本发明涉及猫ω干扰素，尤其涉及猫ω2干扰素突变体，本发明还涉及所述猫ω2干扰素突变体的制备方法及其在制备预防或治疗猫病毒性疾病的药物或试剂中的用途，属于猫ω2干扰素的制备及应用领域。
背景技术：
干扰素(interferon，ifn)是在特定的诱生剂的作用下，由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白，在本动物细胞中具有广谱抗病毒活性。目前已知干扰素并非直接杀伤病毒，而是通过诱导宿主本身的细胞产生多种酶来干扰病毒的基因转录或者病毒蛋白组分的翻译。干扰素根据产生的细胞来源不同、理化性质和生物学活性差异等方面可以分为ⅰ型和ⅱ型ifn；ⅰ型ifn主要包括ifn-α、β、ω、δ、κ、ε、ζ和τ等，ⅱ型ifn只有ifn-γ一种(cannaj.principlesofmolecularvirology.beijing：sciencepress，2006:177-178)。
目前已知的具有ω干扰素的物种有人、猫、马、羊、牛、猪、兔等。猫作为一种传统宠物在中国的养殖量非常大，其传染病尤其是猫瘟、猫传染性鼻气管炎和猫杯状病毒感染等病毒性疾病的发生越来越严重。目前还没有一种治疗病毒性疾病的特效药，迫切需要优质、廉价的猫干扰素产品上市，但目前猫干扰素的表达量不高，抗病毒活性不强。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种猫ω2干扰素突变体和猫ω11干扰素突变体，所述猫ω干扰素突变体具有高抗病毒活性；
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种利用家蚕杆状病毒表达系统制备所述猫ω2干扰素突变体或猫ω11干扰素突变体的方法；
本发明所要解决的第三个技术问题是提供所述猫ω2干扰素突变体或猫ω11干扰素突变体在制备预防或治疗猫病毒性疾病的药物或试剂中的用途。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种猫ω2干扰素突变体，其氨基酸序列为seqidno.2或seqidno.10所示。编码所述猫ω2干扰素突变体的基因，其核苷酸序列为seqidno.4、seqidno.5、seqidno.11或seqidno.12所示。
本发明还公开了一种猫ω11干扰素突变体，其氨基酸序列为seqidno.7所示。编码所述猫ω11干扰素突变体的基因，其核苷酸序列为seqidno.8或seqidno.9所示。
猫ω2干扰素突变前氨基酸序列为seqidno.1所示，其基因序列为seqidno.3所示；猫ω11干扰素突变前氨基酸序列为seqidno.6所示。
本发明经过对比猫ω干扰素13个亚型的基因序列及氨基酸序列，发现各个亚型的氨基酸组成有极小的突变，如氨基酸由p变为l，g变为a，a变为v等；猫ω干扰素2型和4型具有较高的抗病毒活性，比对氨基酸序列，发现这两个类型的ω干扰素的氨基酸序列在134-140的位置多出7个氨基酸(ratgege)，说明这7个氨基酸对猫ω干扰素的抗病毒表达有一定的促进作用；11型和8型具有较低的抗病毒活性，比对氨基酸序列，发现两个类型在125位的氨基酸由l突变为v，说明v有可能影响猫ω干扰素的抗病毒活性。基于上述比对结果，为了提高猫ω干扰素的抗病毒活性，本发明将ω2型氨基酸序列中与ω11相同的变化位点进行人工修正，并借鉴ω3的突变位点引入4个氨基酸的定点突变：r82q、p105l、v148a、g201a，得到的203个氨基酸的突变序列如seqidno.2所示；将氨基酸的突变序列经dnaworks逆翻译成核苷酸序列，其核苷酸序列如seqidno.4所示。
本发明进一步利用optimumgenetm技术对猫ω2型干扰素突变基因进行优化，根据生物反应器家蚕的密码子偏好性对基因序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的gc含量、cpg二核苷酸含量、密码子偏好性、mrna的二级结构、mrna自由能稳定性、rna不稳定性基序、重复序列等多种相关参数进行优化设计，有利于提高所优化基因在家蚕中的转录效率与翻译效率，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。为了提高在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了kozak序列aac，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为taa。此外，还去除了基因序列内部的bamhⅰ、ecorⅰ、smaⅰ等限制性酶切位点，在基因上游加上了bamhⅰ，在基因下游加上了xbai限制性酶切位点，获得的猫ω2干扰素突变优化基因序列为seqidno.5所示。
本发明还将原始猫ω2型干扰素进行多位点突变，将ω2型氨基酸序列中与ω11相同的变化位点进行人工修正，并借鉴ω3、ω4和ω13的突变位点引入10个氨基酸的定点突变：a12v、p27l、p62l、a78t、r82q、p103l、p105l、p142l、v148a、g201a，得到的203个氨基酸的多位点突变序列如seqidno.10所示；将氨基酸的多位点突变序列经dnaworks逆翻译成核苷酸序列，如seqidno.11所示。利用optimumgenetm技术对猫ω2型干扰素多突变基因进行优化，根据生物反应器家蚕的密码子偏好性对基因序列进行改造，多位点突变和优化后的核苷酸序列如seqidno.12所示。
本发明对猫ω11型干扰素按照ω2干扰素突变体一样的方法进行突变，对其引入4个氨基酸的定点突变：r82q、p105l、v141a、g194a，突变后猫ω11干扰素氨基酸序列如seqidno.7所示，核苷酸序列如seqidno.8所示。本发明进一步应用在线软件分析出成熟猫ω11干扰素突变基因中的稀有密码子，然后通过杆状病毒偏好密码子表，将成熟猫ω11干扰素基因中的稀有密码子全部同义替换为杆状病毒偏好性密码子，按照相同的方法在其5'端加入bamhi酶切位点和kozak序列，3'端加入xbai酶切位点，优化突变基因序列如seqidno.9所示。
本发明进一步公开了一种制备所述猫ω2干扰素突变体或猫ω11干扰素突变体的方法，包括以下步骤：
(1)分别将编码所述猫ω2干扰素突变体的基因或编码所述猫ω11干扰素突变体的基因克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体；
(2)将重组转移载体与杆状病毒dna共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；
(3)将重组杆状病毒感染昆虫细胞或昆虫宿主，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的蛋白，纯化，即得。
