Gαs蛋白或下游激动剂FSK在用于制备控制血管完整性和通透性药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了Gαs蛋白或下游激动剂FSK在制备控制血管完整性和通透性的药物组合物中的潜在应用。Gαs蛋白传递S1PR1信号来稳定内皮连接处的VE-钙粘素从而控制血管的完整性和通透性。本发明公开了控制血管完整性和通透性的Gαs下游激动剂，激动剂可以与抑制血管生长抗癌药物联合用药，原则上可以增强血管抑制药抑制血管的功能；其控制血管通透性的特性可以用于抑制过敏或炎症引起的血管通透性增加，降低炎症反应，减弱炎性对组织的损失。
【专利说明】G a s蛋白或下游激动剂FSK在用于制备控制血管完整性和 通透性药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学【技术领域】，尤其涉及G a s蛋白或下游激动剂FSK在制备治疗 血管内皮细胞完整性药物组合物中的应用。
【背景技术】
[0002] G蛋白是细胞内信号传导途径中起着重要作用的GTP结合蛋白，由α，β，Υ三个 不同亚基组成。激素与激素受体结合诱导GTP跟G蛋白结合的GDP进行交换，结果激活位 于信号传导途径中下游的腺苷酸环化酶。G蛋白将细胞外的第一信使肾上腺素等激素和细 胞内的腺苷酸环化酶催化生成的第二信使cAMP联系起来。
[0003] 近年来，学术界普遍认为，血管内皮是具有不同功能的"广泛分布的器官"（面积约 为10m 2)。提出血管内皮是人体最大的内分泌腺体，广泛分布于全身各处，几乎所有组织都 受其调节和影响。而血管内皮细胞是机体中唯一直接与血流接触的细胞，是血管壁组织和 血液之间的第一道通透性屏障，且携有不同激素和血管活性物质的受体，故能积极参与大 分子和血管内血细胞成分、平滑肌和血管壁细胞外物质问的复杂反应，具有合成代谢、分泌 功能，并涉及免疫、炎症和组织修复过程，也参与保持机体内环境的稳定，在许多生理、病理 过程中发挥着重要作用。
[0004] 血管内皮细胞结构的完整性被破坏，已被视为创伤、感染、休克、肿瘤、心血管疾病 和急性肺损伤等多种疾病和综合征发生发展的病理基础。
[0005] 血管内皮细胞能合成并释放多种舒张因子和收缩因子，这些因子与神经递质以及 血液循环中的其它活性物质共同作用，调控血管平滑肌细胞的舒张与收缩，以维持正常的 血管紧张度，调节各组织、器官的血流量，从而保证各种组织器官的正常功能。
[0006] 已经确定血管内皮具有多种调节功能，包括通过保持非粘连、抗血栓形成表面而 调节血管紧张度、炎症和内稳态。内皮细胞的黏着连接，是一个连接相邻内皮细胞的动态结 构，在机体发育成长过程中，这个结构需要精细的协调以达到合理的抑制血管生成和获得 血管稳定性。已经证实许多粘附分子参与了内皮粘附连接的形成。其中，关键的分子之一 是血管内皮细胞VE-钙粘素，它在内皮细胞中特定的表达，对于内皮的动态黏着连接装配 非常重要。
[0007] 在发育过程中，端细胞用VE-钙粘素连接其他细胞形成同型的粘附从而创建一个 成功的融合并阻止丝状伪足的形成，然而缺乏VE-钙粘素的内皮细胞尖端仍然可以形成融 合但是不会阻止形成丝状伪足。因此，缺乏VE-钙粘素的细胞感觉不到细胞与细胞间的接 触抑制，并且保持寻找其他连接。此外，部分VE-钙粘素的缺失也会强烈的破坏血管的稳定 性。众多遗传学研究显示，内皮细胞中VE-钙粘素的动力控制对于保持适当的血管稳定性 和渗透性具有重要作用。在小鼠胚胎9. 5-10. 5天敲除VE-钙粘素会引起胚胎死亡，这是由 于严重的血管重建缺陷。进一步研究显示VE-钙粘素和β-连环素的联合，对于内皮通透 性的细胞控制有重要作用。此外，通过使用抗体使成年小鼠中VE-粘附素功能的封闭，导致 渗透性上显著增加和引起严重的出血。除了在小鼠中有这些发现，在斑马鱼的研究同样揭 示了 VE-钙粘素控制血管的完整性的这个保守的角色。
