、35或36)。
在一个进一步的实施方案中,其中所述蛋白质为血凝素的所述第一融合蛋白进一步包含三聚化结构域。在本文中所使用的术语“三聚化结构域”是指能够进行寡聚化的寡肽。在一个实施方案中,所述三聚化结构域源自碱性亮氨酸拉链结构域(harbury等人,1993),优选地,所述三聚化结构域包含seqidno.27。
在本文中所使用的“抗原结合单元”为以抗体的特异性和亲和力特异性地结合抗原的分子,例如抗体、适配体或人工特异性结合蛋白。在本文中所使用的术语“抗体”是指通过fab的可变区来识别抗原并且被用于鉴定和中和病原体例如细菌和病毒的蛋白质。抗原结合片段(fab)这种片段为在抗体上的结合抗原的区域。它由重链和轻链中的每一个的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。根据本发明的抗体包括纳米抗体(nanobody)和单链可变片段(scfv)抗体,以及其他至少包含抗体的轻链或重链的可变结构域的抗体片段。
在本文中所使用的术语“纳米抗体”是指单结构域抗体或者包含单个单体可变抗体结构域的抗体片段。纳米抗体能够选择性地结合特定抗原。优选地,所述纳米抗体为vhh抗体。在本文中所使用的术语“vhh抗体”是指重链的单个单体可变区(vh)。有利地,纳米抗体展现出相比于抗体而言良好的水溶性、高的耐热性、高的对胃酸的抗性和对蛋白酶的稳定性。
在本文中所使用的术语“单链可变片段(scfv)抗体”是指用短的连接体肽(优选地具有10至25个氨基酸)相连的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的融合蛋白。
在一个进一步的实施方案中,所述抗体为纳米抗体或单链可变片段(scfv)抗体,优选地纳米抗体。
在一个进一步的实施方案中,所述抗体为特异性地结合病原体或毒素的抗体。所述病原体优选地选自但不限于:细菌、寄生虫和病毒。所述毒素为由活生物例如上面所列出的致病微生物或被其感染的细胞或者高等生物例如真菌或蛇所分泌的有毒物质。
在一个实施方案中,所述抗体为特异性地结合胃肠道(优选地口腔或肠)或呼吸系统的病原体的抗体。
在一个优选的实施方案中,所述抗体为抗志贺菌类毒素抗体、抗猪痢疾短螺菌(brachyspirahyodysenteriae)抗体、抗艾美虫属(eimeria)寄生虫抗体或抗产肠毒素性大肠杆菌(escherichiacoli)(etec)抗体。
志贺菌类毒素是复杂的全毒素,其具有ab5组成,包含具有酶促活性的亚基(a)和由形成五聚体的每个大约7.7kda的五个相同的b蛋白组成的结合结构域(fraser等人,1994;fraser等人,2004)。us8,846,058b2公开了用于产生志贺菌类毒素抗体的方法。
在一个实施方案中,所述抗志贺菌类毒素抗体为抗志贺菌类毒素1型抗体或抗志贺菌类毒素2型抗体。
猪痢疾短螺菌引起猪的痢疾,这是一种对于世界范围内的猪生产的重大损失负有责任的疾病(harris和glock,1972)。
艾美虫属是顶复门(apicomplexan)寄生虫的一个属,其包括能够在动物中引起球虫病这种疾病的各种物种,例如牛艾美虫(e.bovis)、邱氏艾美虫(e.zuernii)和奥本艾美虫(e.auburnensisare)。zimmermann等人公开了抗艾美虫属scfv抗体的产生(zimmermann等人,2009)。
在一个实施方案中,所述抗艾美虫属寄生虫抗体为抗禽艾美虫(e.tenella)抗体、抗堆形艾美虫(e.acervulina)抗体、抗波氏艾美虫(e.brunetti)抗体或抗乳突艾美虫(e.papillata)抗体。
肠毒性大肠杆菌(etec)是大肠杆菌的一种类型并且是腹泻的原因。由etec产生的肠毒素包括热不稳定肠毒素(lt)和热稳定肠毒素(st)。etec菌株在其表面上展现出f4菌毛,头发样附属物。virdi等人分别公开了抗产肠毒素性大肠杆菌(etec)抗体或抗-f4菌毛抗体的产生(virdi等人,2013)。
在一个实施方案中,所述抗产肠毒素性大肠杆菌(etec)抗体为抗-faegab抗体、抗-faegac抗体或抗-faegad抗体。
在一个优选的实施方案中,所述抗体为抗志贺菌类毒素纳米抗体。
在一个实施方案中,所述抗原-s-标签融合蛋白中的s-标签在所述抗原的c-末端或n-末端处,优选地在c-末端处。
在本文中所使用的术语“s-标签”和“s-蛋白”是指源自胰腺核糖核酸酶a(rna酶a)的寡肽。
在一个实施方案中,所述蛋白质-s-标签融合蛋白中的s-标签和所述s-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白中的s-蛋白为来自胰腺rna酶a的野生型。
在一个进一步的实施方案中,所述蛋白质-s-标签融合蛋白中的s-标签选自人(seqidno.2)、牛(seqidno.3)、绵羊(seqidno.4)、山羊(seqidno.5)、猪(seqidno.6)、马(seqidno.7)或狍(seqidno.8)胰腺rna酶a,或者与序列seqidno.2至8之一具有至少70%的序列同一性,优选地与序列seqidno.2至8之一具有至少85%的序列同一性,和最优选地与序列seqidno.2至8之一具有至少95%的序列同一性的寡肽。所述s-标签依照根据本发明的寡聚蛋白质的用途来进行选择,例如来自人胰腺rna酶a的s-标签(seqidno.2)用于在人用疫苗中使用。
在一个实施方案中,所述蛋白质-s-标签融合蛋白中的s-标签包含序列seqidno.2至8之一。
在一个实施方案中,所述蛋白质-s-标签融合蛋白中的s-标签包含序列seqidno.2至8之一,其中所述s-标签的长度为15至20个氨基酸,优选地15个氨基酸。
在一个进一步的实施方案中,所述蛋白质-s-标签融合蛋白中的s-标签为长度为11至19个氨基酸,优选地13至17个氨基酸,和最优选地15个氨基酸的寡肽,其与序列seqidno.2至8之一具有至少70%的序列同一性,优选地与序列seqidno.2至8之一具有至少85%的序列同一性,和最优选地与序列seqidno.2至8之一具有至少95%的序列同一性。
在一个实施方案中,所述s-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白中的s-蛋白选自人(seqidno.9)、牛(seqidno.10)、绵羊(seqidno.11)、山羊(seqidno.12)、猪(seqidno.13)、马(seqidno.14)或狍(seqidno.15)胰腺rna酶a。所述s-蛋白依照根据本发明的寡聚蛋白质的用途来进行选择,例如来自人胰腺rna酶a的s-蛋白(seqidno.9)用于在人用疫苗中使用。
