一种生产水解过敏原的方法与流程

本发明涉及一种生产水解过敏原的方法，更精确地，涉及过敏反应原性减弱的水解过敏原。

生产水解过敏原的一般方法为WO 2008/000783 A1所揭示。该发明公开的方法包括了对不同的天然原料(如奶、毒素、鸡蛋、野草、青草、树、灌木、花、蔬菜、谷物、真菌等)进行提取、纯化、变性和水解的步骤。

然而，使用已知方法所进行的先进的实验研究表明，过敏原蛋白(allergen protein)的水解是复杂的，并且需要进一步的操作步骤以便完全地水解过敏原蛋白。

本发明的一个目的在于，克服现有技术中的至少一些缺陷，特别是提供一种来自天然过敏原的抗原，所述抗原相较过敏原粗提取物具有显著减弱的引发过敏反应的能力，却能激发B细胞和T细胞。

发明目的通过一种从过敏原生产水解过敏原的方法而得到解决，该方法包含以下步骤：

a)对包含过敏原蛋白(allergenic protein)的过敏原来源进行提取，从而形成提取物，

b)纯化所述提取物，以除去非蛋白组分，从而形成纯化的提取物，

c)使用第一变性剂对所述纯化的提取物进行变性，从而形成纯化的变性提取物，

d)精制所述纯化的变性提取物，以除去杂质，从而形成精制的变性提取物,

e)使用第二变性剂对所述精制的变性提取物进行变性，从而形成变性的过敏原混合物，和

f)对所述变性的过敏原混合物进行水解，从而形成所述的水解过敏原。

出人意料的是，已表明，经过两个变性步骤，过敏原蛋白可以被完全水解。

如本文所用，“提取”是用提取介质(包括水、缓冲液或有机溶剂)处理过敏原(来)源(allergen source)，以将可溶性成分与不溶性残留物分开。优选使用水性体系(包括至少50％的水)。

如本文所用，“变性”是蛋白失去其四级、三级和二级结构的过程，该术语尤其是指使用一种或多种变性剂进行处理。

步骤a)是提取步骤。

优选使用含水溶液进行提取。适合的盐为，例如但不限于：磷酸氢二钠、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、醋酸盐、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)和羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。

同样，与许多其他提取方式相比，优选提取介质的量相对较大，即为过敏原来源重量的至少20倍，优选其重量的100倍或更多。

在附图和实施方式中，提取物被称为为粗蛋白提取物。

步骤b)为纯化步骤。

对过敏原来源进行提取之后，即步骤a之后，提取物被纯化(步骤b)，以去除非蛋白成分，例如糖、磷脂、核酸等物质。

如糖、磷脂、核酸和同类物质。

提取物的纯化，可通过以下一种或多种操作进行：

-离子交换色谱步骤(包括阴离子交换色谱和阳离子交换色谱),

-分子(尺寸)排阻色谱步骤(也称为凝胶过滤)，

-沉淀步骤，

-疏水作用色谱(hydrophobic interaction chromatography)步骤，

-假亲合色谱和亲合色谱，和/或

-透析过滤(渗滤)。

在一优选实施方式中，使用离子交换色谱。其中，当使用阳离子交换剂时，负载溶液(loading solution)的pH值处于阳离子交换剂的酸性功能团的pKa值和具有提取物中蛋白的最低pKa值的蛋白的pKa值之间。当使用阴离子交换剂时，则pH值处于阴离子交换剂的碱性功能团的pKa值和具有构成提取物的蛋白质的最高pKa值的蛋白质的pKa值之间。

通过这个方法，所有蛋白与离子交换剂结合，而中性杂质以及具有与离子交换树脂相同电荷的杂质则被除去。

或者，可通过加入至少50％(w/v)硫酸铵，来沉淀所述的过敏原蛋白，更优选地，加入至少90％(w/v)硫酸铵。在一优选实施方式中,也可通过加入至少2％(w/v)三氯乙酸(TCA)，优选5％(w/v)，更优选至少10％(w/v)TCA，进行沉淀。