[0008] 最近的研究成果显示，整体的和内皮细胞特异性的SlPRl敲除会导致覆盖背主动 脉和其他血管的壁细胞的缺陷，造成妊娠期E12. 5 - E14. 5严重的出血和胚胎死亡。然而， 血管平滑肌细胞中SlPRl特异性的敲除，并没有出现相似的血管损伤和胚胎死亡。这些数 据说明内皮细胞SlPRl信号间接控制新生血管的壁细胞。此外，最近的进一步研究显示，在 早期胚胎阶段大概El 1. 5时，切断SlPRl信号不会影响血管壁细胞，而是通过破坏VE-钙粘 素来损坏内皮细胞之间的粘附连接，这暗示了在内皮细胞中SlPRl直接的维持血管的稳定 性，SlPRl敲除小鼠在胚胎发育的后期阶段缺乏壁细胞可能是次要结果。这些发现与先前 的Rho-和Rac-依据的以SlPRl功能为特征培养的内皮细胞VE-钙粘素的聚集是一致的。 因此，VE-钙粘素很有可能是SlPRl信号的效应器来控制血管的稳定性和渗透性。
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的第一方面的技术问题是提供Ga s蛋白在用于制备抗肿瘤药物中 的新用途。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案为，G a s蛋白，下游激动剂FSK或G a s蛋 白和下游激动剂FSK在用于制备控制血管完整性和通透性药物中的应用。
[0011] 优选地，G a S蛋白，下游激动剂FSK或G a S蛋白和下游激动剂FSK在制备维持正 常血管内皮细胞完整性的药物组合物中的应用。
[0012] 优选地，Ga S蛋白，下游激动剂FSK或Ga S蛋白和下游激动剂FSK在制备阻断肿 瘤新生血管生长的药物组合物中的应用。
[0013] 优选地，Ga S蛋白，下游激动剂FSK或Ga S蛋白和下游激动剂FSK在制备过敏引 起的血管炎症的药物组合物中的应用。
[0014] 优选地，所述的血管包括动脉、静脉和毛细血管。
[0015] 优选地，Ga s蛋白，下游激动剂FSK传递SlPRl信号来稳定内皮连接处的VE-钙 粘素从而控制血管内皮细胞的完整性。
[0016] 优选地，所述Ga s蛋白，下游激动剂FSK通过预防或治疗转移或抑制血管生成以 阻断肿瘤新生血管生长。
[0017] 优选地，所述药物组合物包含惰性、无毒、药理学合适的赋形剂。
[0018] 优选地，所述药物组合物为针剂、片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、冻干物、颗粒剂或软膏 剂。
[0019] 本发明的第二方面，提供一种治疗血管内皮细胞完整性药物组合物，其含有有效 组份的G a S蛋白，下游激动剂FSK或G a S蛋白和下游激动剂FSK。
[0020] 优选地，所述的药物组合物中G a s蛋白，下游激动剂FSK或G a s蛋白和下游激动 剂FSK占组合物重量百分比0. 1 % -90 %。
[0021] 优选地，其还包括一种或多种惰性、无毒、药理学合适的赋形剂。
[0022] 优选地，所述药物组合物为针剂、片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、冻干物、颗粒剂或软膏 剂。
[0023] 优选地，所述赋形剂为载体、溶剂、乳化剂、分散剂、湿润剂、粘合剂、稳定剂、着色 剂、香料。
[0024] 根据本发明的药物组合物可以全身和/或局部地起作用，为此，可以以合适的方 式，例如通过皮下、口、肠胃夕卜、肺或者鼻的途径服用，根据本发明的组合物可以适合于这些 给药途径的服用形式服用。
[0025] 本发明中，异源三聚体的G蛋白中的α亚基Gas蛋白，通常与GP、GY形成三 聚体，与G蛋白偶联受体偶联（GPCR)，外界因子与GPCR结合，激活三聚体，释放Gas和Gi3、 GY，Gas激活下游的腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase),产生cAMP，cAMP作为第二信使，调 节机体多种信号途径，其中之一是调节血管内皮细胞黏联，从而控制血管的通透性和完整 性。
