本发明属于分子生物技术领域,具体涉及大口黑鲈生长性状关联的SNP位点及其应用。
背景技术:
大口黑鲈(Micropterus salmoides L.),又称加州鲈,原产于北美洲,具有适应性强、生长快、病害少、耐低温、生长周期短以及味道鲜美等优点,是重要的淡水养殖鱼类之一。1983 年从台湾地区引种到广东省,现在全国大部分地区均有养殖。但是,引种30多年来,由于生产单位不注重亲本留种须遵守的操作规程,也没能定期从原产地补充和引进亲本,导致养殖大口黑鲈的遗传多样性降低,从而使生产性能也降低,主要表现在生长速度下降、饵料转化效率低、抗病力也大幅下降。其中,生长速度关系到大口黑鲈产量的高低,养殖效益的大小。大口黑鲈生长退化的趋势直接制约着大口黑鲈养殖业的发展。因此,改良大口黑鲈生长速度的工作非常重要。
挑选优质亲鱼是提高养殖鱼类生长速度的主要方法之一,其目的是为了改变养殖群体的遗传结构,使后代获得更快的生长速度、更好的抗病能力的遗传特点。在生产中,其传统方法是挑选个体较大、身体健壮的鱼作为留种亲本,即根据表型来决定亲鱼是否留种。这种方法方便、快捷、简单,但受人为因素影响很大,加上大口黑鲈属于肉食性为主的鱼类,掠食性强,饵料不足是会互相残食,致使其生长悬殊较大。如此可见,仅从表型判断大口黑鲈亲本质量往往达不到理想的效果。随着分子生物学和遗传学的发展,已涌现出很多种遗传标记,如AFLP、RAPD、SSR、SNP等标记,其中,SNP标记因分布广泛,适宜高通量自动化分析,遗传稳定,日益成为遗传育种研究中首选的遗传标记。若这些遗传标记能与生产性状相关联在一起,即可实现从DNA水平上进行选择育种,克服了传统方法受人为因素影响大的不利因素,提高了选择的准确性,并且可实现在早期鉴定出具有优良性状的个体,筛选出优良的后备亲本,从而缩短育种周期,加快育种进程。通过发现与大口黑鲈快速生长相关的分子标记,提高快长亲本的筛选效率。
技术实现要素:
本发明的目的之一在于提供一种与大口黑鲈生长性状相关的SNP位点。
本发明的另一个目的在于提供一种筛选快速生长大口黑鲈亲本的方法。
本发明所采取的技术方案是:
大口黑鲈HSC70-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述所述大口黑鲈HSC70-1的基因序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列,其第821 位S为碱基C或G,第2804位W为碱基A或T。
上述所述大口黑鲈HSC70-1基因序列在判断大口黑鲈生长快慢中的应用。
大口黑鲈生长速度相关的SNP位点,其位于HSC70-1基因序列SEQ ID NO:2所示的第 821位碱基、第2804位碱基。
上述所述SNP位点在判断大口黑鲈生长快慢中的应用。
上述所述SNP位点在筛选快速生长大口黑鲈中的应用。
一种筛选快速生长大口黑鲈的方法,检测大口黑鲈HSC70-1基因序列第821位碱基处的 SNP位点是否为CC纯合体,若是,则为快速生长的大口黑鲈;或者检测HSC70-1基因序列第2804位碱基处的SNP位点是否为TT纯合体,若是,则为快速生长的大口黑鲈。
进一步的,上述所述方法,包括如下步骤:
1)提取大口黑鲈DNA;
2)以提取得到的DNA为模板,PCR检测大口黑鲈HSC70-1基因序列第821、2804位碱基处的SNP位点是否分别为CC、TT纯合体。
进一步的,所述PCR检测的具体操作为,分别利用引物P1F和P1R、P2F和P2R对大口黑鲈DNA进行初次PCR扩增,得到初次PCR产物,
P1F:5'-TGAAGCCTACCTCGGAAAAGT-3'(SEQ ID NO.3),
P1R:5'-AGCATCCTTAGTGGCCTGGCGC-3'(SEQ ID NO.4),
P2F:5'-TCCACCAGCTTATCAGACTGT-3'(SEQ ID NO.5),
P2R:5'-GGTCAACCCTCCAAGTAACTT-3'(SEQ ID NO.6);
再将初次PCR产物分别用引物P1和P2进行延伸扩增,将所得产物经测序分析,确定大口黑鲈HSC70-1基因序列第821、2804位碱基处的SNP位点是否分别为CC、TT纯合体;
P1:5'-TTACTTAGCATAGCTCTGGACA-3'(SEQ ID NO.7),
P2:5'-CTGTAGGGGGTAACTGAAGGGT-3'(SEQ ID NO.8)。
进一步的,初次PCR扩增的反应体系为:
初次PCR扩增反应程序为:94℃预变性3min;94℃变性15s,56℃退火15s,72℃延伸 30s,24个循环;72℃延伸3min。
进一步的,延伸扩增的反应体系为:
延伸扩增反应程序为:96℃预变性1min;96℃变性10s,52℃退火5s,60℃延伸30s, 30个循环。
本发明的有益效果是:
(1)本发明将生产中保留CC和TT基因型的大口黑鲈亲本,去除其他基因型的个体,便可快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈的品种。该方法与传统的方法相比,具有目的性强,作用效果直接的优点,且操作简单、检测快速、检测成本低,便于广泛推广使用。
(2)本发明大大降低了大口黑鲈亲本筛选的盲目性,可以快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈个体。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1与大口黑鲈生长性状相关的SNP标记的获得
