一种突变型猪圆环病毒2型病毒及应用的制作方法

本发明属于分子生物学与生物农业领域，具体涉及一种突变型猪圆环病毒2型病毒及应用。

背景技术：

猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，是目前已知在哺乳动物细胞中能够自主复制的最小病毒。病毒粒子无囊膜，直径为15-25nm，表现出二十面体的对称性。病毒粒子包含一条单链闭环DNA，其大小范围约为1.7至2kb。根据猪圆环病毒的抗原性及基因组序列的差异，猪圆环病毒被分为三个基因型，即猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)。PCV2于1998年从患有断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的猪体内被分离到。PCV2已被公认为是猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）最重要的病原体，是影响当今全球养猪业最重要的疾病之一，造成严重的经济损失。

据预测PCV2可能具有11个开放阅读框（ORF），其中ORF1、ORF5、ORF7和ORF10位于病毒正链上并按顺时针方向转录，而ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9和ORF11由互补链编码并按逆时针方向转录。目前被证实的只有ORF1-6六个开放阅读框，其余阅读框编码情况尚未得到证实。其中ORF1和ORF2是PCV2主要的开放阅读框，尽管PCV2基因组精简，但PCV2通过滚环复制的方式，病毒复制时先产生双链复制型中间体，此复制型中间体的两条DNA链都可以进行转录和蛋白表达，导致决定其致病性或毒力的特定遗传因素难以捉摸。

ORF1位于PCV2基因组的51-995bp位置，是PCV2最大的ORF。ORF1主要编码2种蛋白（Rep和Rep’），Rep和Rep’都是PCV2复制所必需的。Rep蛋白目前被认为是PCV2的重要免疫原性蛋白，其在细胞介导的免疫中起重要作用，通过限制PCV2复制并阻止PCV2的感染向PMWS发展。Rep蛋白作为PCV2复制的关键蛋白，其氨基酸序列十分保守。但对比大量PCV2a、PCV2b、PCV2d三种基因型 Rep蛋白氨基酸序列后，发现在3种基因型之间仍存在3个位点呈现规律性的变化，分别为第6位、第34位和第77位氨基酸上。这3个位点的改变是否会对病毒的复制和致病力产生影响目前尚不清楚，也没有相关研究报道。

因PCV2体外繁殖能力差，病毒感染细胞后增殖滴度低。这严重影响PCV2疫苗的规模化生产，且对PCV2灭活疫苗的免疫效果造成了一定影响。J. Li等报道（Differentiation of PCV1 and PCV2 by a multiplex real-time PCR assay. VETERINARY RECORD. 2013），在进行PCV2分离培养过程中经常遇到PCV2在PK-15细胞培养中污染PCV1，且发现污染后连续传代3-5代PCV1就会成为优势毒株，影响PCV2的复制。因此，需要寻找一种能够增强PCV2增殖能力的方法。

技术实现要素：

针对现有技术中的问题，本发明提供一种突变型的猪圆环病毒2型病毒，能够显著增强PCV2病毒在PK-15细胞内的复制能力，提高细胞培养液中病毒的滴度。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种突变型猪圆环病毒2型病毒翻译的重组蛋白质，是将PCV2 SD毒株Rep蛋白的第6位由丝氨酸（S）突变为天冬酰胺（N），包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。所述PCV2 SD毒株的GenBank登录号为JQ653449.1，核酸序列如SEQ ID NO: 2。

一种翻译上述突变型猪圆环病毒2型病毒重组蛋白的核酸序列。所述突变型核酸序列可以为GenBank登录号为JQ653449.1的PCV2 SD毒株Rep蛋白的第6位由编码丝氨酸（S）的密码子突变为编码天冬酰胺（N）的密码子的全长序列或者编码序列，还可以是上述序列进行密码子优化后的核酸序列。