[0026] 适于口服的是根据现有技术水平起作用和迅速地和/或以改进方式释放本发明 的药物组合物的给药形式，并且包含以结晶和/或无定形的和/或溶解形式，例如片剂（无 涂层或有涂层的片剂，其例如具有抵制胃液或者延迟溶解或不溶解的涂层，根据本发明的 组合物释放），在口中迅速破碎的片剂，或膜片，膜/冻干物，胶囊（例如硬或软胶囊），糖衣 片，颗粒，小丸，粉末，乳剂，悬浮液，烟雾剂或者溶液的根据本发明的药物组合物。
[0027] 肠胃外投药可以避免吸收步骤（例如静脉内，动脉内，心内，脊柱内或者腰内或者 关节内）或者同时包括吸收（例如肌肉内，皮下，皮内，经皮或者腹膜内）进行。适合于肠 胃外投药法的合适的服用形式特别地是用于注射和注入以溶液，悬浮液，乳剂，冻干物或者 无菌粉末形式的制剂。
[0028] 适合于另一个给药途径的是例如用于吸入的药物形式，例如粉末吸入七或者雾化 器，或者可以鼻服用的药物形式，录入滴剂，溶液或者喷雾剂。
[0029] 根据本发明的药物组合物可以转化为所述的服用形式。这可以以本身已知的方式 通过与惰性的、无毒的、药理学合适的赋形剂混合进行。这些赋形剂特别地包括载体（例如 微晶纤维素、乳糖、甘露糖醇，淀粉），溶剂（例如液体聚乙二醇），乳化剂和分散剂或者湿润 剂（例如十二烷基硫酸钠，油酸聚氧失水山梨糖醇酯，丙二醇），粘合剂（例如聚乙烯吡咯 烷酮），合成和天然聚合物（例如白蛋白），稳定剂（例如抗氧化剂，如抗坏血酸），着色剂 (例如无机颜料，如铁氧化物）和掩盖性香料和气味。制备上述制剂时，可使用常规的制剂 技术。
[0030] 根据本发明的药物组合物，优选是在临床根治切除手术后24小时至1个月内进行 给药，防止肿瘤细胞复发和转移。此外，临床医师在对病人进行手术、放化疗的同时，也优选 本发明的结合药物组合物进行联合治疗，降低肿瘤复发和转移的几率。
[0031] 本发明中，作为抗肿瘤的对象疾病只要是治疗上需要抗肿瘤作用的疾病即可，没 有特别限定，例如对于所有的恶性肿瘤，例如胃癌、大肠癌、食道癌、皮肤癌、子宫癌、前列腺 癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌等。并且象白血病这样的造血器官的恶性肿瘤也可以作为本发明 的抗肿瘤药物的对象疾病。
[0032] 本发明中，"血管完整性"是指血管内皮细胞的黏附连接的稳定和血管的渗透性正 堂 巾。
[0033] 本发明中，"血管内皮细胞"或"血管内皮"或"内皮细胞"是指这样的细胞，包括薄 的扁平细胞层，该细胞内衬在血管的内表面，在管腔中的循环血液和血管壁之间形成的界 面。
[0034] 本发明中，"血管"包括动脉、静脉和毛细血管；包括分布在身体体表和体内的各种 器官、组织的动脉、静脉和毛细血管。
[0035] 本发明中，有效量是指将Ga s蛋白或其有效成分給予受试体时，与未給予该有效 成分的受试体相比，产生抗肿瘤作用或/和血管生成抑制作用的该成分的量。具体给药量 可以根据给药方式、病人的年龄体重、病情严重程度以及其它相关的因素而改变，对于成人 来说每天I-IOOOmg比较合适，可以采用口服，皮下注射方式，优选为皮下注射方式。
[0036] Ga s蛋白下游激动剂Forsklin(简称FSK)可为普通市售得到（Sigma公司）。
[0037] Ga s蛋白基因序列,Genbank收录号Gene ID:2778。Ga s蛋白可通过现有技术的 转录真核或原核细胞表达得到，由于基因的合成、转录和表达技术都是常规的本领域技术 人员惯用的公知技术，在此就不再赘述。