其中，所述的杆状病毒转移载体选自acrp23-lacz、acrp6-sc、acuwl-lacz、bacpak6、bactopac、bacmid、blucbacii(petl)、p2bac、p2blue、p89b310、pac360、pac373、pacab3、pacab4、pacas3、pacc129、pacc4、dzi、pacgp67、paciel、pacjpl、pacmlf2、pacmlf7、pacmlf8、pacmpl、pacmp2、pacrp23、pacrp25、pacrw4、pacsmag、pacuwl、pacuw21、pacuw2a、pacuw2b、pacuw3、pacuw31、pacuw41、pacuw42、pacuw43、pacuw51、pacvc2、pacvc3、pacyml、pacjcc5、pbacl、pbac2、pbluebaciii、pbluebachis、pev55、mxiv、pieineo、pjvetl、pjvnhel、pjvp10、pjvrsmag、pmbac、pp10、ppakl、ppbac、pshonex1.1、psynxivvi+、psynvi+wp、psynxivvi-、pvl1391、pvl1392、pvl1393、pvl941、pvl945、pvl985、pvtbac、pbm030或puac-5；优选为pvl1393；
所述杆状病毒选自家蚕杆状病毒亲本株bmbacmid、bmnpv、acmnpv、apnpv、hanpv、hznpv、ldmnpv、mbmnpv、opmnpv、slmnpv、semnpv或spltnpv；优选为家蚕杆状病毒亲本株bmbacmid；
所述昆虫宿主选自家蚕(bombyxmori)、野蚕(bombyxmandarina)、蓖麻蚕(philosamiacynthiaricim)、樟蚕(dictyoplocajapanica)、樗蚕(philosamiacynthiapryeri)、柞蚕(antheraeapernyi)、日本柞蚕(antheraeayamamai)、野天蚕(antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(atographacaliforica)、茶尺蠖(ectropisobliqua)、甘兰夜蛾(mamestrabrassicae)、斜纹夜蛾(spodopteralittoralis)、秋粘虫(spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(trichoplusiani)、行军虫(thaumetopoeawilkinsoni)、棉铃虫(heliothisarmigera)、美国棉铃虫(heliothiszea)、烟青虫(heliothisassulta)、烟草夜蛾(heliothisvirescens)、东方粘虫(pseudaletiaseparata)或舞毒蛾(lymantriadispar)；优选为家蚕(bombyxmori)；
所述感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体；优选为，将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含各种猫ω干扰素基因的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆；其中，所述的蛹最优为1-2天的早期嫩蛹。
本发明还公开了含有编码所述猫ω2干扰素突变体的基因或编码所述猫ω11干扰素突变体的基因的表达载体或宿主细胞。
本发明所构建的转移载体包括：含有猫ω2、9、11型干扰素基因和ω2突变基因原始序列的载体pvl1393-feifn-ω2、pvl1393-feifn-ω9、pvl1393-feifn-ω11、vl1393-feifn-ω11-m、pvl1393-feifn-ω2-m、pvl1393-feifn-ω2-mm；含有猫ω2、9、11型干扰素基因和ω2突变基因密码子优化后序列的载体pvl1393-feifn-ω2-o、vl1393-feifn-ω11-m-o、pvl1393-feifn-ω2-m-o、vl1393-feifn-ω2-mm-o。
本发明所获得的重组杆状病毒包括：重组家蚕核型多角体病毒rbmbacmid(feifn-ω2、feifn-ω9、feifn-ω11、feifn-ω11-m、feifn-ω2-m、feifn-ω2-mm)、rbmbacmid(feifn-ω2-o、feifn-ω11-m-o、feifn-ω2-m-o、feifn-ω2-mm-o)。
本发明将原始猫干扰素ω2(seqidno.3所示)、9、11基因和ω2突变基因序列(ω2-m，seqidno.4所示)在家蚕生物反应器中进行表达，应用微量细胞病变抑制法在crfk/vsv*gfp系统上检测蚕幼虫表达的猫ω型干扰素抗病毒活性。结果表明，添加重组猫ω干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力；在蚕幼虫体内表达的feifn-ω2有较为显著的抗病毒活性，效价达4.7×105u/ml，feifn-ω11的抗病毒活性只有2.3×105u/ml；feifn-ω2-m的抗病毒效价明显高于feifn-ω2，为6.8×105u/ml，说明通过基因点突变来提高feifn-ω抗病毒活性是可行和有效的。
本发明进一步将优化后的猫ω2干扰素基因(ω2-o，seqidno.13所示)和猫ω2干扰素突变优化基因(ω2-m-o，seqidno.5所示)基因在家蚕生物反应器中表达，westernblotting结果表明在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到19kda大小的特异性条带。抗病毒活性测定结果表明，优化的猫ω2干扰素基因和突变基因在蚕幼虫体内表达的feifn-ω2-o和feifn-ω2-m-o有较为显著的抗病毒活性，效价达分别达到6.5×105u/ml和9.2×105u/ml，而feifn-ω2的抗病毒活性只有4.7×105u/ml，通过突变可使feifn-ω2的抗病毒活性提高45％以上；通过优化可使feifn-ω2的抗病毒活性提高38％以上；通过对突变基因优化可使feifn-ω2-m的抗病毒活性提高35％以上；通过突变和密码子优化可使feifn-ω2的抗病毒活性提高96％以上，说明突变和优化的方法有效、实用，对提高feifn-ω2的抗病毒活性有较大的作用。
本发明还将猫ω2干扰素基因多位点突变基因(ω2-mm，seqidno.11所示)及多位点突变并优化基因(ω2-mm-o，seqidno.12所示)在家蚕生物反应器中表达，表达产物的抗病毒活性测定结果表明，在蚕幼虫体内表达的feifn-ω2-mm和feifn-ω2-mm-o有较为明显的抗病毒活性，效价达到6.3×105u/ml和8.2×105u/ml，但抗病毒活性的提高没有feifn-ω2-m的多，说明多位点的突变并不能大幅度的提高feifn-ω2的抗病毒活性，只有选择合适的位点突变才能提高feifn-ω2的抗病毒活性。
