稳定的非典型猪瘟病毒亚单位蛋白及其疫苗和制备方法和应用与流程

本发明涉及一种非典型猪瘟亚单位蛋白及其制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。

背景技术：

2015-2017年欧美国家先后报道，仔猪先天性猪震颤(CT)现象，并分离鉴定该病毒为黄病毒科、瘟病毒属的一种非典型性猪瘟病毒(APPV)。2017年5月，在我国广东省也分离到该病毒。

非典型猪瘟病毒(Atypical porcine pestivirus，APPV)，主要造成先天性仔猪震颤(congenital tremor，CT)，即仔猪在出生数小时后，出现局部或全身性肌肉抽搐。到目前为止，仅有2个实验室分离得到该病毒，且病毒滴度很低。针对该病毒，目前并没有解析清楚，也不清楚该病毒哪一个蛋白具有良好的免疫原性。因此到目前为止，针对该病毒，还没有良好的疫苗进行防疫。所以，研究一种能够预防该疾病的疫苗是当下的首要任务，而在当下没有可能大规模制备灭活疫苗或弱毒疫苗的情况下，确定一种该病毒的免疫原性蛋白，以便研究一种能够预防该疾病的疫苗或具有能够预防该疾病的亚单位蛋白具有重大的意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种可以预防非典型猪瘟病毒感染的稳定的亚单位蛋白以及制备方法和应用。

为了解决该问题，本发明人在充分分析、研究目前所能得到的非典型猪瘟病毒的资料以及瘟病毒属相关病毒资料的基础上，并通过大量的实验验证，提出了一种具有良好免疫原性且稳定的非典型猪瘟病毒亚单位蛋白，所述亚单位蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。

为了能够产业化生产该亚单位蛋白，本发明人在充分分析、研究该亚单位蛋白的原始基因编码序列的基础上，提出了优化后的能够在CHO细胞中高效分泌表达该亚单位蛋白的基因序列，所述优化后的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明的技术方案，优先地，所述非典型猪瘟病毒亚单位蛋白包括在SEQ ID NO3中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有免疫原性的衍生的蛋白质。

根据本发明的技术方案，优先地，所述非典型猪瘟病毒亚单位蛋白的表达系统包括但不限于大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞以及昆虫细胞。

根据本发明的技术方案，优先地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。

根据本发明的另一方面，本发明又提供了一种使用CHO细胞高效分泌表达非典型猪瘟病毒亚单位蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)将SEQ ID NO.1所示的基因序列克隆到真核表达载体中得到含有非典型猪瘟病毒亚单位蛋白编码基因的重组质粒；2)再将含有非典型猪瘟病毒亚单位蛋白编码基因的重组质粒转染至CHO细胞中；3)通过培养、筛选、驯化2)中所述CHO细胞株得到高度表达的细胞株；4)发酵培养3)中所述的细胞株，纯化后得到非典型猪瘟病毒亚单位蛋白。

根据本发明的技术方案，优先地，所述真核表达载体为pEE12.4。

根据本发明的技术方案，优先地，所述CHO细胞为CHO-K1细胞。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种非典型猪瘟病毒亚单位蛋白的亚单位疫苗，所述非典型猪瘟病毒亚单位疫苗含有所述非典型猪瘟病毒亚单位蛋白和佐剂。

根据本发明的技术方案，优先地，所述非典型猪瘟病毒亚单位疫苗中非典型猪瘟病毒亚单位蛋白的用量为15～200μg/头份。

根据本发明的技术方案，优先地，所述非典型猪瘟病毒亚单位疫苗中非典型猪瘟病毒亚单位蛋白的用量为30～100μg/头份。

根据本发明的技术方案，优先地，所述非典型猪瘟病毒亚单位疫苗中非典型猪瘟病毒亚单位蛋白的用量为30μg/头份或60μg/头份。

根据本发明的技术方案，所述非典型猪瘟病毒亚单位疫苗中的佐剂可以为水包油佐剂(如ISA 15 VG等)或油包水佐剂(ISA 61 VG等)或水佐剂(铝胶佐剂、Montanide GEL 01佐剂、IMS 1313佐剂等)或水包油包水佐剂。