典型地，多种不同的蛋白会存在于纯化提取物的蛋白组分中。采用如SDS-PAGE并随后用密度测定等方法，可以容易测定纯化提取物中蛋白的相对量。

步骤c)为第一变性步骤。

作为下一个步骤(步骤c))，进行变性操作。所述变性剂优选为离液剂(chaotropic agent)、还原剂或它们的混合物。适合的离液剂为，例如尿素和盐酸胍。典型的还原剂为，例如，二硫苏糖醇，β-巯基乙醇，硫代甘油，三(2-羧乙基)膦(TCEP)及它们的混合物。

对于第一变性步骤，典型的pH值为7.0-11.0，优选地为7.0-10.0，更优选地为7.0-9.0。

优选地，变性在15-40℃(更优选20-37℃)下进行至少15分钟，优选至少30分钟，更优选地至少60分钟，。

在一优选实施方式中，用于变性的还原剂为DTT(二硫苏糖醇)。

适合的尿素浓度为3M或更高，优选4M或更高。适合的胍盐(guanidinium)浓度优选为2M，更佳地3M或更高。

步骤d)为纯化步骤。

作为步骤d)，执行进一步纯化。在一优选实施方式中，使用凝胶过滤法或透析过滤工艺。使用色谱，特别是尺寸排阻色谱是优选的。据信，通过步骤d)，进一步的纯化杂质可以从制剂中被去除，而所述的杂质是不与过敏原的蛋白组分共价结合且已通过步骤c)同蛋白分离开的杂质。

步骤e)为第二变性步骤。

在步骤d之后，进行第二(次)变性步骤(步骤e))。对于此变性步骤，使用第二变性剂，而所述第二变性剂可以与步骤c)的变性剂相同或具有不同组成。在一优选实施方式中，用于第二变性步骤的还原剂为TCEP。

优选地，第二变性步骤的pH值设定为1.5-9.0。优选地，所述pH接近于步骤f)所使用的选定的酶的最佳活性pH。在一优选实施方式中，所述pH低于7.0或低于5.0或低于3.0但优选高于1.0。优选地，变性在15-40℃(更优选20-37℃)下进行至少15分钟，优选至少30分钟，更优选地至少60分钟。

下一个步骤(步骤f))为水解步骤。

所述水解步骤典型地使用酶进行操作。适合的酶为，例如，胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶。可以在离液剂(优选尿素或盐酸胍)存在下进行水解步骤。水解时，尿素和盐酸胍的浓度应低于4M，优选低于3M。水解步骤也可在还原剂(优选TCEP)存在下进行。水解时，TCEP的浓度优选低于10mM。优选地，使用胃蛋白酶。更优选地，胃蛋白酶的使用pH范围为1.0–3.0。

步骤g)为对水解过敏原的纯化和挑选。

在下一步(步骤g))中，所述水解过敏原可以被纯化形成纯化的水解物，其中具体地，肽片段(典型地，分子量低于1,000道尔顿的片段)以及例如分子量高于10,000道尔顿的肽和/或蛋白的未水解片段被去除。因此，纯化水解物的肽包括了分子量在1,000-10,000道尔顿之间的肽。优选地，低于10％的肽的分子量高于10,000道尔顿并且低于20％的肽的分子量低于1,000道尔顿，从而使得70％，或更优选地80％肽的分子量在10,000道尔顿至1,000道尔顿之间。

用于去除大肽或小肽的合适方法为超滤和尺寸排阻色谱。同样，该尺寸排阻色谱可以在离液剂存在下进行操作，例如尿素、盐酸胍、乙二醇、异丙醇、以及它们的混合物。

优选地，通过尺寸排阻色谱和/或通过超滤进行水解肽的纯化。其中优选地在离液剂存在下进行所述尺寸排阻色谱步骤的操作，所述离液剂优选选自尿素、盐酸胍、乙二醇、异丙醇及它们的混合物。

所述水解物的一个优势是，所述肽是纯化变性蛋白的消化产物，其诱导即时过敏反应和同期炎症反应(co-inflammatory reactions)的能力下降了。

在本发明的优选实施方式中，过敏原的来源为天然来源，包括奶、毒素、鸡蛋、野草、草、树、灌木、花、蔬菜、谷物、真菌、水果、莓类、坚果、种子、豆、鱼、贝类和甲壳类生物、海产、肉类、香料、昆虫、螨、霉菌、动物、鸽蜱(pigeon tick)、虫、软珊瑚、动物毛皮屑、线虫、橡胶树及其混合物。

