本发明属于生物提取
技术领域：
，具体涉及一种广西金花茶多糖肽的制备方法。
背景技术：
：金花茶花色金黄，多数种具蜡质光泽，晶莹可爱，花型有杯状、壶状、碗状和盘状等，形态多样，秀丽雅致，在山茶类群中，被誉为“茶族皇后”。金花茶是一种保健价值很高的药食同源植物，金花茶的花叶均可入药或食用，明代伟大的医药家李时珍在《本草纲目》中早有记载“山茶嫩叶炸熟、水淘，可食，亦可蒸晒作饮”。研究分析发现，金花茶含有400多种对人体有益的化学成份，含有天然有机锗、硒、锰、钒、锌等多种对人体有重要保健作用的微量元素以及维生素、茶多酚、维生素、黄酮、多糖和多种人体必需的氨基酸等。经临床实验证明：金花茶具有降血脂、降胆固醇、降血压、抑制肿瘤生长、抗衰老、激活人体多种酶等特殊保健作用，与医著记载相互吻合，互相应证。中国专利申请cn106866833a公开了一种具有抗应激作用的金花茶多糖提取物及其制备方法，包括以下步骤：金花茶的细枝或叶打成粗粉，85％乙醇湿渗漉，药渣加水加热回流，95％乙醇沉淀，离心得沉淀。该制备方法简单易行、成本低廉，使用的是平时基本作为废弃物的金花茶的细枝或叶，有利于资源的深入开发，制备的金花茶多糖可应用于抗应激药物、耐疲劳药物、耐缺氧药物、耐寒冷药物以及保健食品，但是采取了高温提取，容易造成活性成分的损失。多糖肽是一种糖蛋白，是多糖与蛋白质的复合体，具有很高的分子量，由多糖的重复单元组成。多糖肽具有很强的生物活性，研究证实，多糖肽具有重要的药理学作用，可以增强机体免疫功能，具有抗氧化作用，并可以在一定程度上抑制肿瘤细胞的生长，而且相对于多糖，有着口服有效性。现有提取金花茶有效成分的方法是高温提取，具有保健功能的生理活性物质的部分活性会丧失，而且提取率、纯度低，单位产品原料消耗量大。另外，有关多糖肽的研究逐渐受到关注，广西金花茶是我国特有茶种，国内外对它的研究报道甚少，对其多糖肽制备的研究更是少之又少。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种广西金花茶多糖肽的制备方法。本发明制备的广西金花茶多糖肽的纯度高达86.3％，且抗氧化活性良好，可用于制备抗氧化、抗衰老等保健产品。发明提供的一种广西金花茶多糖肽的制备方法，包括以下步骤：s1、脱脂：金花茶叶片清洗后粉碎，过10-20目筛，得金花茶粉末，取上述所得金花茶粉末10g，加入二氯甲烷和乙醇，二氯甲烷和乙醇体积比为2-5:1-3，60-80℃回流2-3h，得脱脂金花茶；s2、提取：向步骤s1所得脱脂金花茶中加入蒸馏水和纤维素酶，用质量浓度为5-10％的柠檬酸溶液调节ph值至5.5，40-60℃酶解0.5-1h，高温灭酶，脉冲电场处理后超声提取0.5-2h，3层200目纱布过滤，收集滤液，滤渣加入蒸馏水后同法操作再提取一次，合并滤液，浓缩，得多糖肽溶液；s3、醇沉：将步骤s2所得多糖肽溶液在不断搅拌中缓慢滴加无水乙醇，磁力搅拌20-40min后2-5℃静置16-24h，10000-15000r/min高速离心，收集乙醇沉淀部分i，离心后的上清液再缓慢滴加无水乙醇，同法操作，收集乙醇沉淀部分ii，合并两次收集到的沉淀部分，真空低温干燥，得多糖肽粗品；s4、纯化：将步骤s3所得多糖肽粗品加蒸馏水微热溶解，离心除去不溶性杂质，通过聚丙烯酰胺凝胶柱层析，用含5-10mol/lnacl的na2hpo4-nah2po4缓冲液洗脱，蒸馏水透析10-20h，取袋内液进行浓缩，加入5倍体积的无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀部分，冷冻干燥，即得。