根据本发明的技术方案，优先地，所述非典型猪瘟病毒亚单位疫苗中佐剂为水包油包水佐剂，所述的水包油包水佐剂为ISA 201 VG佐剂。

本发明还提供了一种所述的非典型猪瘟病毒亚单位蛋白在非典型猪瘟病毒的预防和治疗中的应用。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种所述的非典型猪瘟病毒亚单位蛋白在非典型猪瘟病毒相关诊断试剂中的应用，优先地，将所述的非典型猪瘟病毒亚单位蛋白在Elisa抗体检测试剂中的应用。

本发明提供的非典型猪瘟病毒的亚单位蛋白具有良好稳定性和免疫原性，该亚单位蛋白在37℃处理20h时仍然稳定，在4℃保存10周时仍然稳定，这远远满足作为抗原时生产所需；该亚单位蛋白能够与非典型猪瘟病毒高免血清进行特异性结合(见实施例中Werstern Blot检测和Elisa检测)；且在免疫后，能够产生高滴度的抗体(二免后血清稀释100倍后OD450值高达3.5或以上)。本发明优先的制备该亚单位蛋白的方法是使用哺乳动物细胞(哺乳动物细胞能够对翻译后蛋白进行修饰，使其更接近于天然蛋白)，优先的哺乳动物细胞为CHO细胞，使用CHO细胞表达该亚单位蛋白具有产量高(发酵优化前能达到400-500mg/L)、易纯化(分泌表达，杂蛋白少，过一个简单的镍柱，SDS-PAGE纯度就能达到85％或以上)、免疫原性好(具有翻译后修饰，更接近于天然状态下的蛋白)、生产成本低等优点。

本发明提供了详细的非典型猪瘟病毒的亚单位蛋白的氨基酸序列，本领域的技术人员通过常规的技术手段，很容易在此序列的基础上制备衍生的蛋白质，所述衍生的蛋白质与本发明的亚单位蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO3所示)同源性能高达80％或以上，且具有同样的免疫原性功能，因此该衍生的蛋白质也落入本发明的保护范围之内。

本发明提供了详细的非典型猪瘟病毒的亚单位蛋白的基因编码序列，包括原始基因编码序列和优化后的基因编码序列，本领域的技术人员通过常规的技术手段，很容易实现在其他的表达系统中制备该亚单位蛋白，如大肠杆菌，酵母，其他哺乳动物细胞以及昆虫细胞等，虽然在表达产量上有一定的差异，因此使用其他的表达系统制备该亚单位蛋白的制备方法也落入了本发明的保护范围之内，除非是其他技术人员提出的表达方法能够使该亚单位蛋白的产量大大提供或者大量降低该亚单位蛋白的生产成本。

附图说明

图1表示预测的AE2蛋白的三维结构模式图。

图2表示AE2基因序列优化前后比对结果。

图3表示pEE12.4-OPTI-AE2质粒图谱。

图4表示pEE12.4-OPTI-AE2双酶切鉴定结果：M是DNA Marker：DL10000Marker；1是pEE12.4-OPTI-AE2双酶切电泳结果。

图5表示AE2蛋白的SDS-PAGE检测结果：1是AE2蛋白，2是Marker。

图6表示AE2蛋白和AE2蛋白去糖基化后的Werstern Blot检测结果：M表示Marker；1是阴性对照BSA蛋白，上样量为2μg；2是去糖基化之前的AE2蛋白，上样量为2μg；3是去糖基化之后的AE2蛋白，去糖基化时含量为2μg，去糖基化后全部作为样品进行WB检测。

图7表示AE2蛋白在37℃和4℃处理后第十次取样的Werstern Blot检测结果：M表示Marker；1是阴性对照BSA蛋白，上样量为2μg；2是37℃处理后的AE2蛋白，上样量为2μg；3是4℃处理后的AE2蛋白，上样量为2μg。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。