用于本发明的优选过敏原，具体地为草花粉、屋尘螨、桦树花粉和花生。

可选地，可使用合成的过敏原来源作为原料。合成过敏原来源是指生物技术生产的蛋白，例如重组蛋白和/或基因修饰的生物体。

在本发明的更优选的实施方式中，花生和屋尘螨(经纯化的螨)为过敏原的来源。

优选地，所述来源包括过敏原的混合物。

优选地，所述花生选自落花生属，优选地选自落花生种(hypogaea species)，更优选地，选自密枝种(hypogaea)和疏枝种(fastigiata)。亚种包括弗吉尼亚(Virginia)、西班牙(Spanish)、瓦伦西亚(Valencia)变种和/或杂交品种，如Runner品种、或甚至通过基因工程获得的转基因花生。

优选地，使用至少2个、优选使用3个种/亚种/变种/杂交品种和/或转基因花生的混合物。在一优选实施方式中，已经去除花生的红色种皮(花生皮)。

本发明的水解过敏原可用于制备用于诱导耐受性和脱敏的药物组合物和/或食物组合物。耐受性的诱导可用于治疗或预防过敏反应。

所述待治疗或预防的过敏反应，取决于过敏原的来源。即，通过使用来自花生的过敏原，来预防或治疗对花生的过敏；而对青草花粉的过敏，使用来自青草花粉的过敏原来治疗。

本发明的另一实施方式是包含本发明水解过敏原的药物组合物。此外，所述药物组合物可包含一种或多种下列物质：核苷三磷酸、核苷二磷酸、核苷单磷酸、核酸、肽核酸、核苷或它们的类似物、抑制免疫的细胞因子、诱导免疫蛋白酶体表达的化合物、1,25-二羟基维生素D3或它们的类似物、脂多糖、内毒素、热休克蛋白、硫氧还蛋白与NADPH或NADP-硫氧还蛋白还原酶、还原剂、二硫苏糖醇，肾上腺素受体激动剂如沙丁胺醇，肾上腺素受体拮抗剂如布托沙明(butoxamine)，调节黏着分子ICAM-1表达的化合物：、N-乙酰基-L-半胱氨酸、y-L-谷氨酰基-L-半胱氨酰-甘氨酸(还原型L-谷胱甘肽)、α-2-巨球蛋白、Foxp3基因表达诱导剂、黄酮类、异黄酮类，紫檀烷类化合物(pterocarpanoids)、芪类化合物(stilbenes)如白藜芦醇、速激肽受体拮抗剂、糜酶抑制剂(chymase inhibitors)、疫苗佐剂或免疫调节剂如CpG、氢氧化铝、磷酸钙、TLR-4激动剂(即MPL)和TLR-9激动剂或耐受原性(tolerogenic)佐剂如酵母多糖(zymosan)、β-1,3-葡聚糖、调控性T-细胞诱导剂、用于将颗粒粘附至肠粘膜内层的粘膜粘附剂如植物凝集素、锌、锌盐、多糖、维生素和细菌裂解物或显示表面连有抗体的颗粒。

在一优选实施方式中，所述药物组合物被制成用于皮下给药、经鼻给药、经表皮给药(epicutaneous administration)、淋巴内给药、口服给药、用于舌下给药或用于肠道施药。

本发明的另一实施方式为用本发明的方法制得的纯化的水解过敏原。

本发明的另一实施方式为使用三氯乙酸作为沉淀手段(沉淀剂)，从而沉淀过敏原蛋白。

附图说明

图1显示了花生粗提取物的SDS-PAGE蛋白图谱。4-12％Bis-Tris凝胶。泳道1和5：分子量标准；泳道2：Runner型的粗蛋白提取物(13μg)；泳道3：弗吉尼亚型的粗蛋白提取物(13μg)；泳道4：西班牙型的粗蛋白提取物(13μg)；泳道6：花生混合物的粗蛋白提取物(13μg)。用考马司亮蓝R-250进行染色。过敏原：过敏原1:±60kDa；过敏原2：±17kDa；过敏原3：2个亚基，±20kDa以及±40kDa；过敏原4:±37kDa。

图2显示了SEC G 25洗脱图。柱体积/样本体积比为7。树脂用2M尿素和0.1M Tris-HCl进行平衡(pH8.0，流速10ml/min)。洗脱后，在280nm处测吸光度。