在一个实施方案中,所述s-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白中的s-蛋白包含序列seqidno.9至15之一。
在一个实施方案中,所述s-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白中的s-蛋白包含序列seqidno.9至15之一,其中所述s-蛋白的长度为109至150个氨基酸,优选地109至120个氨基酸。
在一个实施方案中,所述s-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白中的s-蛋白包含长度为80至140个氨基酸,优选地100至120个氨基酸,和最优选地109至113个氨基酸的寡肽,其与序列seqidno.9至15之一具有至少65%的序列同一性,优选地与序列seqidno.9至15之一具有至少80%的序列同一性,和最优选地与序列seqidno.9至15之一具有至少95%的序列同一性。
在本文中所使用的术语“尾片段(tp)”是指源自igm或iga抗体的重链的寡肽。有利地,所述tp与其他tp分子形成二硫化物,并因此与所述s-蛋白-tp融合蛋白相结合的所述蛋白质-s-标签融合蛋白能够进行寡聚化。
在一个进一步的实施方案中,所述s-蛋白-tp融合蛋白中的tp选自人(seqidno.16)、小鼠(seqidno.17)、大猩猩(seqidno.18)、猴(seqidno.19)、狗(seqidno.20)、大熊猫(seqidno.21)、兔(seqidno.22)、亚洲家鼩(seqidno.30)、牛(seqidno.31)、龟(seqidno.32)、仓鼠(seqidno.33)或备选的人变体(seqidno.34),以及与序列seqidno.16至22或30至34之一具有至少75%,优选地85%,更优选地90%,最优选地95%的序列同一性的序列。所述tp依照根据本发明的寡聚蛋白质的用途来进行选择,例如人tp(seqidno.16或seqidno.34)用于在人用疫苗中使用。
在一个实施方案中,所述s-蛋白-tp融合蛋白中的tp包含序列seqidno.16至22或30至34之一。
在一个实施方案中,所述s-蛋白-tp融合蛋白中的tp包含序列seqidno.16至22或30至34之一,其中所述tp的长度为19至25个氨基酸,优选地19个氨基酸。
在一个实施方案中,所述s-蛋白-tp融合蛋白中的tp包含长度为15至25个氨基酸,优选地17至21个氨基酸,和最优选地19个氨基酸的寡肽,其与序列seqidno.16至22或seqidno.30至34之一具有至少75%的序列同一性,优选地与序列seqidno.16至22或seqidno.30至34之一具有至少85%的序列同一性,和最优选地与序列seqidno.16至22或seqidno.30至34之一具有至少95%的序列同一性,其中半胱氨酸(cys,c)残基的位置是不变的。
在一个进一步的实施方案中,根据步骤a)的共表达包括在表达盒中提供编码所述两种融合蛋白的基因和将所述表达盒转移到穿梭载体中的步骤。
在一个实施方案中,所述穿梭载体选自带有穿梭载体(优选地pcb301载体)的土壤杆菌。
在一个进一步的实施方案中,所述表达盒包含选自usp启动子、豆球蛋白启动子、β-菜豆蛋白启动子、camv35s启动子或patatin启动子的启动子。在一个实施方案中,在种子中的表达用usp启动子、豆球蛋白启动子或β-菜豆蛋白启动子来进行,在叶中的表达用camv35s启动子来进行,和在块茎中的表达用patatin启动子或camv35s启动子来进行。
在一个进一步的实施方案中,所述提供编码所述两种融合蛋白的基因的步骤进一步包括用于表达hcpro的穿梭载体。有利地,hcpro是基因沉默的阻抑物,其已被发现显著地增强植物细胞中重组蛋白质的表达水平(conley等人,2009;sudarshana等人,2006)。
在一个进一步的实施方案中,根据步骤a)的共表达包括下述步骤:通过用包含编码所述两种融合蛋白的基因的土壤杆菌菌株共渗入植物细胞(土壤杆菌渗入(agro-infiltration))来在植物细胞中提供编码所述两种融合蛋白的基因。
在本文中所使用的术语“土壤杆菌渗入”是指用土壤杆菌菌株对植物细胞进行渗入。
在一个进一步的实施方案中,通过土壤杆菌渗入来在植物细胞中提供编码所述两种融合蛋白的基因用根癌土壤杆菌(agrobacteriumtumefaciens)来进行。
在一个进一步的实施方案中,通过土壤杆菌渗入来在植物细胞中提供编码所述两种融合蛋白的基因在真空中进行。在本文中所使用的术语“真空”是指低于大气压的气体压力。
在一个进一步的实施方案中,根据步骤a)的共表达在真核细胞的内质网(er)中进行。
根据本发明,根据步骤a)的共表达之后为所述两种融合蛋白的提取。
在一个进一步的实施方案中,所述两种融合蛋白的提取用具有6至9的ph值的水性缓冲溶液,优选地具有7.4的ph值和0.88%氯化钠的磷酸盐缓冲盐水来进行。
在一个进一步的实施方案中,所述用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法在步骤a)和b)之后包括下列步骤:
c)用盐(优选地氯化钠)和/或热进行沉淀,
d)过滤,和
e)在水溶液中溶剂化。
在一个进一步的实施方案中,所述用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法在步骤a)和/或步骤b)之后进一步包括对所述真核细胞进行分析的步骤。
在一个进一步的实施方案中,在步骤a)和/或步骤b)之后对所述真核细胞进行分析包括基因组dna的分析、蛋白质分析和/或生理学分析。
其中所述蛋白质为抗原的寡聚蛋白质的生物学活性可以通过间接酶联免疫吸附测定法(elisa)来证明。其中所述蛋白质为抗原结合单元的寡聚蛋白质的生物学活性可以通过酶联免疫吸附测定法(elisa)来证明。