本申请研究发现,大口黑鲈热激蛋白HSC70-1(heat shock cognate protein 70)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,大口黑鲈HSC70-1基因编码区序列全长为3382bp(SEQ ID NO: 2),由8个外显子和7个内含子所构成。在大口黑鲈热激蛋白HSC70-1基因序列(SEQ ID NO: 2)的第821位和2804位分别发现一个SNP位点,经过Snapshot方法分型发现第821位碱基位置存在等位基因C和等位基因G,组成三种基因型CC、GC和GG;在第2804位碱基位置存在等位基因A和等位基因T,组成三种基因型AA、AT和TT。
本实验用于关联分析的样本数为430尾的随机群体为同一批繁殖、同池养殖,且采样时间一致,因此在建立模型时不考虑时间、环境及人工饲养条件的差异。大口黑鲈HSC70-1基因第821位、2804位处不同基因型在随机群体中频率分布分别见表1和2。其中,第821位的SNP位点为CC纯合体的基因型频率较低为7.21%,第2804位的SNP位点为TT纯合体的基因型频率较低,也为7.21%。
表1 大口黑鲈HSC70-1基因第821位点不同基因型在随机群体中频率分布
表2 大口黑鲈HSC70-1基因第2804位点不同基因型在随机群体中频率分布
SNP与性状的关联分析
大口黑鲈HSC70-1基因第821位、2804位处不同基因型个体间生长性状的多重比较结果分别见表3和表4。第821位的CC基因型个体测量的5个生长性状(体质量、全长、头长、体高、尾柄长)的平均表型值均高于CG型和GG型个体的均值,其中CC基因型个体分别与 CG和GG基因型个体在体质量和全长上存在显著差异(P<0.05)。第2804位的TT基因型个体测量的5个生长性状(体质量、全长、头长、体高、尾柄长)的平均表型值均高于AT型和 AA型个体的均值,其中TT基因型个体分别与AT和AA基因型个体在体质量和全长上存在显著差异(P<0.05)。
上述关联分析结果表明,本发明大口黑鲈HSC70-1基因的SNP位点所构成的基因型对体质量和全长性状有显著影响(P<0.05),基因型为CC和TT的个体的生长性状明显优于其他基因型的个体。
表3 HSC70-1基因第821位点不同基因型个体间生长性状的多重比较
表4 HSC70-1基因第2804位点不同基因型个体间生长性状的多重比较
从表1~4中的数据可知,HSC70-1基因序列(SEQ ID NO:2)的第821位和2804位的 SNP位点与大口黑鲈生长性状密切相关。通过检测大口黑鲈HSC70-1基因序列(SEQ ID NO: 2)的第821位处的SNP位点是否为CC纯合体,或者检测第2804位处的SNP位点是否为 TT纯合体,即可快速、准确地筛选出所需要的快速生长的大口黑鲈亲本。
实施例2一种筛选快速生长大口黑鲈的方法
利用上述的SNP位点对快速生长大口黑鲈亲本进行筛选,包括如下步骤:
(一)引物序列:
根据大口黑鲈热激蛋白HSC70-1基因序列设计了两对引物进行PCR扩增,设计并合成的引物如下:
P1F:5'-TGAAGCCTACCTCGGAAAAGT-3'(SEQ ID NO.3),
P1R:5'-AGCATCCTTAGTGGCCTGGCGC-3'(SEQ ID NO.4),
P2F:5'-TCCACCAGCTTATCAGACTGT-3'(SEQ ID NO.5),
P2R:5'-GGTCAACCCTCCAAGTAACTT-3'(SEQ ID NO.6);
引物预期扩增2条DNA带,即SEQ ID NO:9(大小为176bp)和SEQ ID NO:10(大小为222bp)。
(二)样品DNA提交(碱裂解法):
1、剪取待检测大口黑鲈鳍条10-20mg,装入干净的EP管中;
2、加入180μL的50mmol/L NaOH溶液,水浴20min(常温),期间震荡数次;
3、加入20μL的1mol/L Tris-HCL溶液(PH=8.0),充分涡旋震荡;
4、将样品管放入离心机12000rpm离心10min,吸取上清液,得大口黑鲈基因组DNA,备用。
(三)引物初次扩增的PCR体系:
初次PCR扩增的反应体系和扩增条件为:
(四)引物初次扩增的PCR扩增程序:
(五)对纯化的PCR产物进行单碱基延伸
使用Snapshot方法用初次获得PCR产物为模板,使引物延伸一个碱基在多态位点终止,在测序仪上检测,根据峰的颜色可知多肽位点的碱基是否为CC和TT。
延伸反应体系为:
延伸引物序列为:P1:5'-TTACTTAGCATAGCTCTGGACA-3'(SEQ ID NO.7)和P2:5'-CTGTAGGGGGTAACTGAAGGGT-3'(SEQ ID NO.8)。
延伸反应条件为:
(六)在测序仪上,对延伸产物大小及峰的颜色进行检测,确定待测亲本的HSC70-1基因序列第821位碱基处的SNP位点是否为CC纯合体,若是,则为快速生长的大口黑鲈;或者检测HSC70-1基因序列第2804位碱基处的SNP位点是否为TT纯合体,若是,则为快速生长的大口黑鲈。