图3显示了纯化的过敏原提取物的SDS-PAGE蛋白图谱。4-12％Bis-Tris凝胶。泳道1：分子量标准；泳道2：纯化的变性提取物(13μg)。用考马司亮蓝R-250进行染色。过敏原1：±60kDa；过敏原2：±17kDa；过敏原3：2个亚基，±20kDa和±40kDa；过敏原4：±37kDa。

图4显示了lgE Western印迹法测定的免疫反应性。泳道1：分子量标准；泳道2：纯化的变性提取物(13μg)。膜用2％(w/v)BSA进行封闭。将6位病人的血清样本混合物(pool)稀释至1/500。lgE的结合是用山羊抗人IgE抗体过氧化物酶偶联物(稀释至1/1000)进行检测，并用TMB底物进行显示的。过敏原1：±60kDa；过敏原2：±17kDa；过敏原3：2个亚基，±20kDa以及±40kDa；过敏原4：±37kDa。

图5显示了经两次变性处理后的蛋白的SDS-PAGE水解图谱。4-12％Bis-Tris凝胶。泳道1：分子量标准；泳道2：粗蛋白提取物(13μg)；泳道3：变性的过敏原混合物(13μg)；泳道4：水解的过敏原(26μg)。用考马司亮蓝R-250进行染色操作。

图6显示了一次变性处理的蛋白的SDS-PAGE水解图谱。4-12％Bis-Tris凝胶.泳道1：分子量标准s,泳道2：粗蛋白提取物(13μg),泳道3：变性处理一次的蛋白的水解物(26μg),用考马司亮蓝R-250进行染色操作。

图7显示了G 50SEC洗脱图。柱子用2M尿素,0.1M Tris-HCl(pH 9.5)进行平衡，流速10ml/min。柱体积/样本体积比为10。洗脱后，在280nm处测吸光度。

图8显示了纯化之前和之后的肽电泳图的比较。该分析用SDS-PAGE进行。4-12％Bis-Tris凝胶。泳道1：分子量标准；泳道2：粗蛋白提取物(13μg)；泳道3：变性的过敏原混合物(13μg)；泳道4：水解的过敏原(26μg)；泳道5：纯化的水解物(26μg)。用考马司亮蓝R-250进行染色操作。

图9显示了HPLC分析的校准曲线。10μl的下列标准品(1mg/ml)注射上样于BioSep-SEC S 2000柱：CytoChrom c(12kDa)、胰高血糖素(3.5kDa)、1kDa的合成肽。

图10显示了尺寸排阻HPLC图。柱：BioSep-SEC S 2000。洗脱缓冲液：50mM Na2HPO4、0.5％(w/v)SDS-pH 6.8。流速1ml/min。在215nm进行检测。注入10μl的样本。

图11显示了处于不同纯化阶段的屋尘螨蛋白的4-12％Bis-Tris还原性SDS-PAGE上的电泳图谱。泳道1：分子量标准；泳道2：来自屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的粗蛋白提取物；泳道3：用TCA沉淀后制得蛋白的图谱；泳道4：用TCEP进行二次变性后制得的纯化变性提取物；泳道5：用0.4Eu.Ph.U(欧洲药典单位)/100mg用量的胃蛋白酶进行水解的变性蛋白图谱；泳道6：用4Eu.Ph.U/100mg用量的胃蛋白酶进行水解的变性蛋白图谱。泳道7：用16Eu.Ph.U/100mg用量的胃蛋白酶进行水解的变性蛋白图谱。用考马司亮蓝R-250进行染色操作。

图12显示了花生肽的过敏原性下降。来自对花生过敏原过敏的花生过敏供体的混合血清样本的IgE与花生过敏原之间的结合反应，当用更大量的花生完整过敏原作预温育处理时，会比用花生过敏原肽受到更大的抑制作用。

图13a-d显示了用花生肽皮下免疫(在第0、3、7天进行1mg/注射)的Lewis大鼠中，IgG抗体应答的同种型情况，其中所述花生肽经不完全弗氏佐剂(v/v)进行乳化。该结果表示为均值±SD(n＝4)。