一种含有上述核酸序列的重组质粒或杆状病毒，所述质粒的载体可以为pEASY-Blunt或pBluescript。优选的，重组质粒或杆状病毒含目的基因双拷贝。

一种含有上述核酸序列或重组质粒或杆状病毒的菌株或细胞系；如，DMT感受态细胞或T1感受态细胞等大肠杆菌、PK-15细胞细胞系、Sf-21昆虫细胞系。优选为PK-15细胞系。

一种上述重组蛋白质的抗体，所述抗体可以为多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体，如单链抗体。

上述核酸、重组质粒、含重组质粒的菌株或细胞系、重组蛋白质及其抗体在生产猪圆环病毒2型疫苗或检测试剂中的应用。

本发明具有以下优点：

本发明提供了一种能够增强PCV2d基因型毒株表达的核酸序列，并构建了目的基因的双拷贝重组质粒，进一步转染获得了表达重组蛋白的PK-15细胞系，其翻译的Rep蛋白的第6位由丝氨酸突变为了天冬酰胺。通过载毒量和一步生长曲线法试验了该突变能够显著增强PCV2d基因型在PK-15细胞内的复制能力，能够提高细胞培养液中病毒的滴度。传代到第10代仍可检测到PCV2d基因型的表达，且没有发生突变，能够进行稳定遗传。为PCV2疫苗的研制和高效工业化生产奠定了基础。

附图说明

图1为构建PCV2d基因型毒株双拷贝感染性克隆过程示意图；

图2为4种感染性克隆DNA测序结果；

图3为4种感染性克隆氨基酸对结果；

图4为IFA结果（200×）；

图5为病毒mRNA检测电泳图；

图6为传代8代后病毒DNA电泳图；

图7为细胞中病毒的qPCR检测结果；

图8为病毒一步生长曲线。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 PCV2d基因型及突变型双拷贝克隆的构建与拯救

采用本领域常规技术，将PCR扩增出PCV2全长序列，直接克隆进载体pEASY-Blunt，获得PCV2d基因型毒株（SD株，GenBank登录号：JQ653449.1）完整基因组片段的质粒pEASY-Blunt-PCV2，于-80℃下保藏备用。

参照徐胜男的方法（徐胜男, 时建立, 彭喆, 等. PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响[J]. 家畜生态学报, 2015, 36(04): 10-14）构建野生型、突变体双拷贝感染性克隆：

1. 引物设计

根据PCV2SD株的基因序列，设计用于双拷贝感染性克隆的构建及点突变的引物，序列如表1和表2所示，下划线为酶切位点；引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 构建双拷贝引物名称及序列

表2 定点突变引物名称及序列

2. 双拷贝感染性克隆的构建

以pEASY-Blunt-PCV2质粒为模板，利用引物P1、P2扩增A片段。产物使用XhoI及SacII限制性内切酶进行双酶切后用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，使用凝胶回收试剂盒回收大小为1700bp左右的目的片段，即A片段。以pEASY-Blunt-PCV2质粒为模板，利用引物P3、P4进行PCR扩增，产物使用BamHI及SacII限制性内切酶进行双酶切，胶回收1700bp左右的产物，即B片段。分别将重组质粒PCV2-D2F和pEASY-Blunt-PCV2使用XhoI、SacII限制性内切酶双酶切，胶回收大小约为3 900bp的片段，即载体片段C。将A片段用T4 DNA连接酶连入载体C中，连接后的产物转化到Trans1-T1化学感受态细胞中。然后使用质粒提试剂盒提取质粒，测序筛选的阳性克隆，即质粒D。将质粒D使用BamHI、SacII限制性内切酶双酶切，胶回收大小约为5700bp的片段，即载体片段E。将B片段用T4 DNA连接酶连入E载体片段中，连接后的产物转化到Trans1-T1化学感受态细胞中，挑取单菌落过夜培养，提取质粒。测序筛选的阳性克隆，命名为PCV2d。