进一步地，所述步骤s1中二氯甲烷、乙醇的总体积与金花茶粉末加入量之比为5-8ml/g。进一步地，所述步骤s2中蒸馏水加入量为300-500ml，纤维素酶加入量为30-50mg。进一步地，所述步骤s2中脉冲电场强度为10-20kv，频率为1000-2000hz，脉冲数为4-8。进一步地，所述步骤s2中超声提取温度为50-55℃，频率为25-55khz。进一步地，所述步骤s3中多糖肽溶液和无水乙醇的体积比为1:0.5-3，上清液和无水乙醇的体积比为1:1-2。进一步地，所述步骤s4中缓冲液ph为5.8-7.0，浓度为0.1-0.35mol/l。本发明首先对金花茶叶进行脱脂、酶解细胞壁预处理，脱去脂肪后，蛋白质和肽的疏水部分不再与其中的脂肪作用，使其亲水基团更易与溶剂水分子结合，从而使得提取液中的蛋白质和肽的含量大幅增加，酶解细胞壁有利于有效成分的最大限度溶出，提高有效成分的提取率，并改善生产过程中的过滤速度；脉冲电场-超声提取相结合的方式可使提取效率大大提高，解决了一般的超声提取技术存在能量在原料中分布不均匀的缺点，可提高能量的利用率，有利于节约能源，提高效率；采用聚丙烯酰胺凝胶柱层析改善了多糖肽的纯化效果，提高其纯度和质量。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明广西金花茶多糖肽的制备工艺合理，多糖肽提取效率高，纯度高达86.3％。(2)制备的广西金花茶多糖肽抗氧化活性良好，对羟自由基的清除率达到73％，对超氧阴离子自由基的清除率达到81％，为金花茶作为抗氧化、抗衰老保健食品的开发提供理论依据。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。本发明中，纤维素酶可购自郑州亿之源化工产品有限公司；聚丙烯酰胺凝胶可购自bio-rad公司。实施例1、一种广西金花茶多糖肽的制备方法s1、脱脂：金花茶叶片清洗后粉碎，过10目筛，得金花茶粉末，取上述所得金花茶粉末10g，加入二氯甲烷和乙醇，二氯甲烷和乙醇体积比为2:1，60℃回流3h，得脱脂金花茶；s2、提取：向步骤s1所得脱脂金花茶中加入400ml蒸馏水和30mg纤维素酶，用质量浓度为5％的柠檬酸溶液调节ph值至5.5，40℃酶解1h，高温灭酶，脉冲电场处理后于温度为50℃、频率为25khz的条件下超声提取0.5h，3层200目纱布过滤，收集滤液，滤渣加入蒸馏水后同法操作再提取一次，合并滤液，浓缩，得多糖肽溶液；s3、醇沉：将步骤s2所得多糖肽溶液在不断搅拌中缓慢滴加0.5倍体积的无水乙醇，磁力搅拌20min后2℃静置20h，10000r/min高速离心，收集乙醇沉淀部分i，离心后的上清液再缓慢滴加同体积的无水乙醇，同法操作，收集乙醇沉淀部分ii，合并两次收集到的沉淀部分，真空低温干燥，得多糖肽粗品；s4、纯化：将步骤s3所得多糖肽粗品加蒸馏水微热溶解，离心除去不溶性杂质，通过聚丙烯酰胺凝胶柱层析，用含5mol/lnacl的na2hpo4-nah2po4缓冲液洗脱，蒸馏水透析15h，取袋内液进行浓缩，加入5倍体积的无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀部分，冷冻干燥，即得。所述步骤s1中二氯甲烷、乙醇的总体积与金花茶粉末加入量之比为5ml/g。所述步骤s2中脉冲电场强度为10kv，频率为1000hz，脉冲数为4。所述步骤s4中缓冲液ph为5.8，浓度为0.2mol/l。