本检测方法可以在10个小时内操作完成,并且可以同时对多个样本进行检测,能为接下来要进行的大口黑鲈优良品种选育和鉴定提供快速准确的检测结果。我们通过对优势等位基因的鉴定,是在DNA水平上对大口黑鲈种质质量的评估,目的性更强。用该方法检测一个样品所需的成本大约为3元,成本较低,适合推广使用。
综上所述,申请人研究发现,在大口黑鲈热激蛋白HSC70-1基因序列的C+821G位置和 A+2804T位置分别发现一个SNP,经过Snapshot方法分型发现在C+821G位置存在等位基因 C和等位基因G,组成三种基因型CC、GC和GG,在A+2804T位置存在等位基因A和等位基因T,组成三种基因型AA、AT和TT。在检测的随机群体实验中发现,两个SNP位点对体质量和全长性状有显著影响,其在821碱基位置和2804碱基位置基因型为CC和TT的个体的生长性状明显优于其他基因型的个体。因此,根据大口黑鲈热激蛋白HSC70-1基因序列设计引物,建立了有效地鉴定具有优良生长性状且遗传稳定的亲本。利用本方法将生产中保留CC和TT基因型的大口黑鲈亲本,去除其他基因型的个体,便可快速获得生长速度快且遗传稳定的大口黑鲈品种。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所
<120> 大口黑鲈生长相关的SNP位点及其应用
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 650
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Lys Gly Pro Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Ser
1 5 10 15
Cys Val Gly Val Phe Gln His Gly Lys Val Glu Ile Ile Ala Asn Asp
20 25 30
Gln Gly Asn Arg Thr Thr Pro Ser Tyr Val Ala Phe Thr Asp Ser Glu
35 40 45
Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn Gln Val Ala Met Asn Pro Thr
50 55 60
Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu Ile Gly Arg Arg Phe Asp Asp
65 70 75 80
Thr Val Val Gln Ser Asp Met Lys His Trp Pro Phe Asn Val Ile Asn
85 90 95
Asp Asn Thr Arg Pro Lys Val Gln Val Glu Tyr Lys Gly Glu Thr Lys
100 105 110
Ser Phe Tyr Pro Glu Glu Val Ser Ser Met Val Leu Thr Lys Met Lys
115 120 125
Glu Ile Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Lys Thr Val Asn Asn Ala Val Ile
130 135 140
Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ser Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp
145 150 155 160
Ala Gly Thr Ile Ser Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile Ile Asn Glu Pro
165 170 175
Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Lys Val Gly Ser Glu
180 185 190
Arg Asn Val Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser
195 200 205
Ile Leu Thr Ile Glu Asp Gly Ile Phe Glu Val Lys Ser Thr Ala Gly
210 215 220
Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Asn Arg Met Val Asn His
225 230 235 240
Phe Ile Ala Glu Phe Lys Arg Lys Tyr Lys Lys Asp Ile Ser Asp Asn
245 250 255
Lys Arg Ala Val Arg Arg Leu Arg Thr Ala Cys Glu Arg Ala Lys Arg
260 265 270
Thr Leu Ser Ser Ser Thr Gln Ala Ser Ile Glu Ile Asp Ser Leu Tyr
275 280 285
Glu Gly Val Asp Phe Tyr Thr Ser Ile Thr Arg Ala Arg Phe Glu Glu
290 295 300