本发明将突变的猫ω11干扰素基因(ω11-m，seqidno.8所示)和优化的突变后猫ω11干扰素基因(ω11-m-o，seqidno.9所示)在家蚕生物反应器中表达，采用微量细胞病变抑制法在crfk细胞/vsv*gfp系统上检测到蚕血淋巴中猫重组ω11型干扰素具有抗病毒活性，feifn-ω11-m的效价为3.7×105u/ml，feifn-ω11-m-o的效价为4.5×105u/ml，比feifn-ω11有较大提高，但不如feifn-ω2高，说明对猫ω11干扰素基因进行相同突变也能起到提高抗病毒活性的作用。
本发明所述猫ω2干扰素突变体或猫ω11干扰素突变体能够应用于制备预防或治疗猫病毒性疾病的药物或试剂。其中，所述猫病毒性疾病包括：猫瘟、猫传染性鼻气管炎、猫杯状病毒感染、猫白血病毒感染、猫免疫缺陷病毒感染或水疱性口炎病毒感染。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明通过对比猫ω干扰素13个亚型的基因序列及氨基酸序列，对猫ω2干扰素引入4个氨基酸的定点突变，获得猫ω2干扰素突变体。本发明进一步对编码所述猫ω2干扰素突变体的核苷酸序列进行优化，并利用家蚕杆状病毒表达系统表达所述猫ω2干扰素突变体，所表达的猫ω2干扰素突变体的抗病毒活性大幅度提高。本发明对猫ω11干扰素进行相同的氨基酸定点突变也起到提高抗病毒活性的作用。本发明进一步对猫ω2干扰素引入10个氨基酸的定点突变并对突变基因序列进行优化，在家蚕生物反应器中表达，所获得的猫ω2干扰素突变体有较为明显的抗病毒活性，但抗病毒活性的提高没有引入4个氨基酸定点突变提高的多，说明只有选择合适的位点突变才能大幅度提高猫ω2干扰素的抗病毒活性。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna(肽核酸)、在反义技术中所用的dna类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(batzer等人,nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和cassol等人,(1992)；rossolini等人,molcell.probes8:91-98(1994))。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞。
术语“转染”指真核细胞由于外源dna掺入而获得新的遗传标志的过程。
附图说明
图1为重组质粒pvl-feifn-ωx的双酶切鉴定；其中，m：dna分子质量标准；ω2：重组质粒pvl-feifn-ω2双酶切产物；ω9：重组质粒pvl-feifn-ω9双酶切产物；ω2-m：重组质粒pvl-feifn-ω2-m双酶切产物；ω11：重组质粒pvl-feifn-ω11双酶切产物；-为阴性对照；
图2为细胞出现荧光的各种比例的情况；其中，a：干扰素抑制vsv病毒显示的荧光；b：vsv病毒感染对照组显示的荧光；c：部分细胞感染vsv病毒显示的荧光；
图3为重组质粒pvl-feifn-ω11-m和pvl-feifn-ω11-m-o的双酶切鉴定；其中，m：dna分子质量标准；1：重组质粒pvl-feifn-ω11-m双酶切产物；2：重组质粒pvl-feifn-ω11-m-o双酶切产物；
图4为重组质粒pvl-feifn-ω2-o和pvl-feifn-ω2-m-o的双酶切鉴定；其中，m：dna分子质量标准；1：重组质粒pvl-feifn-ω2-o双酶切产物；2：重组质粒pvl-feifn-ω2-m-o双酶切产物；
图5为重组猫ω2干扰素sds-page的结果；其中，m：dna分子质量标准；1：重组病毒rbmbacmid(feifn-ω2)表达产物；2：重组病毒rbmbacmid(feifn-ω2-o)表达产物；3：重组病毒rbmbacmid(feifn-ω2-m-o)表达产物；4：阴性对照；
图6为细胞病变比例对应的荧光图；其中，a，“-”：无细胞病变；b，“±”：几个细胞病变；c，“+”：20％～30％细胞病变；d，“++”：50％～60％细胞病变。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、试验材料与试剂
家蚕品种jy1为江苏科技大学蚕业研究所提供，亲本病毒bm-bacmiddna按照文献(专利申请号：201110142492.4，申请公布号cn102286534a)中所公开的方法构建；vsv-gfp病毒，转移载体pvl1393，e.coli菌株top10，bmn细胞，crfk细胞，均由中国农业科学院生物技术研究所保存和提供。
限制性内切酶、t4dna连接酶购自promega公司，脂质体购自invitrogen公司，dmem细胞培养基、胎牛血清为gibco公司产品。
有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书(josephetal.,分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯，等人，精编分子生物学指南，1998)；除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1猫干扰素ω2、9、11和ω2突变基因序列在家蚕生物反应器中的表达及检测
1、实验方法
1.1猫ω型干扰素基因的获取、合成和质粒的构建
1.1.1基因的获取
从ncbi上查找并获取feifn-ω2(genbank登录号：dq420221)、feifn-ω9(genbank登录号：dq420228)、feifn-ω11(genbank登录号：dq420230.1)的基因序列和氨基酸序列。
其中，猫ω2干扰素氨基酸序列为seqidno.1所示，其基因序列为seqidno.3所示；猫ω11干扰素氨基酸序列为seqidno.6所示。
经过对比猫ω干扰素13个亚型的基因序列及氨基酸序列，发现各个亚型的氨基酸组成有极小的突变，如氨基酸由p变为l，g变为a；猫ω干扰素2型和4型具有较高的抗病毒活性，比对氨基酸序列，发现这两个类型的ω干扰素的氨基酸序列在134-140的位置多出7个氨基酸(ratgege)，说明这7个氨基酸对猫ω干扰素的抗病毒活性有一定的促进作用；11型和8型具有较低的抗病毒活性，比对氨基酸序列，发现两个类型在125位的氨基酸由l突变为v，说明v有可能影响猫ω干扰素的抗病毒活性。基于上述比对结果，特意将ω2型氨基酸序列中与ω11相同的变化位点进行人工修正，并借鉴ω3的突变位点引入4个氨基酸的定点突变：r82q、p105l、v148a、g201a，得到的203个氨基酸的突变序列，如seqidno.2所示，标记为feifn-ω2-m，其基因序列为seqidno.4所示。