在一个进一步的实施方案中,所述用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法在步骤a)和b)之后进一步包括添加佐剂。有利地,佐剂通过贮存效应(depoteffect)、通过增强通过膜的能力和/或通过增强免疫活性细胞(例如,t细胞、b细胞或巨噬细胞)的活性来增强抗原性。在一个进一步的实施方案中,所述佐剂根据所述寡聚抗原来进行选择。在一个实施方案中,所述佐剂选自水包油乳化佐剂,优选地
本发明进一步包括寡聚蛋白质,其至少包含:
包含蛋白质和s-标签的第一融合蛋白(其在下文中也称为蛋白质-s-标签融合蛋白),其中所述蛋白质为抗原或抗原结合单元;和
包含s-蛋白和尾片段(tp)的第二融合蛋白(其在下文中也称为s-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白),其中所述尾片段(tp)为源自igm或iga抗体的重链的寡肽。
有利地,所述tp构成所述蛋白质(即所述抗原或抗体)的寡聚化。
有利地,所述至少包含蛋白质-s-标签融合蛋白和s-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白的寡聚蛋白质展现出高的稳定性。在本文中所使用的术语“高的稳定性”是指提取出的寡聚蛋白质的稳定性,优选地在具有6至9的ph值的水性缓冲溶液中,最优选地在具有7.4的ph值和0.88%氯化钠的磷酸盐缓冲盐水中;在直至8℃,优选地0℃至4℃的温度下;持续直至几周,优选地几个月。
在一个进一步的实施方案中,所述寡聚蛋白质包含至少一种佐剂。有利地,佐剂通过贮存效应、通过增强通过膜的能力和/或通过增强免疫活性细胞(例如,t细胞、b细胞或巨噬细胞)的活性来增强抗原性。在一个进一步的实施方案中,所述佐剂根据所述寡聚抗原来进行选择。在一个实施方案中,所述佐剂选自水包油乳化佐剂,优选地
在一个进一步的实施方案中,所述寡聚蛋白质是通过根据本发明的方法来获得的。
本发明的另一个目标是包含编码根据本发明的寡聚蛋白质的核酸序列的核酸,或者包含这样的核酸的载体。
在本文中所使用的术语“核酸”包括脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。以dna形式的核酸是优选的。
在本文中所使用的术语“载体”包括质粒、病毒或其他核酸承载体,其通过基因重组(重组地),例如通过插入或掺入所述核酸序列,而包含根据本发明的核酸序列。原核载体以及真核载体适用于本发明。在本发明中优选地使用原核载体来转染土壤杆菌菌株。
在一个实施方案中,所述核酸至少包含核酸序列seqidno.28和seqidno.29。
在一个实施方案中,所述核酸为编码根据本发明的寡聚蛋白质的核酸序列。
本发明进一步包括包含编码根据本发明的寡聚蛋白质的核酸序列的核酸或者包含这样的核酸的载体在产生根据本发明的寡聚蛋白质中的用途。
本发明进一步包括包含根据本发明的核酸或载体的细胞或非人宿主生物。
优选地,所述细胞或非人宿主生物用于产生根据本发明的寡聚蛋白质。
在本发明意义上的细胞或非人宿主生物为天然出现的细胞或者(任选地经转化的或经遗传修饰的)细胞系或生物,其人工地包含至少一种根据本发明的载体或根据本发明的核酸,如上面所描述的。由此,本发明包括瞬时转染子(例如,通过mrna注射)或包含至少一种根据本发明的载体的细胞。优选地,通过杀死人胚胎而取得的胚胎干细胞被特别地从在本发明意义上的术语“细胞”中排除。
所述细胞优选地选自真核生物的细胞。优选的真核细胞选自植物细胞。所述非人宿主生物优选地为植物。
本发明进一步包括根据本发明的寡聚蛋白质在疫苗中的用途。在本文中所使用的术语“疫苗”是指提供对于特定疾病的免疫性的蛋白质制备物。疫苗可以是预防性的或治疗性的。
在一个进一步的实施方案中,在主动和被动疫苗中使用根据本发明的寡聚蛋白质。
在一个进一步的实施方案中,在流感疫苗中使用根据本发明的寡聚蛋白质。
在一个进一步的实施方案中,在可食用疫苗,优选地针对胃肠道(最优选地口腔或肠)或呼吸系统的病原体的可食用被动疫苗中使用根据本发明的寡聚蛋白质。在本文中所使用的“可食用疫苗”是指口服施用的疫苗,例如包含疫苗的饲喂用转基因种子。
有利地,在用于产生可食用被动疫苗的种子中产生用于被动免疫接种的抗体伴随有最小的下游加工成本。
有利地,根据本发明的寡聚蛋白质是高度稳定的,其中在肠道中的稳定性对于可食用疫苗的成功开发来说是至关重要的。
在一个进一步的实施方案中,将根据本发明的寡聚蛋白质或者通过根据本发明的方法获得的寡聚蛋白质用于制备疫苗。
本发明进一步包括包含根据本发明的寡聚蛋白质的疫苗。
有利地,所述蛋白质(即所述抗原或抗体)的寡聚化增强免疫应答和疫苗效力。
在一个进一步的实施方案中,所述疫苗进一步包含至少一种佐剂。在一个进一步的实施方案中,所述佐剂选自水包油乳化佐剂,优选地
有利地,水包油乳化佐剂形成根据本发明的寡聚蛋白质的移动式储库,其可以靶向免疫效应细胞并且增强免疫应答和疫苗效力。
在一个进一步的实施方案中,可以组合新近所描述的实施方案。
附图和实施例
现在,将会通过下面的非限制性附图和实施例来进一步解释本发明。
图1显示了通过h5-s-标签和多聚s-蛋白-tp的共表达进行的寡聚体形成的模型。所述s-蛋白-tp的寡聚状态依赖于野生型s-蛋白的寡聚状态,后者是占优势的单体以及较少的二聚体、三聚体等的混合物。野生型s-蛋白与tp的融合引起通过二硫键的额外的连接,从而产生多种s-蛋白。在此作为例子进行描绘的s-蛋白-tp是通过二硫键而形成的同二聚体。
图2显示了在植物提取物中的血凝素衍生物和s-蛋白衍生物的抗-cmyc-标签western印迹的结果,相比于在通过imac进行纯化的寡聚体中的没有his-标签的s-蛋白-tp而言。
图3显示了用于植物原位(inplanta)产生h5-s-标签、h5dk-s-标签变体和egfp-s-标签以及s-蛋白融合蛋白的表达盒。camv35spro:花椰菜花叶病毒35s遍在启动子;camv35sterm:花椰菜花叶病毒35s终止子。
图4显示了植物提取物和灭活病毒rga/天鹅/germany/r65/2006(h5n1)的血细胞凝集滴度。wt:野生型本氏烟草;pbs:磷酸盐缓冲盐水。
图5显示了h5寡聚体和h5-s-标签的大小排阻色谱法级分的血细胞凝集滴度,以及h5寡聚体和h5-s-标签级分的western印迹分析。将经由通过固定化金属亲和色谱法(imac)的蛋白质纯化而纯化的h5寡聚体或h5-s-标签(各63μg,在0.5ml中)在suprosetm6increase10/300gi上分开,并且通过血细胞凝集测定法来分析级分。