实施例2、一种广西金花茶多糖肽的制备方法s1、脱脂：金花茶叶片清洗后粉碎，过20目筛，得金花茶粉末，取上述所得金花茶粉末10g，加入二氯甲烷和乙醇，二氯甲烷和乙醇体积比为3:2，70℃回流2h，得脱脂金花茶；s2、提取：向步骤s1所得脱脂金花茶中加入300ml蒸馏水和40mg纤维素酶，用质量浓度为7％的柠檬酸溶液调节ph值至5.5，50℃酶解1h，高温灭酶，脉冲电场处理后于温度为55℃、频率为40khz的条件下超声提取1.5h，3层200目纱布过滤，收集滤液，滤渣加入蒸馏水后同法操作再提取一次，合并滤液，浓缩，得多糖肽溶液；s3、醇沉：将步骤s2所得多糖肽溶液在不断搅拌中缓慢滴加2倍体积的无水乙醇，磁力搅拌30min后4℃静置16h，12000r/min高速离心，收集乙醇沉淀部分i，离心后的上清液再缓慢滴加1.5倍体积的无水乙醇，同法操作，收集乙醇沉淀部分ii，合并两次收集到的沉淀部分，真空低温干燥，得多糖肽粗品；s4、纯化：将步骤s3所得多糖肽粗品加蒸馏水微热溶解，离心除去不溶性杂质，通过聚丙烯酰胺凝胶柱层析，用含8mol/lnacl的na2hpo4-nah2po4缓冲液洗脱，蒸馏水透析10h，取袋内液进行浓缩，加入5倍体积的无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀部分，冷冻干燥，即得。所述步骤s1中二氯甲烷、乙醇的总体积与金花茶粉末加入量之比为7ml/g。所述步骤s2中脉冲电场强度为15kv，频率为1500hz，脉冲数为6。所述步骤s4中缓冲液ph为6.4，浓度为0.1mol/l。实施例3、一种广西金花茶多糖肽的制备方法s1、脱脂：金花茶叶片清洗后粉碎，过20目筛，得金花茶粉末，取上述所得金花茶粉末10g，加入二氯甲烷和乙醇，二氯甲烷和乙醇体积比为5:3，80℃回流2.5h，得脱脂金花茶；s2、提取：向步骤s1所得脱脂金花茶中加入500ml蒸馏水和50mg纤维素酶，用质量浓度为10％的柠檬酸溶液调节ph值至5.5，60℃酶解0.5h，高温灭酶，脉冲电场处理后于温度为55℃、频率为55khz的条件下超声提取2h，3层200目纱布过滤，收集滤液，滤渣加入蒸馏水后同法操作再提取一次，合并滤液，浓缩，得多糖肽溶液；s3、醇沉：将步骤s2所得多糖肽溶液在不断搅拌中缓慢滴加3倍体积的无水乙醇，磁力搅拌40min后5℃静置24h，15000r/min高速离心，收集乙醇沉淀部分i，离心后的上清液再缓慢滴加2倍体积的无水乙醇，同法操作，收集乙醇沉淀部分ii，合并两次收集到的沉淀部分，真空低温干燥，得多糖肽粗品；s4、纯化：将步骤s3所得多糖肽粗品加蒸馏水微热溶解，离心除去不溶性杂质，通过聚丙烯酰胺凝胶柱层析，用含10mol/lnacl的na2hpo4-nah2po4缓冲液洗脱，蒸馏水透析20h，取袋内液进行浓缩，加入5倍体积的无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀部分，冷冻干燥，即得。所述步骤s1中二氯甲烷、乙醇的总体积与金花茶粉末加入量之比为8ml/g。所述步骤s2中脉冲电场强度为20kv，频率为2000hz，脉冲数为8。所述步骤s4中缓冲液ph为7.0，浓度为0.35mol/l。对比例1、一种广西金花茶多糖肽的制备方法步骤s1中将二氯甲烷和乙醇替换为石油醚，其余与实施例2类似。对比例2、一种广西金花茶多糖肽的制备方法步骤s2中未进行脉冲电场处理，其余与实施例2类似。试验例一、多糖肽纯度的测定1.试验材料：实施例1-3和对比例1-2制备得到的广西金花茶多糖肽。2.