本发明涉及一种可检测水性环境中铅离子含量的敏感型全细胞生物传感器的构建与使用，用于对铅离子进行定量以及重金属污染修复提供帮助。
背景技术：
铅是人类所需要且毒性很大的一种物质，汽车尾气、塑料燃烧的烟气、油漆以及爆米花、皮蛋等食品中都含有铅，通过人体呼吸、消化系统甚至皮肤而直接进入人体，进而对人体的诸多器官带来危害，可引起铅脑病、多发性神经炎和溶血性贫血等疾病，严重者甚至导致瘫痪。
(1)土壤铅污染：土壤中的铅残留主要来自天然存储和人类活动两方面。自然来源主要指矿物资源。人为来源主要是大气沉降、工业固废。人类活动向大气中排放的汞、铅等重金属的最后归宿是海洋和土壤；工业固废主要产生于金属加工、化工制品等。此外，在耕种土地上无科学方法指导的过度使用各类化学药品，也加重了土壤的铅污染。
(2)水体铅污染：水体中的铅也主要来自天然存储和人类活动两个方面。前者主要来自岩石矿物流出、火山爆发释放等，后者才是水体中铅污染的主要来源。此外，采矿废水、含铅废液的直接排放等人类生产活动直接将铅污染带入了水体。
铅污染现象愈发严重、铅中毒事件频繁发生，虽然近年来人们对铅中毒事件的警觉性得以提高，大规模、高剂量的中毒事件鲜有发生，但小规模、低剂量的中毒事件未能避免，人们急需找到一种高效快速的铅离子检测方法，各种科学技术发展至今，关于铅离子的检测方法主要可分为物理法、化学法和生物法三大类。
物理法研究中对铅离子的检测主要包括原子吸收分光光度计法、原子荧光光度法和电感耦合等离子体质谱法。这些传统的物理分析方法虽然具备高精准度、低检测限，但是均需要昂贵的仪器设备和专业操作人员，因此阻碍了大规模的推广使用。化学法作为传统的检测方法，主要包括滴定法、极普法、化学发光法、双硫脲比色法，这些方法通常存在灵敏度低、特异性差等缺点，而且检测中容易对环境造成二次污染，也不适用于重金属的实时快速检测。生物法主要包括酶传感器、dna传感器和微生物传感器等，生物传感器法具有成本低廉、操作简单、耗时短等优势，同时还兼具灵敏度高、特异性强、响应迅速的优点，尤其是全细胞水平金属探针，其灵敏度和稳定性比其他金属型生物传感器更为优越。
全细胞微生物传感器(whole-cellbiosensor)是一种便捷、快速、低成本的环境重金属检测工具，它采用基因工程技术对活体微生物进行改造，使其能够对重金属污染物进行定量分析，主要包括检测元件和报告元件，检测元件是能够响应目标物质的部分，报告元件一般选择一种便于检测的蛋白，如荧光蛋白，包括绿色荧光蛋白gfp、黄色荧光蛋白tfp等，或荧光素等。当环境中存在重金属离子，重组质粒中的转录调控蛋白被重金属离子特异性激活，与特异性启动子绑定或者脱落，激活或者抑制启动子的启动，进而调控下游报告元件的表达量的变化，产生可检测的信号，并且信号强度与环境中存在的重金属的浓度密切相关。转录调控蛋白对重金属的绑定与识别能力是生物传感器的检测限的关键，同时报告元件的信号输出能力决定着微生物传感器的灵敏度。全细胞生物传感器已成为重金属检测的重要工具，同时对于重金属污染修复提供有效帮助。
技术实现要素：
本发明的目的是通过对铅离子生物传感器进行设计，提供一种对铅离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器。同时提出对铅离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器的构建方法；它克服原有生物传感器灵敏度低、检测限高的不足。同时本发明还提供一种对铅离子敏感的全细胞生物传感器通过荧光检测对铅离子浓度进行测定的方法。
本发明的技术方案概述如下：
提出一种对铅离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器。
本发明的对铅离子敏感的具有基因级联放大表达系统的全细胞生物传感器的构建方法；包括如下步骤：
