本发明涉及植物保护领域中筛选多功能有益微生物的方法，具体涉及一种筛选既能在三七根际定殖又能拮抗三七根腐病菌的微生物的方法。
背景技术：
三七(panaxnotoginseng(burk.)f.h.chen)属五加科人参属植物，是我国特有的名贵中药材，具有散瘀止血，消肿定痛的功能，对治疗心脑血管疾病具有显著疗效。云南是三七的主产地和原产地。然而，三七生长存在严重的连作障碍问题，且由于连年大面积单一种植，连作障碍已严重影响三七的产量和品质。目前生产中主要通过化学农药和轮作倒茬来缓解连作障碍，但农药的大量使用不但未明显地减轻连作障碍，反而导致严重的农药残留和重金属超标等药品安全问题。轮作能较好的克服连作障碍，但三七轮作期限一般需要20年以上。随着市场对三七需求量的不断增加和新垦地的减少，三七种植逐渐从道地产区向非道地产区转移，严重影响三七药材的道地性和原产地保护。因此，如何克服三七连作障碍，确保药品安全和缩短土地再植周期是实现三七产业可持续发展的关键。
前期研究表明，三七连作障碍主要表现为根腐病发生严重。由于引起根腐病的主要是一些典型的土著型病原菌，化学杀菌剂和抗病品种的方法很难有效防治。利用有益微生物对根腐病菌对拮抗作用进行防治是最具潜力的防治方法。但众多研究表明，使用对病原菌具有抑制活性的生防菌效果不理想，主要是有益微生物难以在三七根际定殖，发挥拮抗功效。目前筛选生防菌的方法很多，主要采用的方法是体外抑菌圈法(方中达.植物病学研究方法.中国农业出版社，1998)，具体步骤主要方式有：(1)将采集的土样(过80目筛)10g加入装有90ml无菌水的三角瓶中(内装玻璃珠若干),28℃摇床振荡20min,然后进行10倍梯度系列稀释。吸取稀释液0.1ml放入na平板上均匀涂布,于28℃下培养24h～72h,挑取不同类型的菌落采用平板对峙测定法，观察有无抑菌圈的形成。然后，选出拮抗性较好的菌株,进一步作拮抗试验。(2)将根际土按10倍稀释法稀释后，吸取稀释液0.1ml放入pda平板上均匀涂布，于常温下培养3～4天，挑取不同类型的菌落纯化，制成发酵液，在无菌操作台上混入适温的培养基中，倒平板，待培养基冷却后，将直径为6mm的菌饼接种于平板中央，于25℃下培养3～4天，采用十字交叉法测量菌落直径，筛选出有抑制的拮抗菌。利用这些方法筛选获得了很多在室内对根腐病菌具有很强拮抗能力的有益微生物，但是这些生防菌在大田中不能成功定殖，随着时间的推移，很快在三七根际土壤中消失,不能很好发挥拮抗作用。
技术实现要素：
本发明的目的是针对目前利用体外抑菌圈法筛选出的有益微生物在三七根际不能很好地发挥防治作用的缺点，提供了一种从三七土壤中筛选既能利用三七根系分泌的皂苷作为营养进行生长又能有效拮抗根腐病菌的微生物的方法。具体是利用三七代谢物皂苷为原料制作培养基筛选能利用皂苷作为碳源生长的微生物。
本发明的技术方案是：
一种筛选三七根际生防菌微生物的方法，具体包括如下步骤：
(1)利用三七根系进行代谢物粗皂苷提取：选择健康的三七块根，洗净切成薄片，风干，磨成三七粉并过80～100目筛网，称取三七粉100g，用甲醇超声提取，提取后离心分离，收集上清液，将上清液蒸发浓缩除去甲醇，然后冷冻干燥成粗皂苷粉末，-25℃～-15℃条件下保存备用。
本发明优选2～3年生的三七作为原料；所述的三七块根优选为切成1～2cm的薄片。
所述的甲醇用量为100g三七粉中加入甲醇400～500ml，甲醇体积浓度为80％。
所述超声提取的温度为30～40℃，提取时间为30～50min。
所述离心分离的条件为10000～12000rpm、3～5℃、5～10min。
(2)利用粗皂苷制作选择性培养基：以10g粗皂苷为基准，分别称取10g粗皂苷、3gnano3、1gkh2po4、0.5gkcl、0.5gmgso4·7h2o、0.01gfeso4·7h2o和15～20g琼脂加入烧杯中溶解，混匀，调节ph值至7.0左右，进行灭菌处理，得到选择性培养基；将选择性培养基倒入灭菌培养皿中，每个培养皿倒入15ml培养基，冷却后待用。