试验方法：精密称取干燥至恒重的多糖肽标准品0.05g于10ml容量瓶中，加水溶解定容，得标准用液，然后分别取100、200、300、400、500μl标准用液于5ml容量瓶中，加水定容，得到浓度分别为100、200、300、400、500μg/ml的标准工作液，将标准工作液通过高效液相色谱仪进行测定，色谱条件为：色谱柱为atlanticst3色谱柱，规格为4.6×250mm，5μm，柱温35℃，流动相为体积分数5％的甲醇水溶液，流速1ml/min，进样量为10μl，检测器为二极管阵列检测器，扫描波长为200-450nm。将所得数据以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立浓度-峰面积标准曲线，得出标准方程。精密称取制备得到的广西金花茶多糖肽0.05g于50ml容量瓶中，加水溶解定容，取10μl样品溶液按照上述方法测定，根据峰面积换算为浓度，从而计算出多糖肽纯度。3.试验结果：样品溶液中某组分保留时间为2.467min，多糖肽标准品的保留时间为2.531min，在正常误差范围内，另外，二者最大吸收波长相近，表明该组分为多糖肽。多糖肽纯度测定结果见表1。表1多糖肽纯度测定结果类别实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2纯度/％79.686.381.575.172.4由表1可知，本发明制备的广西金花茶多糖肽纯度较高，其中实施例2的多糖肽纯度最高，达到76％，为本发明的最佳工艺实施例，说明本发明制备工艺合理。试验例二、抗氧化作用1.试验材料：实施例1-3和对比例1-2制备得到的广西金花茶多糖肽。2.试验方法：(1)羟自由基的清除作用取1ml浓度为0.5mol/l、ph为7.4的磷酸缓冲溶液、1ml浓度为40μg/ml的番红花红、1ml新鲜配制的浓度为0.945mmol/l的edta-fe(ii)、1ml新鲜配制的质量浓度为3％的h2o2、浓度为0.5mg/ml的多糖肽样品溶液0.5ml，混合均匀后在37℃水浴中反应30min，然后于520nm处测定吸光度值，空白组以0.5ml蒸馏水代替样品溶液测定吸光度，对照组以1.5ml蒸馏水代替h2o2和样品溶液测定吸光度。清除率1＝(a样品-a空白)/(a对照-a空白)×100％(2)超氧阴离子自由基清除作用量取5mlph为8.2的eris-hcl缓冲液和4.7ml双蒸水于比色管中混合均匀，25℃恒温水浴20min，取出后立即加入在25℃预热过的3mmol/l邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，邻苯三酚自氧化3min后加1滴0.08mg/ml维生素c立即混匀，室温下放置5min，以10mmol/lhcl为空白液测定其在420nm下的吸光度a0。在上述tris-hcl缓冲液中加入浓度为4.7ml浓度为0.5mg/ml的多糖肽样品溶液，在按上述方法测定邻苯三酚的吸光度得到a1，同时做一空白试剂的吸光度得到a2。清除率2＝[a0－(a1－a2)]/a0×100％3.试验结果：试验结果见表2。表2抗氧化作用测定结果类别实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2清除率1/％7073686360清除率2/％7881746865由表2可知，本发明制备得到的广西金花茶多糖肽具有较好的抗氧化作用。本发明实施例1-3制备的广西金花茶多糖肽对羟自由基、超氧阴离子自由基清除效果较好、抗氧化活性较高，其中实施例2的清除率最高，为本发明的最佳实施例。当前第1页12