图14显示了对于剂量增加的花生肽(从6.25至100μg/ml)作出应答的Lewis大鼠的脾细胞增殖分析，其中所述大鼠事先用花生蛋白(100μg/注射)或花生肽(400μg或1mg/注射)进行皮下免疫。

图15显示了对于剂量增加的花生蛋白(从6.25至100μg/ml)作出应答的Lewis大鼠脾细胞增殖分析，其中所述大鼠事先用花生蛋白(100g/注射)或花生肽(400μg或1mg/注射)进行皮下免疫。

图16显示了用竞争性ELISA法，评价对抗体活性的封闭。将花生蛋白包被在微量滴定板上。花生过敏患者的混合血清与系列稀释的兔抗体稀释液进行混合，所述抗体是针对花生肽或花生蛋白。在温育后，结合于包被在板上的花生蛋白的IgE，用过氧化物酶标记的抗人IgE抗体进行检测。

本发明通过下列实施例进行更详尽的阐释。

实施例1：花生过敏原

花生过敏原的提取

三种花生种类的混合物(落花生(Arachis hypogaea)的Runner品种、弗吉尼亚品种和西班牙品种)，经去皮、碾碎和混合。将2％(w/v)的花生混合物加至磷酸钠(12.5mM)并在室温下搅拌温育1h。然后，通过添加2％(w/v)硅藻土(Celite)并通过0.45μm过滤器，对所述溶液进行澄清和过滤。该样品作为粗蛋白提取物。

通过Western印迹法，使用花生过敏患者的血清，分析该粗蛋白提取物中的过敏原是否存在。

如图1所示，该粗蛋白提取物中有四种主要的过敏原(过敏原1、过敏原2、过敏原3和过敏原4)。

花生过敏原蛋白的纯化

所述过敏原提取物经以下步骤进行纯化：

-三氯乙酸沉淀

该步骤的操作在室温(20-25℃)下进行。

在搅拌下，将10％(w/v)三氯乙酸加入所述产物。然后，沉淀提取物以10,000g离心15分钟。小心弃去上清液。

-第一次变性

沉淀物以25mg/ml浓度在8M尿素，0.1M Tris-HCl(pH8.0)中进行再悬浮，并加入80mM DTT。所述溶液于37℃下温育1h。

-在G25树脂柱(购自GE医疗公司的Fine Sephadex)上，进行尺寸排阻色谱

将所述的纯化的变性提取物立刻上样于柱上，并且所述蛋白用2M尿素，0.1M Tris-HCl(pH8.0)进行洗脱。

然后，通过在280nm处测定的吸光度，追踪蛋白的存在与否。将感兴趣的各洗脱组分合并，构成精制的变性提取物.

图2显示了SEC G25洗脱后，在280nm处测吸光度的图谱。

所述精制的变性提取物，用花生过敏患者的血清进一步进行SDS-PAGE和Western印迹的分析。

如图3所示，SDS-PAGE所显示的4种主要过敏原(见图1)，存在于纯化的变性提取物中。

图4显示了所有蛋白和特别是4种主要过敏原，被花生过敏患者血清所识别，并且之后被抗人lgE抗体所显现。

第二次变性:

将8M尿素和40mM TCEP加入精制的变性提取物。然后，pH调至2.5。该溶液于37℃下温育1h。

变性花生过敏原的水解

变性过敏原使用以下实验方案进行水解：

变性过敏原混合物用10mM HCl进行4倍稀释，并用6N HCl酸化至pH为2.0。使用6Eu.Ph.U/100mg蛋白的胃蛋白酶，于37℃下进行2h的蛋白水解。然后，通过用NaOH溶液升高pH至10.0，从而终止水解。

图5显示了粗蛋白提取物(泳道2)、变性的过敏原混合物(泳道3)和水解过敏原(泳道4)之间的比较情况。可以看到，经过两次变性的蛋白几乎全部被水解，因为仅有1条分子量高于10kDa的残余肽条带显现于图中。

相比较而言，图6，特别是泳道3，显示了经过一次变性的蛋白的情况。相应的水解物的图谱中显现了3条残余蛋白。此结果说明了进行二次变性的益处，因为当仅作一次变性时，水解是不够有效的。