[0038] 体外研究显示，G蛋白的一个亚型Gi，也与SlPRl有关。然而，还没有证据证实Gi 是SlPRl信号调节VE-钙粘素黏着连接的形成过程的下游的中介。本发明证实了 G a s在 SlPRl的下游通过稳定VE-钙粘素的黏着连接来控制血管完整性。Tie2-Cre驱使小鼠内皮 细胞G a s缺失，在E11. 5引起大出血和胚胎死亡，这在本质上模拟了 SIPRl敲除小鼠的表 型。EC特异性的缺失G a s并不损害壁细胞，但是显著的减少胚胎E10. 0-Ell. 0期VE-钙粘 素连接位置，这与先前的经鉴定的胚胎血管发育中敲除SlPRl的表型是一致。此外，SlPRl 兴奋剂没有缓解VE-钙粘素连接位置减少的问题，但是在Ga s不足的内皮细胞中，Gas 下游的激动剂可以显著的修复VE-钙粘素连接缺陷。因此，本发明证实，Ga s通过作为 GPCR-S1PR1和其细胞内的效应器VE-钙粘素的传播中介，来控制血管的完整性。
[0039] 异源三聚体的G蛋白，由a，β，Y亚基组成，主要作为三聚体保存，当G蛋白偶联 受体对外部的配体应答而激活时，就会分离成G a s和G β。异源三聚体G蛋白是信号传感 器最大的家族，几乎涉及了从一个单个的卵母细胞成熟到多细胞器官的发展和发育过程的 每一个步骤。最近的研究证明，对于通过控制黏着连接力学来维持内皮通透性和完整性，G 蛋白有关键性的但不是独特的角色。G a sl3促进黏着连接的分解，因而通过激活Src磷酸 化作用依赖的内部的VE-钙粘素增加内皮渗透性。Gi3 Y有助于粘附连接再次复性，因此降 低内皮通透性。这里证实Gas对于维护血管的完整性有重要的作用。EC-特异性的Gas 缺失引起严重的血管渗漏，在不损害壁细胞覆盖的情况下减少VE-钙粘素的连接位置，这 就和SlPRl缺失的表型很相似。
[0040] 本发明的优点：本发明公开的Ga s蛋白或下游激动剂控制血管完整性和通透性 的特性在药物组合物中的潜在应用。Ga s蛋白传递SIPRl信号来稳定内皮连接处的VE-钙 粘素从而控制血管的完整性和通透性。
[0041] 本发明公开了控制血管完整性和通透性的G a s下游激动剂FSK，下游激动剂可以 与抑制血管生长抗癌药物联合用药，原则上可以增强血管抑制药抑制血管的功能；其控制 血管通透性的特性可以用于抑制过敏或炎症引起的血管通透性增加，降低炎症反应，减弱 炎性对组织的损失。
【专利附图】
【附图说明】
[0042] 附图1为内皮特异性敲除G a s的胚胎表型。
[0043] 其中，图IA为用G a s和PECAMl抗体对E10. 0阶段胚胎切片进行免疫荧光染色。 在背主动脉和神经管腔毛细血管的ECs中都可以观察到G a s。白色箭头指出G a s阳性着 色的ECs。
[0044] 图IB为对照组和突变组胚胎在Ε10. 0阶段的G a s和PECAMl的免疫荧光染色。 Tie2_Cre介导的Ga s敲除引起了背主动脉内皮细胞中Ga s表达减少。
[0045] 图IC为柱状图表示存活的Gas KO胚胎占 Gas KO胚胎总数的百分比。检测到 心跳即可判断为存活的G a sKO胚胎。
[0046] 图ID为图片区分了 Ell. 0阶段和ElL 5阶段对照和突变的胚胎。比例尺为1mm。 下列图片为高倍数的放大划定的区域。黄色的箭头指示了出血的背主动脉和前脑。
[0047] 图IE为柱状图显示带有病理性出血的Ga s KO胚胎占 Ga s KO胎盘总数的百分 t匕。注意到在Ell. 0阶段基本上所有的胚胎都在出血。
[0048] 图IF为ElI. 0阶段对照和Ga s KO胚胎的isolectinB4免疫荧光染色。在突变 的胎盘中检测到节间脉管系统有缺陷。
[0049] 附图2显示G a s的EC-特异性缺失对壁细胞覆盖血管没有影响。
[0050] 图2A为用PECAMl和a -SMA抗体对El I. 0对照和G a s KO胚胎截面的共免疫染 色。在突变的背主动脉中可以检测到破裂的血管壁，但是在Ga s移除组中没有检测到明显 的vSMC缺失附着在背主动脉。