1.1.2基因序列的合成和质粒构建
用dnaman软件分析限制酶酶切位点，根据酶切位点分析结果以及转移载体pvl1393和puc57上的多克隆位点，在目的基因两端加入目的基因序列中不存在的限制酶酶切位点。依据分析结果在其5'端加入bamhi酶切位点和kozak序列，3'端加入xbai酶切位点，确定好的基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并插入puc57载体，形成质粒puc57-feifn-ω2、puc57-feifn-ω9、puc57-feifn-ω11和puc57-feifn-ω2-m。
1.2构建重组杆状病毒转移载体
用bamhi和xbai双酶切合成的质粒puc57-feifn-ω2、puc57-feifn-ω9、puc57-feifn-ω11和puc57-feifn-ω2-m，用t4dna连接酶将玻璃奶法回收的目片段与经过bamhi和xbai双酶切的灭活杆状病毒转移载体pvl1393连接，16℃反应8小时以上。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，用bamhi和xbai双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒送北京擎科生物技术有限公司测序，测序正确的质粒命名为pvl-feifn-ω2、pvl-feifn-ω9、pvl-feifn-ω11和pvl-feifn-ω2-m。
1.3重组质粒与亲本病毒的共转染
根据已有文献报道的方法进行bmn细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当bmn细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清tc-100培养基洗三次，再加无血清培养基。将重组质粒pvl-feifn-ω2、pvl-feifn-ω9、pvl-feifn-ω11和pvl-feifn-ω2-m与亲本病毒bm-bacmiddna用脂质体包埋20min后共转染已复苏的bmn细胞，进行细胞内同源重组。27℃培养5d左右，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒bm-bacmid(feifn-ω2)、bm-bacmid(feifn-ω9)、bm-bacmid(feifn-ω11)和bm-bacmid(feifn-ω2-m)，并进行病毒的纯化和扩增作为种子病毒。
1.4猫ω型干扰素在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105pfu/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％湿度的条件下培养，家蚕幼虫生长晚期，feifn-ω在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5猫ω型干扰素蛋白抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在crfk/vsv*gfp系统上检测蚕血淋巴中猫ω型干扰素的抗病毒活性。将状态良好的crfk细胞以3.0×105个/ml的密度接种于96孔培养板中。将已超声破碎并过滤除菌的蚕血淋巴用含70ml/l胎牛血清的dmem培养液配制成不同稀释度的溶液，将稀释好的样品按100μl/孔接种于已经铺满crfk细胞的培养孔内，每个稀释度和对照蚕血至少设4个复孔，同时设不加蚕血淋巴及vsv*gfp的细胞对照组和添加vsv*gfp的病毒对照组，于37℃、5％co2条件下培养18～24h。将稀释至100tcid50的vsv*gfp病毒，按100μl/孔加入已经吸弃上清液的培养孔内，置于37℃、5％co2条件下培养。在倒置荧光显微镜下观察，当病毒对照组各孔中大量细胞出现荧光，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，无荧光出现时，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。
2、实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pvl-feifn-ω2、pvl-feifn-ω9、pvl-feifn-ω11和pvl-feifn-ω2-m经bamhi和xbai双酶切，在1％琼脂糖凝胶电泳分离出2个片段，小片段分别在612bp、591bp、591bp和612bp，大片段与pvl1393大小相符，均为9607bp。电泳结果如图1所示。将酶切鉴定正确的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行核酸测序，用megaalign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明猫的ω型干扰素基因ω2、9、11和ω2-m已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和xbai之间。
2.2猫干扰素重组病毒的获得及重组产物的检测
应用微量细胞病变抑制法在crfk/vsv*gfp系统上检测蚕幼虫表达的猫ω型干扰素抗病毒活性。在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；病毒感染对照组中的细胞发生病变，几乎100％细胞出现荧光，添加重组猫ω干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力(图2)。根据猫ω型干扰素对crfk细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素的效价。检测结果列于表1，抗病毒活性测定结果表明在蚕幼虫体内表达的feifn-ω2有较为显著的抗病毒活性，效价达4.7×105u/ml，feifn-ω11的抗病毒活性只有2.3×105u/ml，feifn-ω9的抗病毒活性介于两者之间，为3.4×105u/ml，结果趋势与已报道的结果相同；feifn-ω2-m的抗病毒效价明显高于feifn-ω2，为6.8×105u/ml，达到了预期的效果，说明通过基因点突变来提高feifn-ω抗病毒活性是可行和有效的。
表1重组猫ω干扰素抗病毒活性的检测结果
实施例2突变和优化的猫干扰素ω11基因在家蚕生物反应器中的表达及检测
基于实施例1的比对结果，猫ω2干扰素基因突变有利于抗病毒活性的提高，为此，对猫ω11型干扰素基因按照ω2-m一样的方法进行突变。
1、实验方法