(1)将人工全合成双向启动子ppbr以及铅离子特异性结合蛋白pbrr如seqidno.1所示核苷酸序列与质粒pgn68所含自反馈调控蛋白luxr的seqidno.4的核苷酸序列通过酶切方式连接，筛选阳性克隆得到目标重组载体pet28a-pbr-lux(附图1)；质粒pgn68含有自反馈启动子pluxri其核苷酸序列如seqidno.3所示、绿色荧光蛋白基因核苷酸序列如seqidno.2所示、自反馈调控蛋白luxr核苷酸序列如seqidno.4所示，按照酶切方式依次连接；
(2)利用大肠杆菌e.colidh5α作为宿主，将重组载体pet28a-pbr-lux以及质粒pgn68共转化，得到对铅离子敏感性的全细胞生物传感器(见图2)。
根据反应机理：铅离子存在时，pbrr蛋白与铅离子结合导致其蛋白结构发生改变，从铅操纵子上脱落，启动下游荧光基因的表达，从而建立铅离子与荧光蛋白表达量之间的关系(附图3)。利用本发明的传感器对铅离子的检测方法，以e.colidh5α为宿主菌，通过生物传感器细胞的生长情况(附图4)以及荧光强度与铅离子浓度的关系制作标准曲线(附图5)，从而对环境中的铅离子进行定量。
具体说明如下：
1.对铅离子敏感的全细胞生物传感器的搭建方法，包括如下步骤：
(1)人工全合成双向启动子ppbr以及铅离子特异性结合蛋白pbrr，其核苷酸序列如seqidno.1所示；质粒pgn68所含绿色荧光蛋白基因gfp，其核苷酸序列如seqidno.2所示；质粒pgn68所含自反馈启动子pluxri，其核苷酸序列如seqidno.3所示；质粒pgn68所含自反馈调控蛋白luxr，其核苷酸序列如seqidno.4所示；
(2)将seqidno.1所示核苷酸序列和seqidno.4所示核苷酸序列通过酶切方式连接，筛选阳性克隆得到目标重组载体pet28a-pbr-lux；质粒pgn68含有自反馈启动子pluxri其核苷酸序列如seqidno.3所示、seqidno.2所示绿色荧光蛋白基因核苷酸序列、seqidno.4所示自反馈调控蛋白luxr核苷酸序列按照酶切方式依次连接。
(3)利用大肠杆菌e.colidh5α作为宿主，将重组载体pet28a-pbr-lux以及质粒pgn68共转化，得到对铅离子敏感性的目标重组菌株。
2.铅离子敏感的全细胞生物传感器的检测方法，包括以下步骤：
(1)对铅离子敏感的全细胞生物传感器的底盘细胞进行培养
第一步进行试管种子液培养：将重组菌e.colidh5α按照0.5％接种量接种在lb培养基于试管中，37℃，220rpm，过夜培养12-14h，得到种子培养液。
第二步进行摇瓶发酵培养：取种子培养液按照1％接种量，转接到含有100ml发酵培养基的250ml摇瓶中，220rpm、37℃，定时取样检测。
(2)对铅离子敏感的全细胞生物传感器的荧光检测
取1ml菌液于干净的比色皿中，于紫外分光光度计中测定吸光度，并置于荧光分光光度计内进行测量，测量条件为：激发波长480nm，发射波长520nm。
本发明的优点：
本发明构建的对铅离子敏感的全细胞生物传感器，以e.colidh5α为宿主菌，通过荧光强度于铅离子浓度的关系制作标准曲线，从而对环境中的铅离子进行定量。本发明可降低铅离子生物传感器检测背景值，同时提高铅离子生物传感器的敏感度，放大荧光信号，对环境中的铅离子进行定量检测。
附图说明
图1是全细胞生物传感器的重组载体pet28a-pbr-lux的人工构建质粒图谱。
图2是全细胞生物传感器的重组载体pet28a-pbr-lux与质粒pgn68共转化得到的具有自反馈体系的构建示意图。
图3是全细胞生物传感器细胞在基因级联放大表达系统下的工作机理图。
图4是本发明中铅离子生物传感器在加入铅离子后大肠杆菌细胞的生长情况随时间变化的关系曲线，即铅离子抑制生长时间-od600曲线图。
图5是本发明中铅离子生物传感器在加入不同浓度铅离子，所测得的荧光强度随铅离子浓度变化关系曲线，即铅离子生物传感器铅离子浓度-荧光响应图。
具体实施方式
利用天然菌株耐金属贪铜菌ralstoniametalliduransch34中的天然质粒pmol30中的pbrr基因以及大肠杆菌(escherichiacoli)pgn68的带有自反馈功能的启动子pluxri和调控蛋白luxr，以及绿色荧光蛋白基因gfp，在工程大肠杆菌dh5α中实现了对铅离子敏感的全细胞生物传感器的构建。