水解的花生过敏原的纯化

为了去除分子量≥10000Da并且≤1000Da的肽，所述水解的过敏原通过下述步骤纯化：

-于G50树脂上(购自GE医疗公司的Fine Sephadex)进行尺寸排阻色谱。升高pH后，所述水解的过敏原快速加样于G50柱上。所述肽经2M尿素,0.1M Tris-HCl,pH9.5进行洗脱。所述洗脱液接着在280nm处测吸光度。合并包含肽(MW≤10kDa)的洗脱组分，如图7所示。

-在1kDa膜上进行透析过滤(购自PALL公司的超滤盒Omega PES)。所述肽经25倍浓缩、用10倍体积的50mM磷酸钠(pH7.6)透析过滤，且最终浓缩2倍。该样品作为纯化的水解物。

所述纯化的水解物经SDS-PAGE分析(见图8)。图谱(泳道5)显示了没有分子量高于10kDa的残余蛋白。

纯化的效率经尺寸排阻HPLC控制。BioSep-SEC S2000柱经50mM Na2HPO4、0.5％(w/v)SDS(pH6.8)，于流速1ml/min进行平衡。所述肽在215nm处进行检测。

10kDa和1kDa的限值，可用如图9例示的标准曲线进行计算。

如图10所示，分子量在1000Da和10000Da之间的肽，在纯化的水解物中所有肽中，占约80％。

实施例2：来自屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的过敏原

屋尘螨的蛋白提取

来自屋尘螨的蛋白,通过在搅拌条件和室温下,在磷酸盐缓冲液(pH7.4)中温育1h进行提取。所述溶液通过加入2％(w/v)硅藻土，并经过0.45μm的PVDF过滤器，进行澄清和过滤。该样本作为粗蛋白提取物。