图6显示了相比于野生型提取物而言h5寡聚体、h5-s-标签和s-蛋白–tp提取物的免疫学表征:a)通过间接elisa来测量在两次免疫接种后针对经纯化的血凝素的抗体应答,其通过将不同提取物注射入小鼠中而激起。p=p-值。b)测量针对所提及的提取物而激起的血清的血细胞凝集抑制滴度。
图7显示了相比于野生型提取物而言h5寡聚体、h5-s-标签和s-蛋白–tp提取物的免疫学表征:a)通过间接elisa来测量在三次免疫接种后针对经纯化的血凝素的抗体应答,其通过将不同提取物注射入小鼠中而激起。p=p-值。b)测量针对所提及的提取物而激起的血清的血细胞凝集抑制滴度。
图8显示了来自10种分别针对包含h5的提取物(包含h5寡聚体的提取物、包含h5-s-标签的提取物、包含s-蛋白-tp的提取物或wt植物提取物)而激起的血清的混合物的抗体的血凝素(h5)特异性结合,其通过western印迹来证明。
图9显示了免疫原性提取物的稳定性,其通过a)western印迹和b)血细胞凝集滴度来揭示。
图10显示了植物提取物和灭活病毒rga/天鹅/germany/r65/2006(h5n1)的血细胞凝集滴度。wt:野生型本氏烟草;pbs:磷酸盐缓冲盐水。
植物表达载体的构建
将相应于a/鸭/vietnam/tg24-01/2005(h5n1)毒株的血凝素的aa2-564和s-蛋白的aa21-124(uniprotkb登录号:分别为q14rx0和p61823)的dna序列商业合成(genecusteurope,luxembourg),并且提供在被命名为puc57-h5tg和puc57-s-蛋白的puc57载体中。
为了表达野生型s-蛋白,将编码s-蛋白的dna序列在bamhi和noti处克隆到prtra-35s-h5pii中,从而形成被命名为prtra-s-蛋白的重组载体(phan等人,2013)。为了使s-蛋白多聚化,将编码s-蛋白的dna序列引入到prtra载体(其包含三聚化的结构域(gcn4-pii)(参照1)或二聚化的结构域(gcn4野生型)(参照2)(harbury等人,1993),和对于通过其半胱氨酸残基的二硫键形成作出响应的小鼠igm抗体的尾片段)中,从而产生prtra-his-s-蛋白-gcn4pii(参照1)、prtra-his-s-蛋白-gcn4wt(参照2)和prtra-s-蛋白-tp,以分别用于表达s-蛋白-pii(参照1)(seqidno.23)、s-蛋白-gcn4(参照2)(seqidno.24)、s-蛋白-tp(seqidno.25)(图2和表1)。设计侧翼为noti和nhei位点的s-标签编码序列,并且通过所提及的限制位点将其插入到prtra-h5tg-gcnpii中,从而产生prtra-h5tg-gcnpii-s-标签载体,其用于表达三聚化的h5-s-标签(seqidno.26)。
图2显示了在植物提取物中的血凝素衍生物和s-蛋白衍生物的抗-cmyc-标签western印迹的结果,相比于在通过imac进行纯化的寡聚体中的没有his-标签的s-蛋白-tp而言。标准:抗-tnfα-纳米抗体elp,s-蛋白-h5-s-标签共表达,h5寡聚体:s-蛋白-tp-h5-s-标签共表达。可以通过western印迹来显示以所预期的大小的不同组分的表达。潜在中和抗体应答在用h5寡聚体提取物进行免疫接种后相比于用h5-s-标签三聚体提取物进行免疫接种的小鼠的血清而言显著地更好(p<0.001)。
将在所构建出的prtra载体(prtra-s-蛋白、prtra-his-s-蛋白-gcn4wt、prtra-s-蛋白-tp、prtra-h5tg-gcnpii-s-标签)中的五种表达盒(图3)在hindiii限制位点处克隆到穿梭载体pcb310中。将穿梭载体pcb310引入到土壤杆菌agv2206菌株中。
土壤杆菌渗入
用于表达重组蛋白质的土壤杆菌渗入由phan和conrad(phan和conrad,2016)作了详细描述,并且简短描述在本文中。在28℃和140rpm下在具有50μg/ml卡那霉素、50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml利福平的溶源肉汤(lysogenybroth;lb)培养基中分开地过夜预培养带有用于表达重组蛋白质的穿梭载体(参见图2)和用于表达hcpro(它是基因沉默的阻抑物,其已被发现显著地增强植物细胞中重组蛋白质的表达水平(conley等人,2009;sudarshana等人,2006))的植物载体的土壤杆菌。将预培养物添加至40ml的新的lb培养基。在进一步的24小时的培养后,通过在4℃下以4000g离心10分钟来收获细菌,并且将其重悬浮在渗入缓冲液(10mm2-(n-吗啉基)乙磺酸(mes),10mmmgso4,ph5.6)中。将带有用于表达重组蛋白质的穿梭载体和用于表达hcpro的植物载体的土壤杆菌合并,并且在渗入缓冲液中稀释至1.0的最终光密度(od),其是在600nm的波长下测量的。通过将每株植物完全浸没在立在干燥器里面的包含土壤杆菌的杯子中来对本氏烟草植物(六至八周龄)进行渗入。施加真空2分钟,然后快速释放。然后,将植物放置在处于21℃、每天16小时光照的温室中。在渗入后五天,收获叶样品并贮存于-80℃。
通过固定化金属亲和色谱法(imac)来进行蛋白质纯化
在真空土壤杆菌渗入后五天,收获叶样品,在液氮中冷冻,并且使用商业搅切器进行匀浆。将总蛋白质提取在50mmtris缓冲液(ph8.0)中。将提取物通过离心(18,000g,30分钟,4℃)进行澄清,然后通过纸滤器进行过滤。将经澄清的提取物与之前用水洗涤过两次的镍-氨三乙酸(ni-nta)树脂琼脂糖相混合。在4℃下混合30分钟后,将混合物施加至色谱柱。在此之后,将柱彻底进行洗涤(50mmnah2po4,300mmnacl,30mm咪唑,ph8.0)。然后,将重组蛋白质通过洗脱缓冲液(50mmnah2po4,300mmnacl,125mm咪唑,ph8.0)从柱上洗脱下,装填入透析袋中,用聚乙二醇(peg)6000进行浓缩,并且逆pbs进行透析。
通过使用雪花莲(galanthusnivalis)(gln)-连接的琼脂糖来纯化h5寡聚体