[0051] 图2B和图2C为用PECAMl和NG2抗体对Ell. 0对照和突变胚胎截面的共免疫染 色。对照和Gas KO胎盘中，壁细胞覆盖背主动脉和神经管腔毛细血管完全相同。
[0052] 图2D为对照和G a sKO胚胎中（η = 3)，背主动脉和神经管腔毛细血管中的相对壁 细胞密度定量。以标记了 NG2的壁细胞和标记了 PECAMl的血管的荧光信号的比值来衡量， 并以土SD表示出来。对照和G a ss KO胎盘没有发现显著差异的壁细胞覆盖。
[0053] 附图3显示G a s的EC-特异性缺失导致在细胞连接处的VE-钙粘素减少
[0054] 图3A为ElI. 0对照和G a sKO胚胎背主动脉的PECAMl和N-钙粘素共染色。对照 和突变胚胎ECs里的N-钙粘素的表达水平和亚细胞定位是没有差异的。比例尺为20 μ m。
[0055] 图3B为分别来自于E10. 0和Ell. 0胚胎，对照和突变背主动脉的VE-钙粘素的 免疫染色。细胞核被DAPI着色。在Ga s KO突变背主动脉中检测到细胞和细胞连接处的 VE- I丐粘素显著减少。比例尺为20 μ m。
[0056] 图3C为VE-钙粘素免疫染色强度的定量。值用土SD表示。*ρ〈0·05，*#ρ〈0·001。
[0057] 图3D和3Ε为ElL 0对照和G a s KO胚胎背主动脉（D)和神经管腔毛细血管（E) 的VE-钙粘素的免疫荧光染色。右图为左图白色区域的放大。在对照胚胎细胞和细胞连接 处检测到丰富的VE-钙粘素的积累，而在突变组细胞和细胞连接间检测到少量的，不连续 的，点状的VE-钙粘素。
[0058] 图3F为存在于E10. 5的对照和G a s KO胎盘卵黄囊的横截面上的VE-钙粘素和 a -SM的免疫荧光染色。在卵黄囊，Ga s缺失显著的减少联接的VE-钙粘素信号，但是并 不影响a-SM的表达和定位。
[0059] 图4为G a s作为SlPRl的下游稳定细胞和细胞连接处的VE-钙粘素
[0060] 图4A为对照和G a S敲除HUVECs的VE-钙粘素免疫染色。GFP阳性细胞表明是对 照shRNA或者Ga s靶向shRNA转染的细胞。注意Ga Ss敲除削弱了细胞和细胞间连接的 VE-钙粘素信号。白色箭头指出转染阳性细胞的线状的细胞和细胞间的连接。
[0061] 图4B和4D为SEW2871和下游激动剂FSK处理HUVECs后，对VE-钙粘素连接位 置的影响以及肌动蛋白构造形成的影响。对照和G a s敲除HUVECs经过饥饿处理，随后用 指定的药物处理，紧接着用VE-钙粘素（B)或者鬼笔环肽（D)免疫染色。Ga s敲除阻碍了 SEW2871诱导的连接处的VE-钙粘素和细胞边沿肌动蛋白结构的富集，而G a s敲除细胞经 过下游激动剂FSK处理后明显的缓解了这些缺陷。
[0062] 图4C和4E为对图4B和4D的定量分析。
【具体实施方式】
[0063] 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应 涵盖在本发明的保护范围之内。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一 步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0064] - .材料和试剂
[0065] Floxed G a s allele 小鼠和 Tie2_cre 转基因小鼠（购自于 The Jackson Iaboratory)。为了得到胚胎内皮细胞G a s缺失小鼠，我们用雌性G a sfWflt)X小鼠与 Tie2_cre雄性小鼠杂交。产生的后代G a sfW+ ;Tie2_Cre小鼠进一步的与雌性G a sfWfl°x 小鼠交配产成Ga Ss KO胚胎。
[0066] 内皮细胞和人脐静脉内皮细胞HUVEC从新生儿脐带中分离，由华西第二医院提 供。
[0067] 二.试验仪器
