本发明涉及分子生物学和免疫学领域，具体地说，涉及一种结核分枝杆菌变态反应原组合物及其制备方法与应用。
背景技术：
结核病是慢性传染性疾病。目前全球已有20亿人感染结核菌，活动性结核患者达1500万，每年新发结核患者达800万～1000万，有180万人因结核病死亡。1993年世界卫生组织(who)宣布“全球结核病处于紧急状态”，将结核病列为重点控制传染病之一。1998年who再次指，“遏制结核病行动刻不容缓”。
据who《2008年全球结核病控制报告》估计，2006年我国结核病发病人数为131万，占全球的14.3％，位居全球第二位，是全球22个结核病高负担国家之一。2010年全国结核病流行病学抽样调查结果显示，我国结核病疫情特点是：感染人数多，全国有5亿人口已感染结核菌，明显高于全球平均感染水平；患者数多，全国有活动性肺结核患者约500-600万，其中传染性肺结核患者约86万；死亡人数多，农村患者多，全国约80％肺结核患者在农村，而且主要集中在中西部地区；耐药患者多，特别是耐多药和广泛耐药患者人数多。
在我国传染病疫情网络报告中，肺结核报告发病和报告死亡数位居甲、乙类传染病前列。肺结核患者中的3/4为最具有劳动能力的青壮年。结核病仍是制约农村地区特别是贫困地区经济和社会发展的重大疾病之一。同时，我国结核病防治工作还面临着流动人口结核病、耐多药结核病和结核菌/艾滋病病毒双重感染等新的挑战。
结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。结核病是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。潜伏期4～8周。其中80％发生在肺部，其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染。人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。传染源是接触排菌的肺结核患者。随着环境污染和艾滋病的传播，结核病发病率越发强烈。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。
who估计每年大约有300万的结核患者未被检测到，不仅使得结核感染患者不能及时诊治，同时也加大了家庭和社会群体之间的传播风险。不利因素提醒我们在结核病控制中早期筛查尤为重要，在《柳叶刀》的一篇结核相关文献中，提出了一个重要的观念变革--在世界范围内推广“在高危群体中去主动发现病人。”结核的高危人群主要包括两类。一是和结核确诊患者有密切接触的亲属和在共同生活环境中的人员；二是基于各国结核病流行趋势不同的特定人群。现存的发现结核病例的方式主要是被动的发现，即等着患者(如果经济条件和医疗条件允许)自己来寻求医疗救治。这种方式虽然能发现大量的患者，但寻求救治的患者一般已有了明显的症状，可能早就在家庭、群体之间发生了传播。大量没有寻医的患者对公众健康存在极大的隐患。
针对确诊的患者的亲属和与其密切接触的人员：一旦发现了结核患者，就应该要求其亲属和与其有密切接触的人员到医疗机构进行结核病筛查。同时，也需在条件允许的情况下主动去患者的家庭及其生活环境中进行筛查。
根据结核病感染的特点，具体选择高危人群进行筛查。1)hiv患者：虽然我国整体的hiv发病率达不到5％,但因为hiv感染的人数逐年上升，临床中应该提高门诊hiv患者的重视程度，尽可能对其进行结核病筛查。2)选择结核病高发区域进行普查。我国是结核病高负荷国家之一，且是人口大国，进行结核病普查显然是不现实的。因此，基于各地区结核发病率的差异，选择发病率高的地区(经济欠发达地区、下级乡镇等)进行普查是一项值得考虑的举措。3)做好医院感控工作，防止结核院内感染。目前我国各级医院经常出现人满为患的情况，应该做好做好医院感控工作，防止结核院内感染。保证候诊区的通风，及时发现、隔离疑似病例都是有效的手段。