本发明试剂及药品的来源列单如下：

本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。

本发明试剂及药品的来源列单如下：

CHO-K1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；

细胞培养基和血清均购自美国Gibco公司；

真核表达载体pEE12.4购自上海林渊生物科技有限公司；

甲硫氨酸亚砜亚铵((L-methioninesulfoximine，MSX))购于Sigma公司；

BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；

糖苷酶F购自New England Biolabs(UK)Ltd；

HRP标记的羊抗猪IgG二抗购自EarthOx Life Science；

ISA 201 VG购自法国赛比克公司。

实施例1：非典型猪瘟病毒亚单位蛋白的选择和基因序列的优化

通过对非典型猪瘟病毒核苷酸序列(GenBank：KY624591.1)、猪瘟病毒序列(参见申请号为201710409930.6的中国发明专利)、牛病毒性腹泻病毒序列(参见申请号为201611239612.1的中国发明专利)进行比对分析，发现序列682L-941S很可能为非典型猪瘟病毒主要的抗原蛋白，暂命名为AE2蛋白(Atypical porcine pestivirus E2，AE2)，其中682L-700G可能为AE2蛋白的分泌信号肽，701S-911H可能为AE2蛋白的胞外区，912L-934L可能为AE2蛋白的跨膜区，935S-941S可能为AE2蛋白的胞内区蛋白。结合我们对猪瘟病毒E2蛋白和牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的表达研究的经验，我们选择CHO细胞表达AE2蛋白的胞外区作为我们的免疫原性蛋白，即701S-911H的氨基酸序列。我们通过蛋白结构预测和氨基酸本身结构的研究，发现C端末尾的4个氨基酸(908M-909Y-910R-911H)的侧链较大，可能会影响该蛋白的稳定性，且该段多肽也不是AE2蛋白的免疫原性位点，因此我们切除C端末尾的这4个氨基酸，表达剩余的氨基酸序列，即701S-907T的氨基酸序列。701S-907T的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码该段氨基酸序列的基因序列如SEQ ID NO.2所示，该段氨基酸序列预测的三维结构模式图如图1所示。

通过对上述分析预测的基因序列进行优化，以适合在CHO细胞中高效分泌表达，得到OPTI-AE2序列，如SEQ ID NO.1所示，该基因序列的人工合成工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

将优化后的序列(如SEQ ID NO.1所示)与优化前的序列(如SEQ ID NO.2所示)进行比对，结果如图3所示，共149/621＝24％不同。

实施例2：pEE12.4-OPTI-AE2重组质粒构建

2.1 PCR扩增目的片段OPTI-AE2

2.1.1 PCR反应

(1)引物设计及合成

上游引物:5’-GCAAGCTT GCCGCCACCATGAAGGGCAACCTGATC-3’

下游引物:5’-GCGAATTC TCAATGGTGATGGTGATGGTGGGTAGCGGC-3

(2)加样体系50μL，如下表所示：

PCR扩增程序：

2.1.2 PCR产物进行胶回收

(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；

(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；

(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；

(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；

(8)重复步骤(7)；

(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；

(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elution buffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；

(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。

2.2 PCR产物及载体双酶切反应

(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系

(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。

双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.2.1中PCR产物胶回收。

2.3连接反应

(1)准备洁净的1.5mL EP管若干，做好标记，置于EP管架上待用。

(2)在1.5mL EP管按照下表进行加样、混匀。

(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；

(4)取出步骤(3)中EP管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；

(5)取出步骤(4)中的EP管，置于4℃保存。

1.2.4转化反应

(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；

(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；

(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；

(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；

(6)观察转化结果。

2.5质粒抽提与双酶切鉴定

2.5.1质粒抽提

(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；

(2)将菌液移至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；

(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体；

(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；

(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中心加入30μL Elution buffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。

2.5.2双酶切鉴定

(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，按照下表进行加样：20μL反应体系

(2)将步骤(1)中的EP管20μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。

(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正

确；实验结果见图4，骨架大小约7,197bp，片段大小约2,266bp，质粒酶切正确。

(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。

2.6无内毒素质粒大提

2.6.1无内毒素质粒提取

(1)测序正确的克隆接种至100mL含氨苄抗性的培养基中，于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养15h；

(2)将步骤(1)中培养的菌液转移至50mL离心管中，室温8,000rpm/min、离心5min，收集菌体，弃掉上清培养基；

(3)向步骤(2)的离心管中加入8mL溶液P1，用移液器充分重悬菌体；

(4)向步骤(3)的离心管中加入8mL溶液P2，立即温和颠倒离心管6-8次，室温静置5min；

(5)向步骤(4)的离心管中加入8mL溶液P4，立即上下颠倒6-8次，充分混匀至溶液出现白色絮状沉淀，室温放置10min左右。8,000rpm/min室温离心5-10min，使白色沉淀离至管底；

(6)将步骤(5)中上清液全部小心移入过滤器CS1中，慢慢推柄过滤器，滤液收集在干净的50mL离心管中；

(7)柱平衡：向吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(8)向步骤(6)滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中。室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP6重新放入同一个收集管中；