所述的灭菌处理步骤的灭菌处理时间为20～40min；最好采用高压蒸汽进行灭菌，蒸汽压力为0.103mpa、温度为121℃。
(3)利用选择性培养基筛选以皂苷作为营养进行生长的微生物：采集三七根际土壤，除杂过筛(优选过80-100目筛)，称取10g土壤加入装有50～100ml无菌水的容器中于摇床上120～130rpm震荡20～30min，然后用无菌水进行10倍梯度系列稀释得到稀释液，吸取稀释液均匀涂布在第(2)步中装有选择性培养基的培养皿上，将涂匀的培养皿置于25～28℃下培养24h～72h，只有能降解皂苷的微生物才能在皂苷培养基上生长,大多数微生物会被抑制,根据微生物的生长或被抑制生长的情况，筛选出能利用三七根际分泌的皂苷作为营养进行生长的土壤微生物。
(4)利用对峙培养法筛选对根腐病菌具有拮抗能力的微生物：利用对峙培养法评价上述筛选出来的能利用皂苷的微生物对根腐病菌的拮抗能力。在培养皿中心位置培养基上接种待测根腐病菌菌饼，然后在所述待测根腐病菌菌饼上接种3～4个第(3)步筛选出的土壤微生物，于25～28℃下培养5～7d后观察是否出现抑菌圈，根据抑菌圈大小筛选出对根腐病菌具有拮抗能力的微生物，然后进行鉴定、保存、应用。
所述待测根腐病菌菌饼的接种直径为4～8mm，待测微生物最好采用十字交叉的方式接种。
所述的抑菌圈大小分为三个等级，分别为0～0.20cm、0.20～0.40cm、大于0.40cm，抑菌圈越大说明拮抗病原菌的能力越强。
本发明的发明人在研究中发现有益微生物的消失与三七根际存在大量的自毒皂苷有关。皂苷类物质是三七根系主要次生代谢产物，可以通过根系分泌和根组织降解的方式释放到土壤中，目前从土壤中检测到皂苷r1、rg1、re、rb1、rg2和rd。研究发现，这些皂苷在根际累积到一定浓度后，能使三七根系细胞受自毒危害，还能抑制一些根际有益微生物的生长，但这种累积的皂苷能促进三七根腐病菌在根际生长。因此，自毒皂苷的存在能进一步加重根腐病的发生。这表明三七根腐病菌能利用根系分泌的皂苷类物质作为养分进行生长，但有益微生物的生长反而被抑制。所以常规方法分离的生防菌不能在三七根际正常定殖。然而，皂苷的分泌是三七植株生长过程中的特性，不能人为消除。因此，筛选和利用既能以皂苷作为营养物质生长又能抑制病原菌生长的微生物作为生防菌才可能有效控制根腐病的危害。
本发明为了克服传统培养基筛选出来的生防菌不能在三七根际成功定殖的不足，充分利用三七代谢物皂苷作为培养基的主要成分，将根际土壤中能利用皂苷生长的微生物筛选出来，再在这些微生物中筛选对三七根腐病菌具有抑制活性的生防菌。这样筛选出来的微生物菌株，既可以在三七根际很好地定殖，又能有效拮抗根腐病菌，充分发挥其抑制病原菌生长的生防潜力，实现三七种植根腐病的生态防控。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例中所用的三七产地为云南省文山州砚山县。
实施例中所用的甲醇、nano3、kh2po4、kcl、mgso4·7h2o、feso4·7h2o、琼脂、naoh均为分析纯，市售。
实施例：
(1)利用三七根系进行代谢物粗皂苷提取。选择健康的三年生三七块根，自来水洗净表面，并切成1-2cm的薄片，室温下风干，随后用磨粉机磨成粉末并过100目筛网。称取三七粉40g置于50ml三角瓶中(500ml)，用200ml80％甲醇30℃超声提取40min。提取后离心(12000rpm，4℃，5min)，收集上清液。将上清液用旋转蒸发仪40度减压浓缩除去甲醇，然后冷冻干燥成粉末，-20℃冰箱中保存备用。