所述粗蛋白提取物似乎显示了主要过敏原(Derp1和Derp2)，所述主要过敏原可依据其分子量(分别为25kDa和14kDa)进行定位。

来自屋尘螨的过敏原蛋白的纯化

纯化的操作如下：

·三氯乙酸沉淀

在搅拌下，将10％(w/v)三氯乙酸在室温下和5分钟内加至粗蛋白提取物。所述蛋白然后在10000g下离心20min进行收集。

·第一变性

除去上清液后，沉淀物在8M尿素，0.1M Tris(pH7-8)中进行再悬浮。所述溶液在将pH调至7.5并加入80mM DTT后，于37℃温育1h。

·G25树脂柱上进行尺寸排阻层析

将来自变性提取物的蛋白加样于柱上，并经2M尿素，0.1M NaCl(pH9.0)洗脱。

通过在280nm处测吸光度，检测蛋白的存在情况。

·第二次变性

通过在37℃，在4M尿素，0.1M NaCl和40mM TCEP(pH调至2.5)中温育1h，进行所述变性。

屋尘螨的变性过敏原的水解

变性蛋白混合物事先用10mM HCl稀释2倍并用6N HCl酸化至pH2.0。蛋白的水解，使用16Eu.Ph.U/100mg的胃蛋白酶，在37℃下进行1小时。

图11显示了处于在不同纯化阶段的屋尘螨蛋白，于4-12％的Bis-Tris还原性SDS-PAGE上的图谱。

泳道1：分子量标准；

泳道2：来自屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的粗蛋白提取物；

泳道3：TCA沉淀后获得的蛋白的图谱；

泳道4：在用TCEP进行第二次变性后获得的纯化的变性提取物；

泳道5：经0.4Eu.Ph.U/100mg的胃蛋白酶水解的变性蛋白的图谱；

泳道6：经4Eu.Ph.U/100mg的胃蛋白酶水解的变性蛋白的图谱。

泳道7：经16Eu.Ph.U/100mg的胃蛋白酶水解的变性蛋白的图谱。染色用考马司亮蓝R-250。

实施例3：

使用与实施例2类似的方法，制备青草和桦树花粉的水解过敏原。

实施例4：花生肽：过敏原性、免疫原性和封闭特异性抗体的能力

花生肽的过敏原性，用ELISA抑制分析法，通过对其体外IgE-结合特性进行分析而加以测定。

·大鼠进行免疫之后的T细胞增殖和特异性IgG-效价，被用于表征其免疫原性。

·产生的针对花生肽的抗体，其封闭活性用竞争性ELISA法进行评价。

花生肽的过敏原性：IgE与过敏患者血清的结合作用减弱

如ELISA抑制分析法所示，在体外，花生肽显示出减弱的过敏原性。

ELISA抑制分析法的原理为，测量来自过敏患者血清的IgE与花生蛋白结合量的减少情况，其中所述血清事先与数量增加的花生肽或花生蛋白进行温育。

Maxisorp 96孔微量滴定板如下进行包被：用0.8μg/ml的花生蛋白在0.1M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)于4℃放置过夜。在37℃下封闭1h后，各孔在4℃下与下列物质一起进行过夜温育：100μl事先用花生蛋白的系列稀释液(范围：1.25μg/ml至63.5pg/ml)或花生肽的系列稀释液(范围：50μg/ml至20ng/ml)进行处理(于37℃下进行1h)的花生过敏患者的血清合并混合物(稀释至1/50)。洗涤后，各孔与过氧化物酶标记的抗人IgE抗体温育，并通过与100μl的TMBS底物一起温育进行显色。用100μl的1M H3PO4进行中止反应，然后在450–650nm处测量吸光度值。

通过在花生肽或花生蛋白存在下进行预温育，实现的IgE结合作用的抑制百分比值计算如下：

抑制％＝100-[[被抑制样品的吸光度/阳性对照的平均吸光度]x 100]

阳性对照为50μl的混合人血清(稀释至1/25)，并与50μl的免疫前兔血清混合(n＝10)。

图12显示了花生肽的减弱的过敏原性。来自对花生过敏原过敏的花生过敏供体的混合血清的IgE与花生过敏原之间的结合反应，当用更大量的花生完整过敏原作预温育处理时，会比用花生肽受到更大的抑制。

花生肽的免疫原性：在大鼠中诱导特异性抗体

花生肽能激发人类免疫应答。

用在不完全弗氏佐剂中乳化的花生肽三次皮下免疫后的大鼠，产生显著水平的IgG。该花生肽混合物诱导了IgG1、IgG2a和IgG2b。

在第0日、第3日和第7日(D0,D3,D7)，一组4只7周龄大的雌性大鼠用1mg花生肽(以不完全弗氏佐剂乳化的乳剂(v/v))皮下施用进行免疫。

Maxisorp 96孔微量滴定板如下进行包被：用2μg/ml的花生蛋白在0.1M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中于4℃下过夜。在37℃下封闭1h后，各孔与100μl经处理的大鼠的连续稀释的血清(稀释度为1/200-1/437400)一起在37℃下温育1h。结合的大鼠IgG用稀释至1/20000的过氧化物酶标记的抗大鼠IgG抗体进行检测。IgG1、IgG2a或IgG2b用分别稀释至1/1500,1/500和1/500的生物素标记的抗体进行检测。与过氧化物酶-链霉抗生物素蛋白(1/200)进行温育后，显色反应通过添加100μl TMBS底物而开始。所述反应用100μl 1M H3PO4来终止，然后在450-650nm处测吸光度值。

结果显示为效价。它们被定为吸光度达到0.3时，大鼠抗血清的最大稀释倍数。

图13a-d显示了用花生肽(于D0、D3、D7进行1mg/注射)皮下免疫的Lewis大鼠中，IgG抗体应答的同种型情况，其中所述花生肽用不完全弗氏佐剂(v/v)进行乳化。该结果表示为均值±SD(n＝4)。

花生肽的免疫原性：刺激细胞免疫反应

花生肽能引发分离自事先用花生肽或花生蛋白进行免疫的大鼠的脾脏T细胞增殖。

将花生肽与纯化的花生蛋白进行比较，其中用基于胸腺嘧啶掺入量的细胞增殖测定法来比较它们刺激T淋巴细胞的能力。

该研究用七周龄大的雌性Lewis大鼠进行。

在D0、D3和D7时，用100μg与明矾混合(v/v)的花生蛋白，对4只大鼠进行腹膜内免疫。4只大鼠用400μg或1mg花生肽，进行皮下施用处理，其中采用以不完全弗氏佐剂乳化的(v/v)乳剂形式。

在第21天，处死所述动物，回收脾细胞。将细胞培养于补充有以下物质的RPMI 1640培养基中：10％(v/v)小牛血清,1％非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸盐、50μMβ-巯基乙醇、50U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10μg/ml庆大霉素、1mM HEPES(4-2-羟基乙基-1-哌嗪乙磺酸)(完全培养基)。