(9)向步骤(8)吸附柱CP6中加入10mL漂洗液PW，室温8,000rpm/min离心2min，弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(10)重复操作步骤(9)一次；

(11)向步骤(10)吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉废液；

(12)将步骤(11)吸附柱CP6重新放回收集管中，室温8,000rpm/min离心5min。将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟晾干；

(13)将步骤(12)中吸附柱放入干净的50mL离心管中，在吸附膜中央加入1-2mL缓冲液TB，室温静置5min，室温8,000rpm/min离心2min，将50mL离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，测浓度，-20℃保存。

(14)取1-2μL所得到的质粒DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳并保存电泳结果数据。

实施例3：pEE12.4-OPTI-AE2重组质粒转染CHO-K1细胞与单克隆筛选的建立

3.1 CHO-K1细胞转染

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)、DMEM/F12与PBS置于37℃水浴锅预热至37℃。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mL PBS洗细胞一次，并弃去PBS。

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。

(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。

(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。

(6)用DMEM/F12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数。

(7)稀释细胞至2×10⁵个/mL，取2mL混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育过夜。

(8)取出步骤(7)细胞培养皿，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的DMEM/F12，2mL/孔。

(9)稀释质粒：用OPTI-MEM稀释质粒，125μL OPTI-MEM中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μL plus，混匀，室温静置5min。

(10)稀释Lipofectamine LTX：125μL OPTI-MEM中加入9μL Lipofectamine LTX，然后加入2.5μL plus，轻轻混匀，室温静置5min。

(11)将步骤(10)和步骤(11)混合物轻轻混匀。室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布。

(12)将六孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养4-6h。

(13)换液：弃掉上清培养基，加入2mL DMEM/F12(含10％血清1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。

3.2加压筛选

转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。

3.3单克隆筛选

(1)加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，约7days，开始单克隆筛选。

(2)取出六孔板，弃掉培养基，PBS洗一次，然后加入300μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。

(3)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。

(4)用DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)重新悬浮细胞，计数。

(5)铺板：稀释细胞至5个/mL，取200μL混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4-6h。

(6)记录单个细胞的孔。

(7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，加入100μL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL DMEM/F12(含10％血清+25μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，ELISA检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。

实施例4：CHO-K1细胞株驯化成悬浮培养

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)置于37℃水浴锅中预热至37℃。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mL PBS洗细胞一次，并弃去PBS。

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2mL 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。

(4)加入4mL DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)终止消化反应，并用移液枪将细胞吹散。

(5)将消化好的细胞转移至15mL离心管中，常温离心，200g，5min。

(6)用100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)悬浮细胞，计数。

(7)稀释细胞至5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。

(8)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。

(9)每隔24h计数细胞密度及活力。

(10)待第一代细胞培养一次后细胞存活率达到94-97％时进行第二代培养。

(11)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；100％DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)，EX-CELL 302置于CO2细胞培养箱中预热至37℃。

(12)从37℃培养箱中取出细胞转移至50mL离心管中，常温200g离心5min。

(13)将DMEM/F12(含10％血清，25μM MSX)和EX-CELL 302按1：1混合，重新悬浮细胞，计数。

(14)稀释细胞至5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。

(15)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。

(16)每隔24h计数细胞密度及活力。

(17)第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％。7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×10⁶个细胞/mL，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。接种密度降低到3×10⁵个/mL。

(18)经驯化，12F9株、12C11株都满足要求，这表明，12F9株、12C11株都驯化成功。

实施例5：细胞摇瓶发酵

(1)传代培养基的配制：60％的CD-CHO+40％的Ex-cell 302置于37℃水浴锅中预热至37℃。

(2)从CO2恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

(3)稀释实施例4得到的，12F9株、12C11株细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

(4)每隔24h计数细胞密度及活力，测葡萄糖，当血糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

(5)补料(约第四天)：补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％。

(6)第5天开始，将CO2培养箱温度调整至32℃。

(7)第九天，补充70g/L CB5，添加基础培养基的10％。

(8)第十二天，收获细胞。

实施例6：蛋白纯化

收集实施例5的细胞培养液(每批均约100ml)，4℃，8,000g离心30min，取上清，过0.8μm滤膜，上样，预留80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。