突变体双拷贝感染性克隆的构建

以构建过程中的D质粒为模板，利用引物d-b-F、d-b-R进行定点突变扩增pEASY-Blunt-PCV2。PCR反应体系50μL：PrimeSTAR Max Premix（2×）25μL，上、下游引物（10μM）各1.5μL，模板DNA 200ng左右，ddH2O补足至50μL。PCR反应程序：98℃预变性2min；98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸8min。取5μL扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，目的条带大小约为5700bp。取PCR产物进行DpnI消化反应，以降解模板质粒DNA。将消化后的产物转化到DMT化学感受态细胞中，挑取单菌落过夜培养，提取质粒，测序筛选阳性克隆，获得质粒pEASY-Blunt-PCV2’。后续构建突变体双拷贝的方法同步骤2，经测序验证后的阳性克隆命名为PCV2d-6M。

构建的PCV2d基因型毒株及突变型双拷贝感染性克隆过程如图1所示，获得的DNA测序结果如图2所示，氨基酸序列如图3所示。结果表明，酸所对应的核苷酸碱基发生预期的改变：使PCV2d-6M Rep蛋白第6位由丝氨酸（S）突变为天冬酰胺（N），其它均未发生改变，说明成功构建了重组质粒。

病毒拯救

用0.25%的胰蛋白酶消化生长状态良好的PK-15细胞，使用含10%胎牛血清的DMEM稀释细胞使其达到2-3×10⁵个细胞/mL，接种至6孔细胞板，每孔2mL。置于细胞培养箱中培养。当细胞达到70%-90%融合度时，进行转染操作。使用Lipofectamine^® 3000试剂盒转染PCV2d、PCV2d-6M及空载体质粒，培养60h后的细胞液作为细胞液，然后按细胞液和营养液1:5的比例进行同步接毒，每次接种病毒24h后用300mmol/L D-氨基葡萄糖处理30min，以促进病毒的复制。之后换2%血清的病毒维持液，培养至72h，冻融收获细胞液。

将转染收获的3种细胞液接种到24孔板中，每孔500μL；72h后，弃去营养液，使用PBS洗涤3次；每孔加入4%多聚甲醛固定液，固定30min；然后使用PBS洗涤3次，每次静置2min。每孔加入0.2% TritonX-100 200μL，静置15 min，对细胞进行通透，协助染色；然后每孔加入配制的1% BSA液封闭30 min；用PBS洗涤3次，每次静置2min；加入按1:1000比例稀释的小鼠抗PCV2 Cap蛋白的单克隆抗体，室温孵育1h；使用PBS洗涤3次，每次静置2min。每孔加入按1:1000比例稀释的Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗室温孵育1h；使用PBS洗涤3次，每次静置2min；使用倒置荧光显微镜进行观察。结果如图3所示：拯救的2种不同的病毒都能观察到荧光信号，而转染了空载体质粒的PK-15细胞（M0CK）则没有特异性荧光染色，表明2种病毒拯救成功。

PCV2 ORF2编码病毒的蛋白外壳，是形成具侵染力的完整病毒所必须的。PCV2 ORF2在转录过程中，mRNA会发生特异剪接，剪接位点在nt361:1737。通过RT-PCR检测是否存在ORF2在转录过程中的mRNA以确定病毒拯救是否成功：用试剂盒提取RNA，然后去除基因组DNA，每个反应总体系为10μL：5×gDNA Eraser Buffer 2μL、gDNA Eraser 1μL、RNA 1μL、RNase Free dH2O补足至10μL。反应条件为42℃ 2min。反应完成后，将RNA使用反转录试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit反转录为cDNA。以引物5’-TCATCTAGAATAACAGCACTGGAG-3’和5’-TGCTGCTCTGCAACG GTCA-3’进行PCR，PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。通过RT-PCR检测病毒Cap基因的mRNA，2种病毒均检测到486bp的特异性条带，而表明Cap基因mRNA存在正常的特异性剪接和表达，表明2种病毒拯救成功。