1.1猫ω11型干扰素基因的突变、优化和合成
从ncbi上获取feifn-ω11(genbank登录号：dq420230.1)基因序列及氨基酸序列，按照实施例1方法，对其引入4个氨基酸的定点突变：r82q、p105l、v141a、g194a，得到的196个氨基酸的突变序列如seqidno.7所示，推导出突变基因序列如seqidno.8所示。突变基因序列用dnaman软件分析限制酶酶切位点，根据酶切位点分析结果以及转移载体pvl1393和puc57上的多克隆位点，在目的基因两端加入目的基因序列中不存在的限制酶酶切位点。依据分析结果在其5'端加入bamhi酶切位点和kozak序列，3'端加入xbai酶切位点，基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并插入puc57载体，形成质粒puc57-feifn-ω11-m。
应用在线软件http://gcua.schoedl.de/分析出成熟猫ω11干扰素突变基因中的稀有密码子，然后通过杆状病毒偏好密码子表，将成熟猫ω11干扰素基因中的稀有密码子全部同义替换为杆状病毒偏好性密码子，经合成，得优化后的猫ω11-m干扰素基因，按照相同的方法在其5'端加入bamhi酶切位点和kozak序列，3'端加入xbai酶切位点，基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并插入puc57载体，形成质粒puc57-feifn-ω11-m-o。猫ω11优化突变基因序列如seqidno.9所示。
1.2构建重组杆状病毒转移载体
用bamhi和xbai双酶切合成的质粒puc57-feifn-ω11-m和puc57-feifn-ω11-m-o，用t4dna连接酶将玻璃奶法回收的目的片段与经过bamhi和xbai双酶切灭活的杆状病毒转移载体pvl1393连接，16℃反应8小时以上。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，用bamhi和xbai双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒送北京擎科生物技术有限公司测序，测序正确的质粒命名为pvl-feifn-ω11-m和pvl-feifn-ω11-m-o。
1.3重组质粒与亲本病毒的共转染
根据文献报道的方法进行bmn细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当bmn细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清tc-100培养基洗三次，再加无血清培养基。将重组质粒pvl-feifn-ω11-m和pvl-feifn-ω11-m-o与亲本病毒bm-bacmiddna用脂质体包埋20min后共转染已复苏的bmn细胞，进行细胞内同源重组。27℃培养5d左右，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒，并进行病毒的纯化和扩增作为种子病毒。
1.4猫ω型干扰素在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105pfu/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％相对湿度的条件下饲养，家蚕幼虫生长晚期，bm-bacmid(feifn-ω11-m)和bm-bacmid(feifn-ω11-m-o)在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5猫ω型干扰素蛋白抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在crfk/vsv*gfp系统上检测蚕血淋巴中猫ω型干扰素的抗病毒活性，操作方法同实施例1。
2、实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pvl-feifn-ω11-m和pvl-feifn-ω11-m-o经bamhi和xbai双酶切鉴定，经1％琼脂糖凝胶电泳分离出小片段都为591bp，大片段在9000bp以上，与pvl1393(9607bp)大小相符。电泳结果如图3所示。酶切鉴定正确的质粒进行核酸测序，用megaalign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明猫的ω11-m型干扰素基因和优化基因已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和xbai之间。酶切检测正确的质粒dna，送北京擎科新业生物技术有限公司测序，结果如seqidno.8和seqidno.9所示，得到的重组质粒命名为重组转移载体pvl-feifn-ω11-m和pvl-feifn-ω11-m-o。
2.2猫干扰素重组病毒的获得及重组产物的表达
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(fbs)培养基，用不含fbs的培养基洗三次，加1.5ml无fbs培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株bmbacmiddna，2μg重组转移质粒pvl-feifn-ω11-m、pvl-feifn-ω11-m-o和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μlfbs。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rbmbacmid(feifn-ω11-m、feifn-ω11-m-o)的筛选。接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×tc-100培养基(含20％fbs)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(feifn-ω11-m、feifn-ω11-m-o)。
将重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(feifn-ω11-m、feifn-ω11-m-o)感染正常生长的bmn细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rbmbacmid(feifn-ω11-m、feifn-ω11-m-o)。
2.3表达产物的检测