柱平衡：用超纯水平衡2～3CV(column volume柱体积)，排出乙醇保存液；然后用BufferA(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl)平衡2～3CV，4～7mL/min。

上样：若5mL预装柱一个，1mL/min进行上样(根据预装柱体积调节上样流速，保留时间5min)，收集Flow through(FT)，取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。

洗涤：用4％bufferB(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，20mM imidazole)洗柱，流速为4mL/min，把未结合上柱的蛋白和结合能力较弱的杂蛋白冲洗干净，至OD280nm基线平稳为止。

洗脱：50％bufferB(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，250mM imidazole)洗脱目的蛋白，至基线洗平，2mL/min,收集：10mL/管；收集样品混合后(Elutethrough-ET)取80μL样品加入20μL的5×SDS-样品缓冲液，用于SDS-PAGE检测。

洗涤：100％bufferB(20mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，500mM imidazole)，4mL/min，不收集，冲洗2-3个柱体积，至UV基线洗平。超纯水平衡2～3CV。保存HisTrap excel柱可用20％乙醇保存液平衡2～3CV。

透析换液：将含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用1×PBS透析至少1,000倍，取80μl留样检测。

除菌过滤：在生物安全柜中，过0.22μm低蛋白结合针头滤器，或大量蛋白溶液过灭菌的0.22μm滤膜的Nalgene的滤器，过滤好的蛋白溶液样品存放于-80℃冰箱。

蛋白浓度测定：采用BCA法测定蛋白浓度，该批蛋白浓度分别为1.2mg/ml、1.28mg/ml，体积均约为38ml；经过计算(蛋白得率＝蛋白浓度*蛋白体积/所取发酵上清体积)，12F9株、12C11株蛋白得率均约为400-500mg/L。

实施例7：AE2蛋白的鉴定

7.1 SDS-PAGE检测

将实施例6纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测，所用样品中AE2蛋白浓度为2μg/孔，结果如图5所示：从图中可以计算出，纯化后的AE2蛋白SDS-PAGE纯度为85％，分子量约为40kDa。

7.2 Werstern Blot检测

将实施例6纯化后的蛋白进行Werstern Blot检测，所用样品中AE2蛋白(图中标记为2)浓度为2μg/孔，BSA蛋白(图中标记为1)浓度为2μg/孔；所用一抗来源于非典型猪瘟病毒感染的猪只血清，稀释比例为1:100；二抗为HRP标记的羊抗猪IgG二抗，稀释比为1:5000。结果如图6所示：该血清能与AE2蛋白特异性结合，且不与阴性对照BSA结合。

7.3去糖基化检测

将实施例6纯化后的蛋白先用去糖基化酶处理：1)取9μl纯化后的AE2蛋白(约2μg)于200μl EP管中，加入1μl 10×糖蛋白变性缓冲液(商品化酶自带试剂)；2)100℃煮沸10min，使蛋白变性；3)加入2μl 10×G7缓冲液(商品化酶自带试剂)，2μl 10％NP-40(商品化酶自带试剂)，1-2μl PNGaseF(糖苷酶F)，补水使反应体系至20μl；4)37℃温育1h；5)反应结束后，加入5μl 5×loading buffer，煮沸10min，待用；

将上述样品进行Werstern Blot检测，所用样品中去糖基化之前的AE2蛋白(图中标记为2)浓度为2μg/孔，BSA蛋白(图中标记为1)浓度为2μg/孔，去糖基化之后的AE2蛋白(图中标记为3)为糖基化酶处理后的样品，上样时全部作为一个样品加入一个孔中进行WB检测；所用一抗来源于非典型猪瘟病毒感染的猪只血清，稀释比例为1:100；二抗为HRP标记的羊抗猪IgG二抗，稀释比为1:5000。结果如图6所示：AE2蛋白去糖基化后分子量约为27kD，比去糖基化之前小了13kD，这说明在CHO细胞中表达时AE2蛋白有约13/40*100％＝32.5％的糖基化；AE2蛋白去糖基化之后与血清的特异性结合比去糖基化之前要差，这说明糖基化在AE2蛋白的免疫原性中起了非常重要的作用，因此使用AE2蛋白作为免疫原时最好在哺乳动物细胞中表达。