实施例2 病毒遗传稳定性、病毒载量与体外复制能力测定

1. 遗传稳定性

将转染2种病毒的PK-15细胞传代到第10代，使用试剂盒提取病毒DNA，然后以引物5’-ATAAAGTGAAGTGGTATTTTGGTGC-3’和5’-GTCAAAGG ATATCGATCACAGAGTC-3’，PCR扩增PCV2基因一段496bp片段，每个反应总体系为20μL：2×Taq PCR StarMix 10μL、DNA模板 1μL、引物（10μM）各1μL、ddH2O补足至20μL。反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。取5μL PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示，目的条带约500bp。说明传代到第10代，病毒仍然存在，表明其可在PK-15细胞内进行稳定复制传代。然后以5’-ATCCACGGAGGAAGGGGGCCAGTT-3’和5’-GTGGAT TGTTCTGTAGCATTCTTCCA-3’为引物扩增PCV2全长序列。将PCR产物测序，结果显示序列与传代之前并未发生变化。

细胞中病毒载量

参考李俊（李俊, 丁鹏, 时建立, 等. SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立. 中国兽医杂志, 2010, 46(12): 24-26）的方法，使用qPCR对病毒第10代的混合液进行定量分析，合成qPCR引物：5’-ACGGAGTGACCTSTCTACTGCTG-3’和5’-TTVGTCTTCCAATCACG CTTCTGC-3’。总体系20μL：SYBR Pre mix Ex Taq（2×）10μL，引物各0.8μL、模板DNA 1μL、ddH2O补足至20μL。qPCR反应程序如下：预变性过程：95℃，30 s (升温速率 4.4℃/s)，1循环；PCR定量分析过程：95℃ 5 s (升温速率4.4℃/s)，60℃ 30 sec (升温速率2.2℃/s，获取模式：单点)，40循环；熔解曲线测定：95℃ 5 s (升温速率4.4℃/s)，60℃ 1 min (升温速率2.2℃/s)，95℃ (升温速率0.11℃/s，获取模式：连续，Acquisitions：5 per℃)，1循环，降温：50℃ 30 s (升温速率2.2℃/sec)，1循环。使用GraphPad Prism软件计算统计学显着性。P值<0.05被认为统计学上的显著性水平，P<0.01为差异极显著。结果如图7所示：PCV2d-6M组病毒载量高于PCV2d，差异显著。

病毒一步生长曲线

取每种病毒第10的病毒液，用含10%胎牛血清的细胞培养液将病毒液稀释，稀释度为10^-1-10^-6。分别接种到96孔板中，每孔100μL，每个稀释度做8个重复，并设立阴性对照。接种及后续免疫荧光的步骤同实施例1步骤4。每种病毒在接种后的第24h、36h、48h、60h、72h、84h通过观察荧光按照Reed-Muench法计算出病毒的滴度。使用GraphPad Prism软件中的单因素方差分析计算统计学显著性。P值<0.05被认为统计学上的显著性水平，P<0.01为差异极显著。

各病毒一步生长曲线如图8所示：2种病毒都在72-84h的时候表现出最高的滴度。而PCV2d-6M组病毒滴度高于PCV2d，差异显著(P<0.05)。

结合2种病毒qPCR定量和一步生长法数据分析，说明第6位氨基酸的突变可使PCV2d的复制能力增强。即第6位氨基酸S→N突变能够提高病毒的复制能力。这在提高病毒滴度生产疫苗等领域具有积极的作用。