将经冷冻的叶样品(40g)在液氮中进行匀浆。将总蛋白质提取在pbs缓冲液(137mmnacl,2.7mmkcl,10mmna2hpo4,1.8mmkh2po4,ph7.5)中。将提取物离心两次(23,000rpm,30分钟,4℃),并且与10ml的先前用水洗涤过两次和用pbs缓冲液洗涤过一次的gln树脂相混合。在4℃下混合30分钟后,将混合物施加至色谱柱。在此之后,将柱用30mlpbs缓冲液洗涤两次。然后,用10ml洗脱缓冲液(137mmnacl,2.7mmkcl,10mmna2hpo4,1.8mmkh2po4,200mmα-甲基甘露糖苷,ph7.4)从柱上洗脱下重组蛋白质。将蛋白质溶液在4℃下逆pbs透析过夜,并且通过使用聚乙二醇(peg)6000来进行浓缩。
大小排阻色谱法(sec)
将经纯化的h5寡聚体和h5-s-标签的在0.5ml中的34μg蛋白质分别加载到superosetm6increase10/300gl柱(gehealthcare)上。高分子量试剂盒包含分子量在44kda至2000kda的范围内的的标准蛋白质,其被加载到柱上以估计目的蛋白质的分子量。收集500μl/级分以用于血细胞凝集测试和western印迹分析。
对于elisa测试,以在0.5ml中的1.25mg蛋白质的起始浓度,通过柱子进一步纯化作为抗原的经亲和纯化的三聚血凝素。
sds-page和western印迹法
通过还原sds-page(10%聚丙烯酰胺)来分开提取出的植物蛋白质,10ng的经imac和sec纯化的血凝素或抗-tnfα-纳米抗体-elp标准蛋白质(conrad等人,2011),然后将其电转移至硝酸纤维素膜。western印迹法程序按照phan和conrad(phan和conrad,2016)来进行。遵循由gahrtz和conrad(gahrtz和conrad,2009)所描述的实验方案,使用单克隆抗-c-myc抗体来进行western印迹法程序。使用绵羊抗小鼠igg,连接有辣根过氧化物酶的全抗体,作为二抗(二抗,gehealthcareuklimitedlittlechalfontbuckinghamshirehp79nauk),随后为基于增强化学发光的检测(ecl)。为了检测h5-特异性小鼠抗体,将十份来自每个组的小鼠血清相混合并且将膜与各自混合物一起进行温育。
小鼠免疫接种
通过western印迹法来半定量在植物提取物中的血凝素含量(h5寡聚体和h5-s-标签)。选择包含100ng的h5寡聚体或h5-s-标签的植物提取物用于进行小鼠免疫接种。在对照组中,使用包含s-蛋白-tp的植物提取物和未转化的植物提取物,其具有与包含h5寡聚体和h5-s-标签的植物提取物相同量的总可溶性蛋白质。将所有植物提取物以20%最终浓度与
血细胞凝集测试和血细胞凝集抑制测定法
血细胞凝集测试基于标准实验方案(世界动物卫生组织(worldorganizationforanimalhealth)(oie)(2004),并且详细描述在phan和conrad(phan和conrad,2016)中)。将诱导完全血细胞凝集的稀释度定义为一个血细胞凝集单位(hau)。血细胞凝集抑制(hi)测定法类似地基于标准程序(世界动物卫生组织(oie)(2004))来进行。将25μl等份试样的单种小鼠血清放置在包含25μlpbs的微量滴定板的第一个孔中,并且跨越过一排8个孔进行两倍系列稀释。将包含4hau的灭活rga/天鹅/germany/r65/2006(h5n1)病毒的25μl体积添加至反应体系,并且在25℃下保持30分钟。然后,添加25μl的1%鸡红细胞,并且将平板在25℃下温育30分钟。将hi滴度呈现为可以完全抑制血细胞凝集的最高血清稀释度的倒数。
图4和表1显示了植物提取物和灭活病毒rga/天鹅/germany/r65/2006(h5n1)的血细胞凝集滴度。由共表达的蛋白质所引起的血细胞凝集滴度是非常低的,而这两种蛋白质都在er中积累,这表明了野生型s-蛋白的不充分的多聚化。
图5显示了h5寡聚体和h5-s-标签的大小排阻色谱法级分的血细胞凝集滴度,以及h5寡聚体和h5-s-标签级分的western印迹分析。将h5-s-标签和h5寡聚体通过imac进行纯化。将经纯化的产物通过western印迹进行分析。h5-s-标签和s-蛋白-tp(没有his-标签)两者均被检测到,这表明s-蛋白-tp与s-标签特异性地相互作用。将经纯化的h5寡聚体和h5-s-标签通过sec进一步分开,并且估计每个级分的血细胞凝集滴度。在h5寡聚体的级分a3至a8中观察到高的血细胞凝集滴度。最高分子量(级分a3,大约2,000kda)相应于最高血细胞凝集滴度。通过sec的h5-s-标签的分析没有显示出高分子量和高血细胞凝集滴度。将h5-s-标签和h5寡聚体的级分通过sds-page来分开,并且通过western印迹平行地进行分析。在共表达h5-s-标签和s-蛋白-tp后,仅在h5寡聚体提取物中实现了高分子量血凝素(700kda至2,000kda,级分a3至a7)。
间接酶联免疫吸附测定法(elisa)
将微量滴定板(immunoplatemaxisorp,nalgennuncinternational,roskilde,denmark)用100μl的在噬菌体pbs(100mmnacl,32mmna2hpo4,17mmna2hpo4,ph7.2)中的0.5μg/ml的经固定化金属亲和色谱法(imac)和大小排阻色谱法(sec)纯化的血凝素(h5)三聚体进行包被,并且在室温下温育过夜。在用3%(w/v)牛血清白蛋白(bsa)、0.05%(v/v)在pbs中的tween20(pbst)封闭2小时后,施加100μl的特别稀释物(6·10-4)并在室温下温育1小时。将平板用pbst洗涤5次,与在1%(w/v)bsa中稀释(2000倍)的兔抗小鼠igg碱性磷酸酶缀合物一起进行温育,并且再次洗涤。添加酶促底物,在0.1m二乙醇胺-hcl(ph9.8)中的磷酸对硝基苯酯(pnpp),并且在37℃下温育1小时后在405nm下测量吸收信号。
图6a和图7a显示了通过间接elisa来测量在分别两次或三次免疫接种后针对经纯化的血凝素的抗体应答,其通过将不同提取物注射入小鼠中而激起。针对经纯化的h5的所测试的特异性免疫应答也通过用h5寡聚体提取物和h5-s-标签提取物进行免疫接种而激起。在对照中,在用s-蛋白-tp和用野生型提取物进行免疫接种后几乎没有检测到针对h5的免疫应答。在用h5寡聚体粗提取物进行免疫接种后,针对经纯化的h5的所测试的体液免疫应答显著地更好(p=0.044或0.008,分别地)。血细胞凝集抑制(hi)测定法显示,通过用h5寡聚体提取物和用h5-s-标签提取物进行免疫接种可以在小鼠中产生抑制血细胞凝集的潜在地中和抗体(图6b和图7b)。