Leu Asn Ala Asp Leu Phe Arg Gly Thr Leu Asp Pro Val Glu Lys Ser
305 310 315 320
Leu Arg Asp Ala Lys Met Asp Lys Gly Gln Ile His Asp Ile Val Leu
325 330 335
Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Ile Gln Lys Leu Leu Gln Asp
340 345 350
Phe Phe Asn Gly Lys Glu Leu Asn Lys Ser Ile Asn Pro Asp Glu Ala
355 360 365
Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala Ala Ile Leu Ser Gly Asp Lys
370 375 380
Ser Glu Asn Val Gln Asp Leu Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser
385 390 395 400
Leu Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Val Met Thr Val Leu Ile Lys Arg
405 410 415
Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Gln Thr Gln Thr Phe Thr Thr Tyr Ser
420 425 430
Asp Asn Gln Pro Gly Val Leu Ile Gln Val Tyr Glu Gly Glu Arg Ala
435 440 445
Met Thr Arg Asp Asn Asn Leu Leu Gly Lys Phe Glu Leu Thr Gly Ile
450 455 460
Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile
465 470 475 480
Asp Ala Asn Gly Ile Met Asn Val Ser Ala Val Asp Lys Ser Thr Gly
485 490 495
Lys Glu Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Lys Gly Arg Leu Ser Lys
500 505 510
Glu Asp Ile Glu Arg Met Val Gln Glu Ala Glu Lys Tyr Lys Ala Glu
515 520 525
Asp Asp Val Gln Arg Asp Lys Val Ser Ala Lys Asn Gly Leu Glu Ser
530 535 540
Tyr Ala Phe Asn Met Lys Ser Thr Val Glu Asp Glu Lys Leu Ala Gly
545 550 555 560
Lys Ile Ser Asp Glu Asp Lys Gln Lys Ile Leu Asp Lys Cys Asn Glu
565 570 575
Val Ile Gly Trp Leu Asp Lys Asn Gln Thr Ala Glu Arg Asp Glu Tyr
580 585 590
Glu His Gln Gln Lys Glu Leu Glu Lys Val Cys Asn Pro Ile Ile Thr
595 600 605
Lys Leu Tyr Gln Ser Ala Gly Gly Met Pro Gly Gly Met Pro Glu Gly
610 615 620
Met Pro Gly Gly Phe Pro Gly Ala Gly Gly Ala Ala Pro Gly Gly Gly
625 630 635 640
Ser Ser Gly Pro Thr Ile Glu Glu Val Asp
645 650
<210> 2
<211> 3382
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtctaagg gaccagcagt tggtatcgat cttgggacca cctactcctg tgttggtgtg 60
ttccagcatg gcaaagttga aatcatcgcc aatgaccaag gcaacaggac cacacccagc 120
tacgtggcct tcacagacag tgagaggctg atcggagatg cagccaagaa tcaggttgcc 180
atgaacccca ccaacacagt ctttggtaag tattaaacgg ggaaattgtg gtcttgtgtc 240
actcttgcct gcgtaaaatc aaacatttta tatatagtaa atagtaaaac gccttaaagt 300
ccaatactaa ctgcttataa agagactggc acctctgtcg gtggtaaaac agtaaagtct 360
tatctatgaa ctcgaggcaa gaatggaaca agactgaaat cttaagtggc cgtattaaac 420