传统的结核确诊手段，需要考虑影像学、细菌学、临床表现、分子生物技术等许多方面，如：(1)询问病史和症状，体格检查。(2)胸片、ct等影像学检查。(3)痰涂片抗酸染色查抗酸杆菌。(4)痰培养找结核杆菌。近年发展起来的分枝杆菌快速培养、鉴定和药物敏感性检测技术使原来培养所需时间大大缩短。(5)结核菌素(现一般用ppd试验)。(6)抽血查结核抗体。(7)结核特异性反应t细胞的细胞因子释放试验如t-spot及quantiferon-tb检测方法，有助于鉴别结核分枝杆菌感染，区别于卡介苗接种和其他大多数非结核分枝杆菌感染。(8)结核杆菌聚合酶链反应(tb-pcr)+探针检查。近年开展的分枝杆菌基。因芯片检查技术、巢式pcr+反向点杂交分枝杆菌鉴定及耐药基因检测技术，使结核菌鉴定及药物敏感试验时间缩短到只需几个小时，为耐药结核病的及时合理治疗提供了方便。(9)纤维支气管镜检查，包经支气管镜活检、刷检，支气管肺泡灌洗或冲洗液获取标本进行细菌学、细胞学及病理学等检查。(10)临床标本的噬菌体分析方法。(11)经皮穿剌肺组织病理活检。(12)肺外淋巴结或其它器官的病理活检。
比较上述诊断方法，虽然经典的ppd试验已经应用了100年，但是该方法灵敏度低，特异性差，不能鉴别卡介苗接种者，血清结核抗体检测等方法的灵敏度和特异性不理想；近几年兴起的γ干扰素释放试验的试剂昂贵，技术复杂，需要特殊的设备和培训，不适合基层医疗单位或者现场应用。
结核菌素是结核分枝杆菌培养滤液蛋白，作用于人体会激发致敏机体产生iv型超敏反应，iv型超敏反应是由t淋巴细胞介到，通常在抗原攻击后48小时才能表现出来，其核心是cd4+和/或cd8+效应t细胞在识别靶抗原后造成的以淋巴细胞浸润为主要病理特征的炎症损伤。患过结核或者接种过卡介苗的人在皮下注射ppd24小时会出现炎性硬结，48-72小时达到高峰，有时会出现全身反应。通常反应强度与细胞免疫呈平行关系。ppd已经成为临床上最常用且最简便的一种结核菌感染诊断方法，反应越强，表示结核感染可能性越大，我国一直使用硬结≥5mm为阳性，≥20mm或有水泡、坏死、淋巴结炎等为强阳性，3岁以下儿童≥15mm为强阳性的标准。
用于结核病皮肤试验的主要试剂有以下几种：(1)旧结核菌素，不易标准化和易发生非特异性反应，已经被淘汰；(2)tb-ppd，人型结核菌素；(3)bcg-ppd，牛型结核菌素，是卡介苗培养液纯蛋白衍生物，主要用于卡介苗接种是否成功；(4)结核菌重组38kd蛋白，是一种新的皮试抗原，有结核感染者反应强，卡介苗接种者反应弱的特点。
当前大规模人群筛查主要手段是ppd筛查。但是，ppd不能区分卡介苗(bcg)接种或是结核杆菌感染，假阳性的结果影响结核病筛查。因此，临床急需一种价格合适的，应用简便，无需特殊仪器，适合基层医疗单位的皮肤诊断试剂。
安徽龙科马生物制药有限责任公司和海正药业分别在商品化试剂方面做出了尝试，龙科马公司将esat-6与cfp-10融合表达，使得esat-6与cfp-10在溶液中不能正确配对紧密结合；海正药业的专利技术将cfp-10与esat-6融合表达存在同样的问题。本发明采用全新的策略，串联表达cfp-10，再向溶液中添加esat-6单体，使其模拟天然组合物的搭配，从而提高抗原效率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌变态反应原组合物及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种结核分枝杆菌cfp10融合蛋白，所述cfp10融合蛋白是由n个如seqidno:3所示的结核分枝杆菌抗原蛋白rv3874的t细胞表位肽之间通过linker串联得到的。
其中，n是整数，n≥2。优选地，n＝2。
本发明中，所述linker是由5-30个柔性氨基酸串联而成。优选地，所述linker为ggggsggg。
本发明还提供结核分枝杆菌esat-6重组蛋白，来自结核分枝杆菌抗原蛋白rv3875的t细胞表位肽，所述esat-6重组蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示。
