本发明涉及一种能抑制和杀灭革兰氏阴性菌的抗菌肽hv2及制备方法。
背景技术：
抗菌肽(antimicrobialpeptides,amps)是动物机体天然免疫系统抵抗外界病原体入侵清除机体内有害突变细胞的一类小分子多肽，其广泛存在于动植物体内各个组织器官中，抗菌肽主要生物学作用是其可杀灭包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌在内的多种细菌，具有抗菌广谱，杀菌速度快的特点。除了抑制和杀死细菌外，还具有抗真菌、抗病毒、抑制或杀伤肿瘤细胞、杀灭引起疟疾、利什曼病等疾病的寄生虫、抗原虫等作用。此外，抗菌肽的抑菌机理与抗生素不同，抗菌肽是通过物理渗透的方式作用于细菌的细胞膜结构，使细胞内溶物外泄从而杀死细菌，所以细菌不易对其产生耐药性。因此抗菌肽有潜力成为抗生素的替代药物。硫酸粘杆菌素又名硫酸粘菌素等，它是由多粘杆菌产生，对革兰氏阴性菌有较强的抗菌作用，用于治疗革兰氏阴性菌引起的肠道疾病。一直以来硫酸粘杆菌素作为饲料添加剂，添加到猪饲料中具有明显促生长作用。然而，中华人民共和国农业部公告第2428号规定，2016年11月1日起，饲料中禁止使用硫酸粘杆菌素预混剂，2016年10月31日(含)前生产的产品，可在2017年4月30号前继续流通使用。硫酸粘杆菌素的禁用导致人民迫切需要寻找一种专杀革兰氏阴性菌的抗菌剂。
技术实现要素：
基于以上不足之处，本发明提供一种能抑制和杀灭革兰氏阴性菌的抗菌肽hv2及制备方法。
本发明所采用的技术如下：一种能抑制和杀灭革兰氏阴性菌的抗菌肽hv2，其序列如序列表seqidno.1所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、一种制备如上所述的能抑制和杀灭革兰氏阴性菌的抗菌肽hv2的制备方法如下：
1)根据β-发卡结构对称性末端肽模板：rr(xy)2xdpgx(yx)2rr，x＝v；y是带正电荷氨基酸残基h，获得抗菌hv2；
2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂；将得到的肽树脂经过tfa切割；然后经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该抗菌肽hv2的制备。
2、如上所述的一种能抑制和杀灭革兰氏阴性菌的抗菌肽hv2在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
本发明的理论依据是：猪抗菌肽protegrin作为抗菌肽cathelicidin家族的成员，共分为5种，即protegrin1-5，最初从猪白细胞中分离得到。在5条protegrin系列肽中，protegrin-1(pg-1)具有典型β-发卡结构，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有较强的杀灭能力。另外，有文献研究表明基于β-发夹结构的对称性端肽，具有广谱的抗菌活性和较高的细胞选择性。本发明以“pg”为转角，联合疏水性氨基酸与带正电荷的氨基酸交替重复排列得到β-发卡结构的对称性末端肽模板：rr(xy)2xdpgx(yx)2rr，(x为i、v、w和f)。i、f、w和v均是疏水性氨基酸，其中f和w分别是芳香族氨基酸和杂环氨基酸具有代表性疏水性氨基酸，i和v为脂肪族氨基酸。y是带正电荷氨基酸残基h。此外，由于精氨酸可以与细菌细胞膜发生静电吸引作用使其与磷脂膜紧密结合有助于提高抗菌活性，所以在肽的对称末端添加两个精氨酸，以达到提高抗菌肽抗菌活性的目的。
本发明的有益效果是：对抗菌肽hv2进行抗菌和溶血活性检测，通过测定抗菌肽的最小抑菌浓度，发现hv2仅对革兰氏阴性菌起到抑菌的效果，包括大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌。而对于革兰氏阳性菌则没有抑菌效果，包括金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。通过对抗菌肽的溶血活性检测，发现hv2具有很低的溶血活性。因而，综合来看，hv2是一种具专杀革兰氏阴性菌的抗菌肽，具有较高应用价值。hv2对革兰氏阴性菌具有较高的治疗指数，其治疗指数是抗菌肽pg-1的4倍。
附图说明
图1为抗菌肽hi2的质谱图；
图2为抗菌肽hv2的质谱图；
图3为抗菌肽hw2的质谱图；
图4为抗菌肽hf2的质谱图；
图5为抗菌肽hv2的溶血活性测定图；
图6为抗菌肽的细胞毒性对比图。
具体实施方式
实施例1：
抗菌肽hi2、hf2、hw2和hv2的制备方法如下：
1)根据对称末端β-发卡抗菌肽模板：rr(xy)2xdpgx(yx)2rr(x为i、v、w和f)；y是带正电荷氨基酸残基h。设计获得抗菌肽hi2、hf2、hw2和hv2。
2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂；将得到的肽树脂经过tfa切割后，得到四条多肽；然后经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成多肽的制备；
hi2的氨基酸序列为：
hv2的氨基酸序列为：
hw2的氨基酸序列为：
hf2的氨基酸序列为：
实施例2
将实施例1的四个抗菌肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，
具体步骤为：抗菌肽的制备从c端到n端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将fmoc-x(x是每个抗菌肽的c端第一个氨基酸)接入到pro+2cl2树脂，然后脱去fmoc基团后得到x-pro+2cl2树脂；再将fmoc-y-trt-oh(9-芴甲氧羧基-三甲基-y，y为每个抗菌肽c端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从c端合成到n端，直至合成完毕，得到脱去fmoc基团的侧链保护的树脂；