序列表

<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种突变型猪圆环病毒2型病毒及应用

<130> 20190416

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 314

<212> PRT

<213> Porcine circovirus

<400> 1

Met Pro Ser Lys Lys Asn Gly Arg Ser Gly Pro Gln Pro His Lys Arg

1 5 10 15

Trp Val Phe Thr Leu Asn Asn Pro Ser Glu Asp Glu Arg Lys Lys Ile

20 25 30

Arg Glu Leu Pro Ile Ser Leu Phe Asp Tyr Phe Ile Val Gly Glu Glu

35 40 45

Gly Asn Glu Glu Gly Arg Thr Pro His Leu Gln Gly Phe Ala Asn Phe

50 55 60

Val Lys Lys Gln Thr Phe Asn Lys Val Lys Trp Tyr Phe Gly Ala Arg

65 70 75 80

Cys His Ile Glu Lys Ala Lys Gly Thr Asp Gln Gln Asn Lys Glu Tyr

85 90 95

Cys Ser Lys Glu Gly Asn Leu Leu Ile Glu Cys Gly Ala Pro Arg Ser

100 105 110

Gln Gly Gln Arg Ser Asp Leu Ser Thr Ala Val Ser Thr Leu Leu Glu

115 120 125

Ser Gly Ser Leu Val Thr Val Ala Glu Gln His Pro Val Thr Phe Val

130 135 140

Arg Asn Phe Arg Gly Leu Ala Glu Leu Leu Lys Val Ser Gly Lys Met

145 150 155 160

Gln Lys Arg Asp Trp Lys Thr Asn Val His Val Ile Val Gly Pro Pro

165 170 175

Gly Cys Gly Lys Ser Lys Trp Ala Ala Asn Phe Ala Asp Pro Glu Thr

180 185 190

Thr Tyr Trp Lys Pro Pro Arg Asn Lys Trp Trp Asp Gly Tyr His Gly

195 200 205

Glu Glu Val Val Val Ile Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Leu Pro Trp Asp

210 215 220

Asp Leu Leu Arg Leu Cys Asp Arg Tyr Pro Leu Thr Val Glu Thr Lys

225 230 235 240

Gly Gly Thr Val Pro Phe Leu Ala Arg Ser Ile Leu Ile Thr Ser Asn

245 250 255

Gln Thr Pro Leu Glu Trp Tyr Ser Ser Thr Ala Val Pro Ala Val Glu

260 265 270

Ala Leu Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Leu Val Phe Trp Lys Asn Ala Thr

275 280 285

Glu Gln Ser Thr Glu Glu Gly Gly Gln Phe Val Thr Leu Ser Pro Pro

290 295 300

Cys Pro Glu Phe Pro Tyr Glu Ile Asn Tyr

305 310

<210> 2

<211> 1767

<212> DNA

<213> Porcine circovirus

<400> 2

accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60

agaagagtgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120

cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180

ttgttggcga ggaaggtaat gaggagggcc gaacacccca cctacagggg ttcgctaatt 240

ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt tggtgcccgc tgccacatcg 300

agaaagcgaa aggaacagat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360

tgatagaatg tggagctcct agatctcaag gacaacggag tgacctctct actgctgtga 420

gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480

tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540

attggaagac gaatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggcaaa agcaaatggg 600

ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg 660

atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720

atgatctact gagactctgt gatcgatatc ctttgactgt tgagactaaa ggtggaactg 780

tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840

cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900

ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960

catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020

ttttattatt cacttagggt taagtggggg gtctttaaga ttaaattctc tgaattgtac 1080

atacatggtt atacggatat tgtagtcctg gtcgtatata ctgttttcga acgcagtgcc 1140

gaggcctaca tggtctacat ttccagtagt ttgtagtctc agccagagtt gatttctttt 1200

gttattgggt tggaagtaat cgattgtcct atcaaggaca ggttttgggg taaagtaccg 1260

ggagtggtag gagaagggct gggttatggt atggcgggag gagtagttta cataggggtc 1320

ataggttagg gcattggcct ttgttacaaa gttatcatct agaataacag cagtggagcc 1380

cactcccctg tcaccctggg tgattgggga gcagggccag aattcaacct taaccttcct 1440

tattctgtag tattcaaagg gcacagtgag ggggtttgag ccccctcctg ggggaagaaa 1500

atcattaata ttaaatctca tcatgtccac attccaggag ggcgttctga ctgtggtttt 1560

cttgacagta taaccgatgg tgcgggagag gcgggtgttg aagatgccat ttttccttct 1620

ccagcggtaa cggaggcggg ggtggacgag ccaggggcgg cggcggagga tctggccaag 1680

atggctgcgg gggcggtgtc ttcgtctgcg gaaacgcctc cttggatacg tcatcgctga 1740

aaacgaaaga agtgcgctgt aagtatt 1767