本发明提供的结核分枝杆菌变态反应原组合物，所述组合物由所述cfp10融合蛋白和所述esat-6重组蛋白按等重量比或等摩尔比混合而成。
优选地，所述cfp10融合蛋白是由2个如seqidno:3所示的结核分枝杆菌抗原蛋白rv3874的t细胞表位肽之间通过linker串联得到的。
更优选地，所述cfp10融合蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。
本发明中，cfp-10和esat-6的氨基酸序列设计参考来源于结核杆菌h37rv株。
在本发明的一个具体实施方式中，所述结核分枝杆菌变态反应原组合物是由如seqidno:1所示的cfp10融合蛋白和如seqidno:2所示的esat-6重组蛋白按等重量比或等摩尔比混合而成的4亚单位的组合物tb-4s(图1)。所述变态反应原与ppd相比具有更好的特异性。
本发明还提供所述结核分枝杆菌变态反应原组合物在制备结核诊断试剂或检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种结核诊断试剂，所述诊断试剂中含有所述结核分枝杆菌变态反应原组合物。
本发明的结核分枝杆菌变态反应原组合物可按如下方法制备，包括以下步骤：
1)构建编码所述cfp10融合蛋白的基因表达盒；
2)构建编码所述esat-6重组蛋白的基因表达盒；
3)将步骤1)和步骤2)的表达盒构建到同一表达载体上，利用原核表达系统表达目的蛋白；或者，
将步骤1)和步骤2)的表达盒分别构建到不同表达载体上，利用原核表达系统表达目的蛋白；
4)分离纯化步骤3)表达的目的蛋白，(在溶液中)将cfp10融合蛋白和esat-6重组蛋白按等重量比或等摩尔比混合。
优选地，编码所述cfp10融合蛋白的基因的核苷酸序列如seqidno:4所示。编码所述esat-6重组蛋白的基因的核苷酸序列如seqidno:5所示。
优选地，所述表达载体为pet-9d。
优选地，所述原核表达系统为大肠杆菌(如bl-21)或乳酸菌。
按照上述方法设计合成基因序列，转入大肠杆菌或乳酸菌(革兰氏阳性菌)等原核表达系统，表达蛋白质。纯化后等量混合，作为皮试反应原，用于结核病感染的诊断等相关领域。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供的结核分枝杆菌变态反应原组合物可用于结核杆菌潜伏感染人群的筛查和辅助诊断，以及结核病流行调查。可用作结核菌素ppd的替代品。
附图说明
图1为本发明结核分枝杆菌变态反应原组合物的设计方案。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1重组质粒构建
1.1将设计好的rdcfp-10和resat-6核酸序列(seqidno:4和5)全合成并在基因上游连接bamhi酶切位点，在下游连接ncoi酶切位点。
1.2按照常规方法制备大肠杆菌bl21感受态细胞，将pet-9d(novagen公司)质粒转入菌中，接种lb琼脂平板(含50μg/ml卡那霉素)，倒置过夜，第2天挑取单菌落接种于lb液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)，培养15小时，离心收集菌体，裂解，按照常规方法提取质粒pet-9d。
1.3将目的基因rdcfp-10和resat-6与质粒pet-9d分别做bamhi和ncoi双酶切，将酶切的目的基因分别与质粒在t4dna连接酶作用下连接过夜(14-16℃)，得到重组质粒，按照常规方法转入bl21，大量制备重组质粒。
实施例2蛋白表达
将重组质粒转化大肠杆菌bl-21，接种卡那霉素抗性平板，随机挑取菌落接种lb培养基中，od值0.8时，加入iptg至0.4mmol/l诱导培养4-5小时，5000rpm离心15分钟收集菌体。
实施例3菌体破碎:
pb缓冲液彻底重悬实施例2收集的菌体，5000rpm离心30分钟，收集沉淀，再次重悬后，用高压均质破碎菌体，再次离心8000rpm，30分钟，收集上清。