原始底盘细胞为e.colidh5α购买自北京全式金生物技术有限公司。
本发明所用pet28a质粒作为构建铅离子生物传感器的主要载体和pgn68质粒作为自反馈体系中荧光蛋白的表达载体。
lb培养基组成为：10g/lnacl、10g/l蛋白胨和5g/l酵母粉，余量为水，0.1mpa压力121℃下灭菌20min。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1重组表达载体pet28a-pbr-lux的构建
人工化学全合成的铅离子特异性结合蛋白pbrr以及双向启动子ppbr，其核苷酸序列如seqidno.1所示；自反馈调节蛋白luxr，其核苷酸序列如seqidno.1所示。将seqidno.1和seqidno.4所示的核苷酸序列通过酶切连接方式连接，筛选阳性克隆得到重组载体pet28a-pbr-lux，其质粒图谱见图1所示。
将通过化学全合成得到的seqidno.1所示核苷酸，通过pcr方法在片段两端分别加上bglⅱ和bamhⅰ酶切位点，使用fastdigest内切酶bglⅱ和bamhⅰ进行酶切，反应体系为：5μl10*fdbuffer，2.5μlbglⅱ、2.5μlbamhⅰ、30μl加酶切位点的seqidno.1所示核苷酸和10μl超纯水。反应条件为：37℃，1h。使用pcr纯化试剂盒，将50μl酶切产物中，加入250μlbingdingbuffer溶液，混匀后加入吸附柱中，静置一分钟，10，000g离心1分钟，弃出流出液。加入650μlwashbuffer,10，000g离心1分钟，弃出流出液。10，000g离心2分钟，去除残留的washbuffer。将吸附柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入30μlelutionbuffer(elutionbuffer提前在65℃水浴锅中预热)，室温静置1分钟，10，000g离心1分钟，洗脱酶切后的seqidno.1所示核苷酸片段。同样将pet28a质粒用fastdigest内切酶bglⅱ和bamhⅰ进行酶切，pcr纯化试剂盒纯化回收。将酶切后的seqidno.1所示核苷酸和pet28a质粒进行连接反应。反应体系为：1μl10*t4dnaligasebuffer,1μlt4dnaligase,6μl酶切后的核苷酸片段和2μl酶切后的pet28a-pbr质粒。反应条件为：22℃，10min。酶切连接后转化感受态细胞e.colidh5α，菌落pcr筛选阳性克隆提质粒，测序验证，得到seqidno.1所示核苷酸连接到表达载体pet28a-pbr。
将pgn68中的seqidno.4所示核苷酸，通过pcr方法在片段两端分别加上bamhⅰ和xhoⅰ酶切位点，使用fastdigest内切酶bamhⅰ和xhoⅰ将它与连接了seqidno.1所示核苷酸的表达载体pet28a-pbr进行双酶切，然后通过dna连接酶将seqidno.4所示核苷酸连接到连接了seqidno.1所示核苷酸的表达载体pet28a-pbr上，酶切连接反应体系及反应条件按照连接了seqidno.1所示核苷酸的表达载体pet28a-pbr构建方法。酶切连接后转化感受态细胞e.colidh5α，菌落pcr筛选阳性克隆，获得重组载体pet28a-pbr-lux，测序验证。实施例2质粒pgn68的构建
质粒pgn68所含绿色荧光蛋白基因gfp，其核苷酸序列如seqidno.2所示；质粒pgn68所含自反馈启动子pluxri，其核苷酸序列如seqidno.3所示；质粒pgn68所含自反馈调控蛋白luxr，其核苷酸序列如seqidno.4所示。
通过聚合酶链式反应，以实验室已有的pgn12为模板分别扩增seqidno.3以及seqidno.4所示的核苷酸序列，并在seqidno.3所示的序列两端加入salⅰ和ecorⅰ酶切位点，seqidno.4所示的序列两端加入ecorⅰ和bamhⅰ酶切位点。人工全合成seqidno.2所示绿色荧光蛋白基因gfp，并在序列两端加入bamhⅰ和notⅰ酶切位点。通过使用fastdigest内切酶对上述三个片段分别进行酶切，然后以t4dna连接酶连接并转化至感受态细胞e.colidh5α，菌落pcr筛选阳性克隆，获得质粒pgn68，测序验证。