[0068] 抗 NG2 抗体（1 :200，Millipore 公司），LSGS(Life Technologies 公司），人工 基底膜（BD Bioscience公司），蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Thermo Scientific)，抗 Ga s(NeuroMab)，抗 β-肌动蛋白（Santa Cruz Biotechnology 公司），抗 VE-I丐粘蛋白抗 体（1:100, BD Bioscience 公司），Alexa555-鬼笔环肽（1:50, Invitrogen)，SEW2871 (默 克 Millipore)，FSK(Sigma 公司）?
[0069] 三.试验方法
[0070] 1.生理学胚胎模型
[0071] 方法：Floxed G a s allele 小鼠和 Tie2_cre 转基因小鼠（购自于 The Jackson laboratory)。为了得到胚胎内皮细胞Ga s缺失小鼠，我们用雌性Ga ssfl°x/fl°x小鼠与 Tie2_cre雄性小鼠杂交。产生的后代G a sflW+ ;Tie2_Cre小鼠）进一步的与雌性G a sflW fl°x小鼠配合形成G a ss KO胎盘。
[0072] 表 L ? Tie2-Cre ;Ga SsfW+X 早 Ga SsfWfl〇x 杂交胚胎的基因型
[0073]
【权利要求】
1. G a s蛋白，下游激动剂FSK或G a s蛋白和下游激动剂FSK在用于制备控制血管完整 性和通透性药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，G a s蛋白，下游激动剂FSK或G a s蛋白 和下游激动剂FSK在制备维持正常血管内皮细胞完整性的药物组合物中的应用。
3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，G a s蛋白，下游激动剂FSK或G a s蛋白 和下游激动剂FSK在制备阻断肿瘤新生血管生长的药物组合物中的应用。
4. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，G a s蛋白，下游激动剂FSK或G a s蛋白 和下游激动剂FSK在制备过敏引起的血管炎症的药物组合物中的应用。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于，所述血管包括动脉、静脉和毛细 血管。
6. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，G a s蛋白，下游激动剂FSK传递S1PR1信 号来稳定内皮连接处的VE-钙粘素从而控制血管内皮细胞的完整性。
7. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物包含惰性、无毒、药理学 合适的赋形剂。
8. -种治疗血管内皮细胞完整性药物组合物，其特征在于，其含有有效组份的Ga s蛋 白，下游激动剂FSK或G a s蛋白和下游激动剂FSK。
9. 根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物组合物中G a s 蛋白，下游激动剂FSK或G a s蛋白和下游激动剂FSK占组合物重量百分比0. 1 % -90 %。
10. 根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，其还包括一种或多种惰性、无毒、 药理学合适的赋形剂。
【文档编号】A61P35/00GK104258392SQ201410430655
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】李华顺, 李红昌, 邵喜明 申请人:苏州顺升桥生物科技有限公司