aacttcctca ctgtgatgac gattttcctg ccattcgtag tttccaccag aggttgaaag 480
accaaagatg gcccaaatcc ttccttggat gtctgagtga tattcttaaa ggaagcccag 540
agcatattat attttttttc cattaaaccc taaactgtct tttgcagatg ccaaacgact 600
gattggccgc aggtttgacg acacagttgt gcagtcagat atgaagcact ggccatttaa 660
tgtcatcaat gataacaccc gccccaaggt tcaagttgaa tacaaaggcg agacaaagtc 720
cttctaccca gaggaggtct catctatggt gctgacaaag atgaaggaga ttgctgaagc 780
ctacctcgga aaagtatgtt acttagcata gctctggaca saactccaaa tataaaatta 840
tatgaagtga tgctaatttt tttcttattc ccttcaagac tgtcaacaat gctgtaatta 900
cggtacccgc ctacttcaac gactcccagc gccaggccac taaggatgct ggcacaatct 960
ctggcctcaa tgtcctgcgt atcatcaatg aaccaaccgc tgctgccatt gcctatgggt 1020
tggacaagaa ggtaaataaa actagaaaac ttccaattac acttgcatga tggccaatgt 1080
accatcttga attgaggtaa taaaacataa ctgagtagat tttaaatgtt actaacttaa 1140
tttcaggttg ggtctgaaag gaacgttctc atctttgatc ttggtggtgg caccttcgat 1200
gtttccatct tgaccatcga ggatggcatc tttgaggtca agtccactgc tggagatact 1260
catcttggcg gtgaggattt cgacaaccgc atggtcaacc acttcattgc agagttcaag 1320
cgcaagtaca agaaagacat cagtgacaac aagagagctg tccgtcgcct gcgcaccgct 1380
tgcgagaggg caaagcgcac cctgtcttcc agcacccagg ccagcattga aatcgactct 1440
ctgtacgagg gagtcgactt ctatacctca atcaccaggg ctcgctttga ggagctcaac 1500
gctgacctct tccgtggcac cctggaccct gtggagaagt cgctccgtga tgccaagatg 1560
gataaagggc agattcacga catagtgttg gtcggtggct ccactcgtat ccccaagatc 1620
cagaagctgc tccaggattt cttcaatgga aaggagctca acaagagcat caatccagat 1680
gaagccgtgg cctatggagc tggtaagtaa accaaacatt tccatccaat tagagctcta 1740
gatataaatt tctactgaga agtatttttg ttgaattgtt aagagattaa catgaaaaat 1800
atccaccttc agtccctttc aaaatctaac cagccgccct tatttacagc tgtccaggct 1860
gccatcctgt ctggtgacaa gtctgagaat gtccaggact tgctgctttt ggacgtcacc 1920
cctctctccc tgggaattga gaccgctgga ggtgtcatga ctgtcctgat caaacgtaac 1980
accactattc ctaccaagca gacgcagacc ttcaccacct actctgacaa ccagcctggt 2040
gtgctcatcc aggtgaggac gctggttgat ggggttcagt tgtttgtgca attcataatt 2100
ctaacagaat taacataatt ataaattcat ttcggggatg ttggagagac tgaagtgaca 2160
ttgcatacgt ccaacaggtt tatgagggcg agcgtgccat gacaaaggac aacaacctgc 2220
tgggcaagtt tgagctgacg ggcatccccc ctgctcctcg tggtgttccc cagatagagg 2280
tgacgtttga tattgatgcc aatggaatcc ttaatgtctc tgctgtagac aagagcactg 2340