实施例4目的蛋白纯化
离子交换法进行蛋白纯化(aktasource30q)，用20mmph7.0pb缓冲液平衡层析柱，流速4ml/min，上样品后继续用冲洗至基线平衡。然后再相同流速下，用1mnaclpb缓冲液0％-100％直线梯度洗脱，收取第一个蛋白峰。
实施例5重组变态反应原(tb-4s)试剂配制
重组结核杆菌rdcfp-10:esat-6变态反应原稀释液配方如下：吐温-80,0.0005％；pbs，0.01mol/l；ph7.2～7.4。将纯化的rdcfp-10按照浓度0.2μg/0.1ml配制成原液；将纯化的resat-6按照0.2μg/0.1ml浓度配制成原液；再在充分搅拌条件下将两种原液混合在一起，混合不分顺序，可以是将rdcfp-10原液加入resat-6中，也可以将resat-6加入rdcfp-10中，总之，每一种重组蛋白控制在0.1μg/0.1ml。变态反应原最优选的浓度是0.1μg/0.1ml，可选择的浓度范围可以是0.01μg/0.1ml～1μg/0.1ml。
实施例6tb-4s致敏效应试验
将tb-4s原液(0.2μg/0.1ml)测试致敏效应，实验组和对照组分别300～400g健康豚鼠各3只，实验组每只豚鼠皮内注射0.1mltb-4s含0.2μg重组蛋白，共3次，每次间隔5days，在第三次注射后15days，实验组和对照组每只豚鼠皮内注射0.1mltb-4s蛋白，连续观察3days，两组动物反应不应有明显区别。结果表明，重组结核杆菌tb-4s变态反应原为非致敏原。
实施例7效力试验
tb-4s的研究目标是未来替代现有的ppd结核菌素试剂，因此将tb-4s与常规临床使用的ppd试剂进行效力对比。将tb-4s分别稀释成每1ml含有10μg、5μg、2μg、1μg，对照品为50iu/ml的ppd，选取体重400～600g豚鼠，用结核杆菌致敏，于豚鼠背部脊柱两侧相对部位，分别皮内注射tb-4s和ppd各0.1ml，注射后24hr、48hr观察结果，测量过敏dth反应强度，用双盲法分别记录24hr和48hr局部硬结的纵径和横径，计算出平均硬结(纵横直径相加除2)，计算2天的总和，并计算累计值，求其比值，结果见表1：
表1tb-4s变态反应原效力试验
结果表明：0.2μg/0.1ml的dth反应强度与5iu/0.1mlppd一致。
实施例8tb-4s迟发型超敏反应试验
以市售ppd结核菌素和tb-4s两种变态反应原对分别建立的结核分枝杆菌活菌、结核分枝杆菌死菌以及bcg苗活菌致敏的豚鼠模型进行迟发型超敏反应试验，即皮肤试验，注射后48hr观察局部硬结，平均硬结的纵径和横径相加除以2不小于5mm作为阳性的判断标准，小于5mm判为阴性。结果见表2：
表2致敏豚鼠dth反应试验48hr结果
结果表明：tb-4s重组蛋白对bcg和结核分枝杆灭活菌致敏的豚鼠皮试呈阴性，而对结核病分枝杆菌活菌致敏的豚鼠皮试呈阳性反应，表明tb-4s具有非常好的特异性，能够诊断活动性结核，是一种筛查结核病潜伏感染的理想变态反应原。
从表2可以看出，由于结核分枝杆菌活菌带有rd1基因，毒力因子esat-6和cfp-10在分枝杆菌感染豚鼠时表达，而结核分枝杆菌死菌不表达esat-6和cfp-10，因此致敏后通过观测硬结反应可以区别是否感染结核杆菌，临床意义重大；bcg是没有毒性的牛结核分枝杆菌，rd1区域基因缺失，不表达esat-6和cfp-10蛋白，esat-6和cfp-10抗原与bcg的蛋白也没有交叉反应，因此可以区别体内是否接种了bcg疫苗。相比而言，市售的tb-ppd与bcg疫苗有共同的抗原，因此bcg致敏后tb-ppd接种的反应与结核分枝杆菌致敏的反应一致，表明tb-4s与tb-ppd相比特异性更好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>北京祥瑞生物制品有限公司
<120>结核分枝杆菌变态反应原组合物及其制备方法与应用
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