(2)利用粗皂苷制作选择性培养基。分别称取nano33g、kh2po41g、kcl0.5g、mgso4·7h2o0.5g、feso4·7h2o0.01g、粗皂苷10g、琼脂15g于1l玻璃烧杯中溶解，混匀，定容至1l，用1mol/lnaoh溶液调ph至7.0，分装后以0.103mpa、121℃、高压蒸汽灭菌20min；将灭菌液体培养基倒入灭菌的9cm直径培养皿中，每皿倒入15ml培养基，冷却后待用。
(3)利用选择性培养基筛选以皂苷为唯一碳源生长的微生物。采集三七根际土壤，室内除杂过80目筛。称取10g土壤加入装有90ml无菌水的三角瓶(500ml)中于摇床上120rpm震荡20min，然后用无菌水进行10倍系列稀释。吸取稀释液0.1ml加入选择性培养基平板上，用玻璃铲均匀涂布在该培养基上，将涂匀的培养皿置于28℃下培养36h，从中筛选出能降解利用皂苷的土壤微生物。
(4)利用对峙培养法筛选对根腐病菌具有拮抗能力的微生物。将在以皂苷作为唯一碳源制作的培养基上能生长的微生物与三七根腐病菌(镰刀菌、锈腐病菌、疫霉菌)继续在以皂苷为唯一碳源的培养基上对峙培养。在培养皿中心位置培养基上接种待测根腐病菌菌饼(直径6mm)，然后在菌饼周围3cm半径圆周上按照十字交叉法接种四个待测微生物。于28℃下培养5d后观察是否出现抑菌圈及抑菌圈的大小，按照抑菌圈大小评价不同菌株的抑菌能力。从中筛选出既能拮抗病原物，又能利用三七根际分泌的皂苷作为营养进行生长的微生物，然后进行鉴定、保存、应用。
利用这种方法筛选出的具有拮抗能力的微生物仅为步骤3中筛选获得微生物的10％左右。这表明三七根际土壤中存在既能利用皂苷作为碳源生长有能拮抗根腐病菌的有益微生物。选择其中3株形态差异明显，且对三七主要的根腐病菌均有较强拮抗能力的菌株鉴定后表明，这3株菌分别为bacillussubtilis，sphingomonasspp和pseudomonasstutzeri。
表1筛选获得的既能利用皂苷又能拮抗根腐病菌的微生物
+，++和+++代表筛选获得的微生物对供试根腐病菌的拮抗能力。+表示抑菌圈0～0.20cm；++表明抑菌圈0.20～0.40cm；+++表明抑菌圈大于0.40cm。
筛选获得的微生物在三七根际的定殖能力测定及对根腐病的防治效果测定：
首先，将上面筛选获得的bacillussubtilis(3-5)、sphingomonasspp(4-6)和pseudomonasstutzeri(14)菌株在含有链霉素的lb培养基上培养，筛选对链霉素具有抗药性的突变体。先将供试菌株在含5.0μgml-1链霉素的培养基上培养一代，然后将能生长的菌落继续接种于含链霉素50.0μgml-1链霉素的培养基上培养。将能在该培养基上生长的菌株转代至含链霉素50.0μgml-1的培养基上继代培养10代，该菌株为对链霉素产生抗药性的菌株。然后，选取三七根腐病发生严重地块的土壤装在花盆内种植三七植株。取待测菌株利用lb培养基摇培至含有108cfu的悬浮液。每株三七植株沿着茎基部加入5ml待测菌孢子悬浮液。用lb培养基为空白对照，取从玉米根际分离的bacillusamyloliquefaciens为对照。然后将不同处理分为两批。一批于接种5天、20天和40天后取根际土，利用平板稀释法在含链霉素50.0μgml-1的培养基上计数供试菌株的数量。另一批于接种后40天调查根腐病的发病情况。结果表明，本方法筛选的三株菌株对根腐病的防治效果菌达到60％以上，显著高于对照菌株。供试菌株在测定时间内在三七根际的数量没有显著降低，能很好的在根际定殖，但用常规方法从玉米根际筛选的对照菌株接种20天后在根际的数量显著下降，至接种40天后已经检测不到。
表2筛选出的生防菌株对三七根腐病菌的防治能力及在三七根际的定殖能力分析
*对照菌株为分离于玉米根际的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，且对三七根腐病菌具有拮抗能力的菌株。