gcaaggagaa caagatcacc atcaccaatg acaagggtac aaaaaagtct gcttaaccca 2400
aataccgctg cagtgtccca acaacggatg attaaatggt aatcttgcct gttttatgcc 2460
aggtcgtctc agcaaggagg acattgaacg catggtccaa gaagctgaga agtacagggc 2520
tgaagacgac gtccagcgtg acaaggtgtc agccaaaaat ggcctggagt cgtatgcttt 2580
caacatgaag tcgaccatgg aagatgaaaa gcttgctggc aagatcagtg atgaagacaa 2640
gcagaagatc ttggacaagt gcaacgagat tattggctgg ctggacaaga accaggtggg 2700
aattgttggt tttggaacct gtgatccacc agcttatcag actgtctatt cctgtctgct 2760
aagcgaattt agagatatat actgtagggg gtaactgaag ggtwggggtc tatatataca 2820
aacaaatatg tttctgagaa ggagaaaatg aacgataact gaaaatacgg taataaacta 2880
atttaacaaa catagccttc tgatctcagt ataggaaaaa tgcttaagtt acttggaggg 2940
ttgaccccag agttttgatt tttttcaaca tgcaaatgta taatttacta ggaagtaagc 3000
aatgggtcta ggattttgca ggtctgctaa acgtcatcag agaatggtga ttttatgtgt 3060
agacactatc gttttgtcag gctaaattat cctcatctgt gtttcaacaa tagcagagtt 3120
taaactgaac tgagtattaa ctgtcaatta attccaattg agaatatatg atttgatttg 3180
tttgtactag actgcagaaa aagatgaata tgaacaccag caacaagaac tggagagggt 3240
gtgtaacccc atcatcacca agctgtacca gagtggtggt gatgtgacag gtgggatgtc 3300
cagtggaatg ccaggcggat tccctggggc tggtggtgct ccagccgctg gaggatcctc 3360
tggaccaact tgtggagggg ga 3382
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgaagcctac ctcggaaaag t 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agcatcctta gtggcctggc gc 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tccaccagct tatcagactg t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtcaaccct ccaagtaact t 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttacttagca tagctctgga ca 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctgtaggggg taactgaagg gt 22
<210> 9
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgaagcctac ctcggaaaag tatgttactt agcatagctc tggacacaac tccaaatata 60
aaattatatg aagtgatgct aatttttttc ttattccctt caagactgtc aacaatgctg 120
taattacggt acccgcctac ttcaacgact cccagcgcca ggccactaag gatgct 176
<210> 10
<211> 222
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tccaccagct tatcagactg tctattcctg tctgctaagc gaatttagag atatatactg 60
tagggggtaa ctgaagggtt ggggtctata tatacaaaca aatatgtttc tgagaaggag 120
aaaatgaacg ataactgaaa atacggtaat aaactaattt aacaaacata gccttctgat 180
ctcagtatag gaaaaatgct taagttactt ggagggttga cc 222