图8显示了来自10种分别针对包含h5的提取物(包含h5寡聚体的提取物、包含h5-s-标签的提取物、包含s-蛋白-tp的提取物或wt植物提取物)而激起的血清的混合物的抗体的血凝素(h5)特异性结合,其通过western印迹来证明。针对h5寡聚体而激起的小鼠血清以及针对与经纯化的血凝素相结合的h5-s-标签而激起的血清,而非来自用h5寡聚体提取物进行免疫接种的小鼠的血清,显示出了更强的反应。
稳定性测试
将免疫原性提取物贮存于4℃一周,没有抗原含量的损失,如通过western印迹(图9a)和血细胞凝集滴度(图9b)所揭示的。
统计学分析
血细胞凝集抑制测定法数据和elisa结果的统计学分析通过使用来自sigmaplot软件的mann-whitney秩和检验来进行。将小于0.05的p值定义为显著差异。
应用于来自新的dkht2-2014毒株的新的血凝素
为了验证我们的用于通过s-标签和s-蛋白相互作用来产生寡聚体的方法,将来自目前在越南传播的新的dkht2-2014毒株的血凝素(命名为h5dk,seqidno.36)和增强型绿色荧光蛋白(egfp,seqidno.37)与s-标签相融合。将蛋白质产物分别命名为h5dk-s-标签、egfp-s-标签。用于植物原位产生的表达盒呈现在图3中。通过共表达h5dk-s-标签和s-蛋白-tp而形成的寡聚体被命名为h5dk寡聚体,并且显示出相比于h5dk而言非常高的血细胞凝集滴度(图10)。进一步的分析(大小排阻色谱法、小鼠免疫接种……)目前正在进行。
新的血凝素(h5dk,seqidno.36)与a/鸭/vietnam/tg24-01/2005(h5n1)毒株(seqidno.35)的推断的血凝素氨基酸序列相似性为93%。
所引用的非专利文献
r.j.cox,k.a.brokstad,p.ogra(2004)influenzavirus:immunityandvaccinationstrategies.comparisonoftheimmuneresponsetoinactivatedandlive,attenuatedinfluenzavaccines.scand.j.immunol.59,1-15.
h.l.yen,r.g.webster(2009)in:r.w.compans,w.a.orenstein(eds.):vaccinesforpandemicinfluenza,vol.333,3-24.
e.topp,r.irwin,t.mcallister,m.lessard,j.j.joensuu,i.kolotilin,u.conrad,e.
n.landry,b.j.ward,s.trépanier,e.montomoli,m.dargis,g.lapini,l.-p.vézina(2010)preclinicalandclinicaldevelopmentofplant-madevirus-likeparticlevaccineagainstavianh5n1influenza.plosone5,e15559.
m.-a.d'aoust,p.-o.lavoie,m.m.-j.couture,s.trépanier,j.-m.guay,m.dargis,s.mongrand,n.landry,b.j.ward,l.-p.vézina(2008)influenzavirus-likeparticlesproducedbytransientexpressioninnicotianabenthamianainduceaprotectiveimmuneresponseagainstalethalviralchallengeinmice.plantbiotechnol.j.6(9),930-940.
h.t.phan等人(2013)elpylatedhaemagglutininsproducedintobaccoplantsinducepotentiallyneutralizingantibodiesagainsth5n1virusesinmice.plantbiotechnol.j.11,582-593.
p.harbury,t.zhang,p.kim,t.alber(1993)aswitchbetweentwo-,three-,andfour-strandedcoiledcoilsingcn4leucinezippermutants.science262,1401–1407.
d.m.czajkowsky,j.hu,z.shao,r.j.pleass(2012)fc-fusionproteins:newdevelopmentsandfutureperspectives.embomol.med.4,1015-1028.
s.loureiro,j.ren,p.phapugrangkul,c.a.colaco,c.r.bailey,h.shelton,e.molesti,n.j.temperton,w.s.barclay,i.m.jone(2011)adjuvant-freeimmunizationwithhemagglutinin-fcfusionproteinsasanapproachtoinfluenzavaccines.journalofvirology85,3010-3014.
t.asai,l.a.wims,s.l.morrison(2005)aninteractionbetweens-taganss-proteinderivedfromhumanribonuclease1allowssite-specificconjugationofanenzymetoanantibodyfortargeteddrugdelivery.j.immunol.methods299,63-76.
c.-j.wei,l.xu,w.-p.kong,w.shi,k.canis,j.stevens,z.-y.yang,a.dell,s.m.haslam,i.a.wilson,g.j.nabel(2008)comparativeefficacyofneutralizingantibodieselicitedbyrecombinanthemagglutininproteinsfromavianh5n1influenzavirus.journalofvirology82,6200-6208.