应用微量细胞病变抑制法在crfk/vsv*gfp系统上检测蚕幼虫表达的猫ω型干扰素抗病毒活性。在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现，病毒感染对照组中的细胞发生病变，几乎100％细胞出现荧光，添加重组猫ω干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力。根据猫ω型干扰素对crfk细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素的效价，结果如表2所示。结果表明在蚕幼虫体内表达的feifn-ω11-m和feifn-ω11-m-o有较为显著的抗病毒活性，效价达分别达到3.7×105u/ml和4.5×105u/ml，feifn-ω11的抗病毒活性只有2.3×105u/ml，基因突变可使feifn-ω11表达的抗病毒活性提高61％，对突变基因进行优化可使突变基因表达的产物抗病毒活性提高21％，突变和优化可使表达干扰素的活性比feifn-ω11提高96％以上，说明突变产生的作用要高于优化，突变和优化相结合可以大幅提高feifn-ω11的抗病毒活性。
表2重组猫ω干扰素抗病毒活性的检测结果
实施例3猫干扰素ω2基因的突变和优化及在家蚕生物反应器中的表达及检测
基于实施例1和2的结果，猫ω干扰素基因突变和优化有利于抗病毒活性的提高，为此将猫ω2型干扰素基因和突变基因按照实施例2的优化方法对ω2和ω2-m基因进行优化，具体方法如下：
1、实验方法
1.1猫ω2型干扰素突变基因的构建和ω2干扰素基因与突变基因序列的优化与合成
1.1.1猫ω2型干扰素突变基因的构建
本发明基于实施例1对猫ω干扰素13个亚型的基因序列及氨基酸序列的比对结果，为了提高猫ω干扰素在杆状病毒表达系统中的表达量，本发明将ω2型氨基酸序列中与ω11相同的变化位点进行人工修正，并借鉴ω3的突变位点引入4个氨基酸的定点突变：r82q、p105l、v148a、g201a，得到的203个氨基酸的突变序列如seqidno.2所示。将氨基酸的突变序列经dnaworks逆翻译成核苷酸序列，其核苷酸序列如seqidno.4所示。
1.1.2猫ω2型干扰素基因和突变基因序列的优化与合成
利用optimumgenetm技术对猫ω2型干扰素基因和突变基因进行优化，根据生物反应器家蚕的密码子偏好性对基因序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的gc含量、cpg二核苷酸含量、密码子偏好性、mrna的二级结构、mrna自由能稳定性、rna不稳定性基序、重复序列等多种相关参数进行优化设计，有利于提高所优化基因在家蚕中的转效率录与翻译效率，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。
为了提高在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了kozak序列aac，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为taa。此外，还去除了基因序列内部的bamhⅰ、ecorⅰ、smaⅰ等限制性酶切位点，在基因上游加上了bamhⅰ，在基因下游加上了xbai限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体pvl1393中。基因序列由生物科技公司人工合成，猫ω2干扰素突变优化基因序列，即ω2-m-o的基因序列如seqidno.5所示，ω2型干扰素基因进行优化后的序列，即ω2-o的基因序列如seqidno.13所示，并分别插入puc57载体，形成质粒puc57-feifn-ω，命名为pucs-feifn-ω2-o和pucs-feifn-ω2-m-o。
1.2构建重组杆状病毒转移载体
用bamhi和xbai双酶切合成的质粒puc57-feifn-ω2-o和puc57-feifn-ω2-m-o，用t4dna连接酶将玻璃奶法回收的目的片段与经过bamhi和xbai双酶切的灭活杆状病毒转移载体pvl1393连接，16℃反应8小时以上。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，用bamhi和xbai双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒送北京擎科生物技术有限公司测序，测序正确的质粒命名为pvl-feifn-ω2-o和pvl-feifn-ω2-m-o。
1.3重组质粒与亲本病毒的共转染
根据文献报道的方法进行bmn细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当bmn细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清tc-100培养基洗三次，再加无血清培养基。将重组质粒pvl-feifn-ω2-o和pvl-feifn-ω2-m-o与亲本病毒bm-bacmiddna用脂质体包埋20min后共转染已复苏的bmn细胞，进行细胞内同源重组。27℃培养5d左右，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒bm-bacmid(feifn-ω2-o，feifn-ω2-m-o)，并进行病毒的纯化和扩增作为种子病毒。
1.4猫ω型干扰素在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105pfu/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％相对湿度的条件下饲养，家蚕幼虫生长晚期，bm-bacmid(feifn-ω2-o)和bm-bacmid(feifn-ω2-m-o)在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5猫ω型干扰素蛋白抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在crfk/vsv*gfp系统上检测蚕血淋巴中猫ω型干扰素的抗病毒活性。操作方法同实施例1。
1.6westernblotting检测
将重组病毒感染的家蚕血淋巴用pbs(ph7.4)稀释10倍超声波破碎后，进行sds-page凝胶电泳，浓缩胶为5％，分离胶浓度为15％，再用半干转法，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，用pbst配制3％bsa封闭，原核表达的his-feifn-ω2蛋白免疫小鼠后的血清为一抗(1:1000稀释)，hrp标记的山羊抗小鼠igg为二抗(1:5000稀释)，最后用dab(二氨基联苯胺)显色，后用去离子水终止，检测结果。