将细胞以2x10⁶/ml的密度(在完全培养基中)置于板上。抗原(亦在完全培养基中)以下述浓度进行使用：100,50,25,12.5,6.25μg/ml。所有培养进行于湿润的保温箱内(37℃，5％CO2)。增殖测定操作三次，在96-孔圆底的平板上进行4日，细胞以0.5μCi的[³H]-胸腺嘧啶/孔进行脉冲处理72h，12-16h后采集细胞并对β-放射性进行计数。

结果表示为如下计算的增殖指数：

·仅在培养基中培养的细胞(未经刺激的细胞)视作0％增殖。

·增殖指数＝测试孔cpm均值(三次测量的均值)/培养基处理细胞的cpm均值(三次测量的均值)。

图14显示了Lewis大鼠对于剂量增加的花生肽(6.25-100μg/ml)作出应答的脾细胞增殖试验，其中所述大鼠事先用花生蛋白(100μg/注射)或花生肽(400μg或1mg/注射)进行皮下免疫。

结果用三次刺激指数的均值±SD表示。

如图14所示，花生肽可诱导事先经花生蛋白免疫的大鼠的T细胞增殖。而且，无论培养基中的花生肽浓度为多少，当大鼠事先用不完全弗氏佐剂中的花生肽进行皮下免疫时，所述T细胞的增殖数更高。

对于每种剂量的花生肽，未经处理的大鼠未有显示任何相关的增殖。

图15显示了Lewis大鼠对于剂量增加的花生蛋白(6.25-100μg/ml)作出应答的脾细胞增殖试验，其中所述大鼠事先用花生蛋白(100g/注射)或花生肽(400μg或1mg/注射)进行皮下免疫。

图15显示了在纯化的花生蛋白的剂量增大的情况下，T细胞的增殖情况。虽然与来自经花生蛋白免疫的大鼠的T细胞相比水平较低，但纯化的花生蛋白仍可引发用花生肽皮下施用进行免疫的大鼠的T细胞产生特异性免疫应答。

未处理的大鼠未显示出任何相关的增殖，无论培养基的花生蛋白浓度为多少。

结果用三次刺激指数的均值±SD表示。

这些结果显示了，花生肽保留了与T细胞表位存在相关的生物活性，能够在免疫动物中激发特异性的免疫应答。

对产生的针对花生肽的抗体的封闭能力

以花生肽对兔进行免疫所诱导产生的免疫球蛋白，可抑制患者IgE与蛋白过敏原的结合。

兔抗花生肽抗体和抗花生蛋白抗体抑制花生过敏患者IgE抗体结合于过敏原的能力，通过ELISA竞争实验进行测定。

ELISA Maxisorp板(在37℃下用0.8μg/ml花生蛋白包被处理2小时),与连续2倍稀释的针对花生肽或花生蛋白的兔抗血清(最终稀释度为1/2至1/1024)(v/v)，在稀释至1/50的合并人血清(最终稀释液)的存在下，进行温育。过夜于4℃下温育后，结合的IgE抗体用1/8000稀释的过氧化物酶-偶联的多克隆的抗人IgE抗体进行检测。在450-650nm测定对应于结合IgE的吸光度值。通过在兔血清(抗花生肽或抗花生蛋白)存在下预温育获得的、IgE结合的抑制百分比计算如下：

抑制％＝100-[[抑制样本的吸光度/阳性对照的平均吸光度]×100]

阳性对照为50μl稀释至1/25的合并人血清，并与50μl免疫前兔血清混合(n＝10)。

图16显示了竞争性ELISA评价封闭抗体活性的结果。将花生蛋白包被在微量滴定板上。花生过敏患者的混合血清与系列稀释的兔抗体稀释液进行混合，所述兔抗体是针对花生肽或针对花生蛋白。在温育后，结合于包被在板上花生蛋白的IgE用被过氧化物酶标记的抗人IgE抗体进行检测。

综上所述，本发明获得的花生肽显示了有利于用于过敏免疫疗法(allergy immunotherapy)的特性。确实如此，其特征是减弱的过敏原性但同时保留了T细胞反应性。而且，这些过敏原衍生的多肽能诱导动物体内的免疫反应并产生具有封闭人IgE结合于过敏原能力的IgG抗体。