u.fiedler,u.conrad(1995)high-levelproductionandlong-termstorageofengineeredantibodiesintransgenictobaccoseeds.biotechnology13,1090-1093.
m.e.fraser,m.m.chernaia,y.v.kozlov,m.n.g.james(1994)crystalstructureoftheholotoxinofromshigelladysenteriaeat
m.e.fraser,m.fujinaga,m.m.cherney,a.r.melton-celsa,e.m.twiddy,a.d.o'brien,m.n.james(2004)structureofshigatoxintype2(stx2)fromescherichiacolio157:h7.j.biol.chem.279,27511-7.
d.l.harris,r.d.glock(1972)swinedysentery.j.am.vet.med.assoc.160,561-565.
j.zimmermann,i.saalbach,d.jahn,m.giersberg,s.haehnel,j.wedel,j.macek,k.zoufal,g.glünder,d.falkenburg,s.m.kiprijanov(2009)antibodyexpressingpeaseedsasfodderforpreventionofgastrointestinalparasiticinfectionsinchickens.bmcbiotechnol.9,79.
v.virdi,a.coddens,s.debuck,s.millet,b.m.goddeeris,e.cox,h.degreve,a.depicker(2013)orallyfedseedsproducingdesignerigasprotectweanedpigletsagainstenterotoxigenicescherichiacoliinfection.pnas110,11809-11814.
g.habicht,c.haupt,r.p.friedrich,p.hortschansky,c.sachse,j.meinhardt,k.wieligmann,g.p.gellermann,m.brodhun,j.
a.j.conley,j.j.joensuu,a.m.jevnikar,r.menassa,j.e.brandle(2009)optimizationofelastin-likepolypeptidefusionsforexpressionandpurificationofrecombinantproteinsinplants.biotechnol.bioeng.103,562-573.
m.r.sudarshana,m.a.plesha,s.l.uratsu,b.w.falk,a.m.dandekar,t.-k.huang,k.a.mcdonald(2006)achemicallyinduciblecucumbermosaicvirusampliconsystemforexpressionofheterologousproteinsinplanttissues.plantbiotechnol.j.4,551-559.
h.t.phan,u.conrad(2016)plant-basedvaccineantigenproduction.methodsandprotocols.in:vaccinetechnologiesforveterinaryviraldiseases.springernewyork,newyork,ny,35-47.
u.conrad,i.plagmann,s.malchow,m.sack,d.m.floss,a.a.kruglov,s.a.nedospasov,s.rose-john,j.scheller(2011)elpylatedanti-humantnftherapeuticsingle-domainantibodiesforpreventionoflethalsepticshock.plantbiotechnol.j.9,22-31.
m.gahrtz,u.conrad(2009)immunomodulationofplantfunctionbyinvitroselectedsingle-chainfvintrabodies.in:l.faye,v.gomord(eds.):recombinantproteinsfromplants:methodsandprotocols.(series:methodsinmolecularbiology,vol.483)totowa,nj:humanapress289-312.
worldorganizationforanimalhealth(oie)(2004)highlypathogenicavianinfluenza,inmanualofdiagnostictestsandvaccinesforterrestrialanimals(mammals,birds,andbees).paris:worldorganizationforanimalhealth(oie),259-269.
序列表
<110>leibniz-institutfuerpflanzengenetikund
kulturpflanzenforschung(ipk)
<120>通过s-标签-s-蛋白融合物的来自植物的寡聚体疫苗
<130>10417p0035epwo
<150>ep16206231.9
<151>2016-12-22
<160>37
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>506
<212>prt
<213>禽流感病毒
<400>1
aspglnilecysileglytyrhisalaasnasnserthrgluglnval
151015
aspthrilemetglulysasnvalthrvalthrhisalaglnaspile
202530
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<211>15
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<213>智人(homosapiens)
<400>2
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151015
<210>3
<211>15
<212>prt
<213>家牛(bostaurus)
<400>3
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151015
<210>4
<211>15
<212>prt
<213>家绵羊(ovisaries)
<400>4
lysgluseralaalaalalysphegluargglnhismetaspser
151015
<210>5
<211>15
<212>prt
<213>家山羊(caprahircus)
<400>5
lysgluseralaalaalalysphegluargglnhismetaspser
151015
<210>6
<211>15
<212>prt
<213>野猪(susscrofa)
<400>6
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151015
<210>7
<211>15
<212>prt
<213>家马(equuscaballus)
<400>7
lysgluserproalametlysphegluargglnhismetaspser
151015
<210>8
<211>15
<212>prt
<213>狍(capreoluscapreolus)
<400>8
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151015
<210>9
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151015
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alacyslysasnglyglnthrasncystyrglnsertyrserthrmet
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serilethraspcysarggluthrglyserserlystyrproasncys
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alatyrlysthrthrglnalaasnlyshisileilevalalacysglu
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glyasnprotyrvalprovalhispheaspalaserval
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<211>109
<212>prt
<213>家绵羊
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serthrserseralaserserserasntyrcysasnglnmetmetlys
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serargasnleuthrglnaspargcyslysprovalasnthrpheval
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hisgluserleualaaspvalglnalavalcysserglnlysasnval
354045
alacyslysasnglyglnthrasncystyrglnsertyrserthrmet
505560
serilethraspcysarggluthrglyserserlystyrproasncys
65707580
alatyrlysthrthrglnalaglulyshisileilevalalacysglu
859095
glyasnprotyrvalprovalhispheaspalaserval
100105
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<211>109
<212>prt
<213>家山羊
<400>12
serthrserseralaserserserasntyrcysasnglnmetmetlys
151015
serargasnleuthrglnaspargcyslysprovalasnthrpheval
202530
hisgluserleualaaspvalglnalavalcysserglnlysasnval
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alacyslysasnglyglnthrasncystyrglnsertyrserthrmet
505560
serilethraspcysarggluthrglyserserlystyrproasncys
65707580
alatyrlysthrthrglnalaglulyshisileilevalalacysglu
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glyasnprotyrvalprovalhispheaspalaserval
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<212>prt
<213>野猪
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aspserserserserasnserserasntyrcysasnleumetmetser
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argargasnmetthrglnglyargcyslysprovalasnthrpheval
202530
hisgluserleualaaspvalglnalavalcysserglnileasnval
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asncyslysasnglyglnthrasncystyrglnserasnserthrmet
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hisilethraspcysargglnthrglyserserlystyrproasncys
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alatyrlysalaserglngluglnlyshisileilevalalacysglu
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glyasnproprovalprovalhispheaspalaserval
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<212>prt
<213>家马
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glyserthrserserserasnprothrtyrcysasnglnmetmetlys
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202530
hisgluproleualaaspvalglnalailecysleuglnlysasnile
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alatyrglnthrserglnlysgluarghisileilevalalacysglu
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glyasnprotyrvalprovalhispheaspalaservalgluvalser
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thr
<210>15
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<212>prt
<213>狍
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serproserseralaserserserasntyrcysasnglnmetmetgln
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serargasnleuthrglnaspargcyslysprovalasnthrpheval
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hisgluserleualaaspvalglnalavalcyspheglnlysasnval
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ilecyslysasnglyglnserasncystyrglnserasnseralamet
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hisilethraspcysarggluserglyasnserlystyrproasncys
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valtyrlysthrthrglnalaglulyshisileilevalalacysglu