2实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pvl-feifn-ω2-o和pvl-feifn-ω2-m-o经bamhi和xbai双酶切鉴定，经1％琼脂糖凝胶电泳分离出小片段都为591bp，大片段在9000bp以上，与pvl1393(9607bp)大小相符。电泳结果如图4所示。酶切鉴定正确的质粒进行核酸测序，用megaalign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明猫的优化的ω2型干扰素基因和突变优化基因已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和xbai之间。
2.2重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(feifn-ω2-o、feifn-ω2-m-o)的构建和获得
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(fbs)培养基，用不含fbs的培养基洗三次，加1.5ml无fbs培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株bmbacmiddna，2μg重组转移质粒pvl-feifn-ω2-o、pvl-feifn-ω2-m-o和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μlfbs。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rbmbacmid(feifn-ω2-o、feifn-ω2-m-o)的筛选。接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×tc-100培养基(含20％fbs)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(feifn-ω2-o、feifn-ω2-m-o)。
2.3重组病毒rbmbacmid(feifn-ω2-o、feifn-ω2-m-o)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(feifn-ω2-o、feifn-ω2-m-o)感染正常生长的bmn细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rbmbacmid(feifn-ω2-o、feifn-ω2-m-o)。
2.4westernblotting检测结果
westernblotting结果(图5)表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到19kda大小的特异性条带。
2.5表达产物抗病毒活性测定
利用细胞病变抑制法，在vero-vsv*gfp系统上测定表达产物的抗病毒活性(见图6)，操作方法和步骤如实施例1。根据猫ω型干扰素对crfk细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素的效价，结果见表3。结果表明优化的猫干扰素ω2基因和突变基因在蚕幼虫体内表达的feifn-ω2-o和feifn-ω2-m-o有较为显著的抗病毒活性，效价分别达到6.5×105u/ml和9.2×105u/ml，而feifn-ω2的抗病毒活性只有4.7×105u/ml，通过突变可使feifn-ω2的抗病毒活性提高45％以上；通过优化可使feifn-ω2的抗病毒活性提高38％以上；通过对突变基因优化可使feifn-ω2-m的抗病毒活性提高35％以上；通过突变和密码子优化可使feifn-ω2的抗病毒活性提高96％以上，说明突变和优化的方法有效、实用，对提高feifn-ω2的抗病毒活性有较大的作用。
表3重组猫ω干扰素抗病毒活性的检测结果
实施例4猫干扰素ω2基因多位点突变及在家蚕生物反应器中的表达及检测
基于实施例1、2和3的结果，优化可使猫ω干扰素抗病毒活性的提高20-40％，而突变可使其抗病毒活性提高40％以上，突变和优化可使抗病毒活性提高90％，为此本实施例将猫ω2型干扰素基因进行多位点突变，具体方法如下：
1、实验方法
1.1猫ω2型干扰素突变基因的构建和ω2干扰素基因与突变基因序列的优化与合成
1.1.1猫ω2型干扰素多突变基因的构建
本发明基于实施例1对猫ω干扰素13个亚型的基因序列及氨基酸序列的比对结果，为了提高猫ω干扰素在杆状病毒表达系统中的表达量，本发明将ω2型氨基酸序列中与ω11相同的变化位点进行人工修正，并借鉴ω3、ω4和ω13的突变位点引入10个氨基酸的定点突变：a12v、p27l、p62l、a78t、r82q、p103l、p105l、p142l、v148a、g201a，得到的203个氨基酸的多位点突变序列如seqidno.10所示。将氨基酸的多位点突变序列经dnaworks逆翻译成核苷酸序列，其核苷酸序列如seqidno.11所示。
1.1.2猫ω2型干扰素多突变基因序列的优化与合成
利用optimumgenetm技术对猫ω2型干扰素多突变基因进行优化，根据生物反应器家蚕的密码子偏好性对基因序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的gc含量、cpg二核苷酸含量、密码子偏好性、mrna的二级结构、mrna自由能稳定性、rna不稳定性基序、重复序列等多种相关参数进行优化设计，有利于提高所优化基因在家蚕中的转效率录与翻译效率，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。
为了提高在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了kozak序列aac，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为taa。此外，还去除了基因序列内部的bamhⅰ、ecorⅰ、smaⅰ等限制性酶切位点，在基因上游加上了bamhⅰ，在基因下游加上了xbai限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体pvl1393中。基因序列由人工合成，猫ω2基因多位点突变的核苷酸序列如seqidno.11所示，猫ω2基因多位点突变和优化后的核苷酸序列如seqidno.12所示，并插入puc57载体，形成质粒puc57-feifn-ω，命名为pucs-feifn-ω2-mm和pucs-feifn-ω2-mm-o。
1.2构建重组杆状病毒转移载体