在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀tfa(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷dmf(二氯甲烷)溶液，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用dmf溶液洗涤沉淀，hbtu(六氟磷酸酯)，nmm(n-甲基吗琳)，反应30分钟，真空干燥，得到多肽，再切割得到的粗品。
使用0.2mol/l硫酸钠(磷酸调节至ph7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，c18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相c18柱进一步纯化，洗脱液a为0.1％tfa/水溶液；洗脱液b为0.1％tfa/乙腈溶液，洗脱浓度为25％b～40％b，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；
抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图)与表一中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
表1抗菌肽的设计
注:dp是d型脯氨酸
对设计并合成得到的抗菌肽通过体外抑菌和溶血活性试验进行比较检测；
抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％bsa)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μl置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/ml)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。
检测结果见表2，通过表2可以看出，hv2对于革兰氏阴性菌表现出较强的抑菌活性。
表2抗菌肽的抑菌和溶血活性
溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1ml，肝素抗凝后溶解到2mlpbs溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用pbs洗涤3遍，再用10mlpbs重悬；取50μl红细胞悬液与50μl用pbs溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；lh后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μl红细胞加50μlpbs作为阴性对照；50μl红细胞加50μl0.1％tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。
检测结果见表2和图5。溶血浓度越大，表明溶血活性越小。hv2在检测范围内均没有溶血活性。
细胞毒性的测定：将液氮中保存的小鼠单核巨噬细胞raw264.7复苏后，分别培养于含有10％胎牛血清的dmem中，培养条件为37℃、5％co2、饱和湿度。每隔1天换一次培养液，细胞传代采用胰蛋白酶消化法。当细胞数长满培养瓶底80％-90％后，用pbs液洗涤细胞2次，加入0.25％的胰酶消化液2ml，于倒置显微镜下观察消化程度，当大部分细胞变圆，细胞间连接疏松，表明消化适度，此过程约3min；加入含胎牛血清的dmem或mem培养液终止消化，将消化液倒掉，在加入3ml左右的细胞培养液充分吹打细胞使其形成单细胞悬液。最终将稀释后的细胞悬液加入到96孔板中，每孔加入50μl，浓度大约为1×104cells/孔；待细胞贴壁后，分别加入含抗菌肽的培养液，使得抗菌肽在从第一到第十个孔中的终浓度呈现梯度变化。不加抗菌肽和细胞孔为阴性对照，加细胞而不加抗菌肽孔为阳性对照，继续培养20-24h。待培养到一定时间后，每孔中直接加入mtt50μl(5mg/ml)，培养4小时后加入150μldmso震荡10min以溶解晶体，用酶联免疫检测仪在492nm测定吸光度。试验重复操作三次。
检测结果见图6，肽作用后的细胞生存率越高，表明肽对哺乳动物细胞毒性越小；通过图6可以看出，随着抗菌肽浓度的提高，hv2对小鼠单核巨噬细胞生存率影响最小，在最大浓度浓度128μm时，其生存率接近70％，说明β-发卡抗菌肽hv2对哺乳动物细胞的毒性并不强。而随着抗菌肽浓度的提高，hw2、hf2和pg-1这3个抗菌肽使得哺乳动物正常细胞的生存率显著下降，细胞毒性越来越强。
以上结果显示，hv2对革兰氏阴性菌有着明显的抑菌效果，并且hv2在检测范围内均没有溶血活性。综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的细胞选择性。由表2可以看出，hv2对革兰氏阴性菌具有较高的治疗指数，其治疗指数是pg-1的4倍，是hw2的13.4倍。而且，细胞毒性试验证明hv2对哺乳动物细胞毒性很小。综合评价发现，hv2具有较高的细胞选择性，表明设计得到的抗菌肽hv2具有较高的替代抗生素的发展潜力。
序列表
<110>东北农业大学
<120>能抑制和杀灭革兰氏阴性菌的抗菌肽hv2及制备方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>16
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
argargvalhisvalhisvalproglyvalhisvalhisvalargarg
151015