实施例3重组表达载体pet28a-pbr-lux与质粒pgn68共转化到大肠杆菌底盘菌株e.colidh5α(见图2)。
重组表达载体pet28a-pbr-lux与质粒pgn68共转化到大肠杆菌底盘菌株e.colidh5α中的详细构建步骤如下：
1、将活化的大肠杆菌菌株dh5α100μl，接种于10mllb培养基中，37℃，220rpm，培养至od600为0.5-0.6时，转入10ml离心管中，在预冷的4℃离心机中，4500rpm/min，离心5min，去上清，收集菌体；
2、用5ml预冷的灭过菌的0.1mol/l氯化钙洗涤菌体，在预冷的4℃离心机中，4500rpm/min，离心5min，去上清，收集菌体，重复洗涤两次；
3、尽量倒尽上清，加入50μl0.1mol/l氯化钙，50μl30％甘油重悬菌体，制成e.colidh5α感受态细胞；
4、将实施例1中构建的pet28a-pbr-lux与质粒pgn68质粒各2μl，加入到100μl电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。冰上防止半小时后，热击45s并迅速冰浴2min，加入1mllb培养基，37℃复苏1h后涂布对应含有卡那霉素与氯霉素双抗性的平板，过夜培养；
5、挑选菌落pcr验证的阳性转化子到5mllb培养基中过夜培养，得到重组菌株e.colidh5α-pbr，保存菌株。
实施例4重组菌e.colidh5α-pbr的发酵培养及铅标准溶液诱导下的荧光检测
将重组菌e.colidh5α按照1％接种量接种在lb培养基于试管中，37℃，220rpm，过夜培养12-14h，得到种子培养液。取种子培养液按照1％接种量，转接到含有100ml发酵培养基的250ml摇瓶中，220rpm、37℃条件下进行培养2h，至od600＝0.5-0.6，即底盘细胞大肠杆菌的生长对数期。
向底盘细胞中分别添加100μl双蒸水溶液、5mm铅离子标准溶液、50mm铅离子标准溶液、100mm铅离子标准溶液、200mm铅离子标准溶液和300mm铅离子标准溶液，使铅离子终浓度为0μm、10-4μm、10-3μm、10-2μm、1μm、5μm、50μm、100μm、200μm和300μm。样品在220rpm、37℃培养箱中继续培养，并实时监控菌株的生长情况。
根据反应机理：铅离子存在时，pbrr蛋白与铅离子结合导致其蛋白结构发生改变，从铅操纵子上脱落，启动下游荧光基因的表达，从而建立铅离子与荧光蛋白表达量之间的关系(见图3)。在加入铅离子样品标准溶液孵育的4h取样进行吸光度以及荧光信号的检测。吸光度在600nm波长下进行测量，荧光检测条件为：激发波长480nm、发射波长520nm。
实施例5
试验证明：
采用了双向启动子ppbr分别诱导pbrr和luxr蛋白的基因电路结构与pluxri诱导luxr和gfp蛋白的双基因电路自反馈调节体系，得到铅离子生物传感器在加入铅离子后大肠杆菌细胞的生长情况随时间变化的关系曲线，即铅离子抑制生长时间-od600曲线图如图4所示。所测得的荧光强度随铅离子浓度变化关系曲线，即铅离子生物传感器铅离子浓度-荧光响应图如图5所示。所构建的生物传感器细胞底盘背景值较低，在铅离子浓度从10-3μm至50μm之间，荧光响应呈现递增趋势，灵敏度较好。
seqidno.01
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seqidno.02
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seqidno.03
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seqidno.04
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