用bamhi和xbai双酶切合成的质粒puc57-feifn-ω2-mm和puc57-feifn-ω2-mm-o，用t4dna连接酶将玻璃奶法回收的目的片段与经过bamhi和xbai双酶切灭活的杆状病毒转移载体pvl1393连接，16℃反应8小时以上。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，用bamhi和xbai双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒送北京擎科生物技术有限公司测序，测序正确的质粒命名为pvl-feifn-ω2-mm和pvl-feifn-ω2-mm-o。
1.3重组质粒与亲本病毒的共转染
根据文献报道的方法进行bmn细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当bmn细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清tc-100培养基洗三次，再加无血清培养基。将重组质粒pvl-feifn-ω2-mm和pvl-feifn-ω2-mm-o与亲本病毒bm-bacmiddna用脂质体包埋20min后共转染已复苏的bmn细胞，进行细胞内同源重组。27℃培养5d左右，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒bm-bacmid(feifn-ω2-mm，feifn-ω2-mm-o)，并进行病毒的纯化和扩增作为种子病毒。
1.4猫ω型干扰素在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105pfu/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％相对湿度的条件下饲养，家蚕幼虫生长晚期，feifn-ω2-mm和feifn-ω2-mm-o在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5猫ω型干扰素蛋白抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在crfk/vsv*gfp系统上检测蚕血淋巴中猫ω型干扰素的抗病毒活性。操作方法同实施例1。
1.6westernblotting检测
将重组病毒感染的家蚕血淋巴用pbs(ph7.4)稀释10倍超声波破碎后，进行sds-page凝胶电泳，浓缩胶为5％，分离胶浓度为15％，再用半干转法，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，用pbst配制3％bsa封闭，原核表达的his-feifn-ω2蛋白免疫小鼠后的血清为一抗(1:1000稀释)，hrp标记的山羊抗小鼠igg为二抗(1:5000稀释)，最后用dab(二氨基联苯胺)显色，后用去离子水终止，检测结果。
2、实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pvl-feifn-ω2-mm和pvl-feifn-ω2-mm-o经bamhi和xbai双酶切鉴定，经1％琼脂糖凝胶电泳分离出小片段都为591bp，大片段在9000bp以上，与pvl1393(9607bp)大小相符。酶切鉴定正确的质粒进行核酸测序，用megaalign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明猫的ω2-mm型干扰素基因和优化基因已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和xbai之间。
2.2重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(feifn-ω2-mm、feifn-ω2-mm-o)的构建和获得
接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(fbs)培养基，用不含fbs的培养基洗三次，加1.5ml无fbs培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株bmbacmiddna，2μg重组转移质粒pvlfeifn-ω2-mm、pvlfeifn-ω2-mm-o和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μlfbs。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒rbmbacmid(feifn-ω2-mm、feifn-ω2-mm-o)的筛选。接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×tc-100培养基(含20％fbs)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(feifn-ω2-mm、feifn-ω2-mm-o)。
2.3重组病毒rbmbacmid(feifn-ω2-mm、feifn-ω2-mm-o)在家蚕细胞中的扩增
将重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(feifn-ω2-mm、feifn-ω2-mm-o)感染正常生长的bmn细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rbmbacmid(feifn-ω2-mm、feifn-ω2-mm-o)。
2.4westernblotting检测结果
westernblotting结果表明，在重组病毒感染后蚕血淋巴样品的上清液中可检测到19kda大小的特异性条带。
2.5表达产物抗病毒活性测定
利用细胞病变抑制法，在vero-vsv*gfp系统上测定表达产物的抗病毒活性，操作方法和步骤如实施例1，根据猫ω型干扰素对crfk细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素的效价，结果见表4。结果表明优化的猫干扰素ω2基因和突变基因在蚕幼虫体内表达的feifn-ω2-mm和feifn-ω2-mm-o有较为明显的抗病毒活性，效价分别达到6.3×105u/ml和8.2×105u/ml，但抗病毒活性的提高没有feifn-ω2-m的多，说明多位点的突变并不能大幅度的提高feifn-ω2的抗病毒活性，只有选择合适的位点突变才能提高feifn-ω2的抗病毒活性。
表4重组猫ω干扰素抗病毒活性的检测结果
sequencelisting
<110>中国农业科学院生物技术研究所
<120>猫ω2干扰素突变体及其制备方法和应用
<130>bj-2002-1150306f1
<160>13
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>203
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