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glyasnprotyrvalprovalhispheaspalaserval
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<212>prt
<213>智人
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lysprothrleutyrasnvalserleuvalmetseraspthralagly
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thrcystyr
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<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
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lysprothrleutyrasnvalserleuilemetseraspthrglygly
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thrcystyr
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<212>prt
<213>大猩猩(gorillagorilla)
<400>18
lysprothrleutyrasnvalserleuvalmetseraspthralagly
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thrcystyr
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<212>prt
<213>普通猕猴(macacamulatta)
<400>19
lysprothrleutyrasnvalserleuvalmetseraspthralagly
151015
thrcystyr
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<213>家犬(canisfamiliaris)
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glxcystyr
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<213>大熊猫(ailuropodamelanoleuca)
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lysprothrleutyrasnvalserleuvalleuseraspthralaser
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thrcystyr
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<212>prt
<213>穴兔(oryctolaguscuniculus)
<400>22
lysprothrleutyrasnvalserleuilemetseraspthralaser
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thrcystyr
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<213>人工序列
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glyserhishishishishishisglyserserserserasntyrcys
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202530
valasnthrphevalhisgluserleualaaspvalglnalavalcys
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serglnlysasnvalalacyslysasnglyglnthrasncystyrgln
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sertyrserthrmetserilethraspcysarggluthrglyserser
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lystyrproasncysalatyrlysthrthrglnalaasnlyshisile
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ileleuserlysiletyrhisilegluasngluilealaargilelys
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<213>人工序列
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serhishishishishishisglyserserserserasntyrcysasn
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glnmetmetlysserargasnleuthrlysaspargcyslysproval
202530
asnthrphevalhisgluserleualaaspvalglnalavalcysser
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glnlysasnvalalacyslysasnglyglnthrasncystyrglnser
505560
tyrserthrmetserilethraspcysarggluthrglyserserlys
65707580
tyrproasncysalatyrlysthrthrglnalaasnlyshisileile
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valalacysgluglyasnprotyrvalprovalhispheaspalaser
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valalaserglyglyglyserglyglyglyserglyglyglyserarg
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metlysglnleugluasplysvalglugluleuleuserlysasntyr
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hisleugluasngluvalalaargleulyslysleuvalalaalaala
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leu
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<213>人工序列
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glyserserserserasntyrcysasnglnmetmetlysserargasn
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leuthrlysaspargcyslysprovalasnthrphevalhisgluser
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leualaaspvalglnalavalcysserglnlysasnvalalacyslys
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tyrvalprovalhispheaspalaservalalaserlysprothrleu
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tyrasnvalserleuilemetseraspthrglyglythrcystyrala
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glnvalaspthrilemetglulysasnvalthrvalthrhisalagln
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vallysproleuileleuargaspcysservalalaglytrpleuleu
505560
glyasnprometcysaspglupheileasnvalproglutrpsertyr
65707580
ilevalglulysalaasnprovalasnaspleucystyrproglyasp
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phepheargasnvalvaltrpleuilelyslysasnserthrtyrpro
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thrilelysargsertyrasnasnthrasnglngluaspleuleuval
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leutrpglyilehishisproasnaspalaalagluglnthrlysleu
180185190
tyrglnasnprothrthrtyrileservalglythrserthrleuasn
195200205
glnargleuvalproargilealathrargserlysvalasnglygln
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serglyargmetgluphephetrpthrileleulysproasnaspala
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ileasnphegluserasnglyasnpheilealaproglutyralatyr
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lysilevallyslysglyaspserthrilemetlyssergluleuglu
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tyrglyasncysasnthrlyscysglnthrprometglyalaileasn
275280285
sersermetprophehisasnilehisproleuthrileglyglucys
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prolystyrvallysserasnargleuvalleualathrglyleuarg
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asnserproglnarggluargargglyleupheglyalailealagly
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pheilegluglyglytrpglnglymetvalaspglytrptyrglytyr
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hishisserasngluglnglyserglytyralaalaasplysgluser
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leugluargargilegluasnleuasnlyslysmetgluaspglyphe
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leuaspvaltrpthrtyrasnalagluleuleuvalleumetgluasn
420425430
gluargthrleuaspphehisaspserasnvallysasnleutyrasp
435440445
lysvalargleuglnleuargaspasnalalysgluleuglyasngly
450455460
cysphegluphetyrhislyscysaspasnglucysmetgluserval
465470475480
argasnglythrtyrasptyrproglntyrsergluglualalysleu
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lysargglugluileserglyvallysleugluglyprolysargmet
500505510
lysglnilegluasplysileglugluileleuserlysiletyrhis
515520525
ilegluasngluilealaargilelyslysleuileglygluarggly
530535540
glyglyglyseralaserlysgluthralaalaalalysphegluarg
545550555560
glnhismetaspseralaalaalahishishishishishisleuala
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alagluglnlysleuileserglugluaspleuasnglyserlysasp
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gluleu
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<212>prt
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argmetlysglnilegluasplysileglugluileleuserlysile
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202530
arg
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<213>人工序列
<220>
<223>pcb301_h5-s-标签
<400>28
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cccccccttctcgaaccctcccggcccgctctcgagttggcagcatcacccataattgtg660
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thrcystyr
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thrcystyr
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