7.4 Elisa检测

(1)包被：用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5)分别将纯化的AE2蛋白、BSA蛋白稀释至0.5μg/ml，每种抗原均包被8孔(4孔加血清样品，4孔加封闭液作为对照)，每种抗原均加入100μl/孔，封口膜封好后4℃冰箱放置过夜；

(2)洗涤：从冰箱取出酶标板后，用PBST洗板5次；

(3)封闭：每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶)，封口膜封好后37℃孵育2h；

(4)血清稀释：将非典型猪瘟病毒感染的猪只血清用封闭液稀释100倍(如495μl稀释液中加入5μl血清，混匀即可)；

(5)洗涤：同(2)；

(6)加样：加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37℃孵育1h；

(7)洗涤：同(2)；

(8)加二抗：每孔加入稀释(稀释比为1:5000)的HRP标记的羊抗猪IgG二抗100μl，37℃孵育0.5h；

(9)洗涤：同(2)；

(10)显色：避光条件下每孔加入100μl的TMB显色液，37℃孵育10min；

(11)终止：每孔加入50μl终止液(2M H2SO4)，终止反应；

(12)检测：于450nm波长测定样品OD值，分析数据；

(13)结果如下表所示：包被AE2蛋白的能与血清特异性结合，OD450均值为0.955，而包被BSA不能与血清特异性结合，OD450均值为0.05；包被AE2蛋白和BSA蛋白与封闭液均没有特异性结合，OD450均值为0.05。这说明，AE2蛋白可以作为Elisa试剂盒的抗原，在摸索合适的包被浓度和血清稀释比后，可以开发一种检测非典型猪瘟病毒感染和免疫的诊断试剂盒。

7.5稳定性验证

将实施例6纯化后的蛋白用PBS稀释到1mg/ml，共10ml，分成2份，每份5ml；一份置于37℃水浴锅中，每两小时取样一次，每次0.5ml，连续取样10次；一份置于4℃冰箱中，每周取样一次，每次0.5ml，连续取样10次；每次取样后用BCA检测蛋白浓度，结果如下表所示：

从蛋白浓度的变化来看，两组实验过程中蛋白基本保持稳定。为了进一步验证处理后的蛋白的免疫原性是否变化，我们用第十次的样品进行Werstern Blot检测，具体检测方法见7.2所述，具体结果如图7所示：其中M表示Marker；1是阴性对照BSA蛋白，上样量为2μg；2是37℃处理后的AE2蛋白，上样量为2μg；3是4℃处理后的AE2蛋白，上样量为2μg；从图中可以看出，处理后的样品(第十次取样)仍然具有良好的免疫原性。

实施例8：疫苗制备与免疫实验

8.1疫苗制备

水相准备：根据疫苗中AE2蛋白含量，使用PBS(或生理盐水)将AE2蛋白稀释适当浓度，即为水相；

油相准备：根据制备疫苗总量，按照抗原相和佐剂重量比为1:1，体积比为46:54，量取适量ISA 201 VG佐剂；

乳化：将水相和油相都预热到33℃，将水相缓缓加到油相中，200-500rpm搅拌20-30min，于20℃静置1h置于4℃过夜；

分装、贮存：根据需要进行分装，检合格后于4℃保存备用。

8.2疫苗质检

物理性状采用眼观的方法观察外观(是否是乳白色乳剂)；

采用清洁吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，观察(除第1滴外)，疫苗应为云雾状扩散，判定为水包油包水剂型；

将疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应≤0.5mL，判为稳定；

使用粘度仪对疫苗进行粘度检测，应在20-50cp，判为合格。

8.3免疫实验

为了摸索合适的抗原含量，使用ISA 201 VG佐剂做了不同抗原的疫苗(具体制备方法参见8.1和8.2)，具体疫苗信息如下表所示：

筛选30头30日龄左右的仔猪(APPV抗原阴性、抗体阴性)，随机分成6组，每组5头，组1-组5分别免疫疫苗1-疫苗5，组6不免疫作为对照组，每组每次于颈部肌肉注射1ml疫苗。在免疫后第21天以相同途径和剂量进行二免，在一免后及二免后观察猪只是否有异常，并分别采集免疫前、二免前、二免14天血清检测抗体效价。

在一免后观察的21天内和二免后观察的14天内，所有猪只体温正常，也无其他异常，因此该5批疫苗均是安全的。使用Elisa的方法检测免疫前及免疫后血清中抗体效价(具体检测方法见实施例7的7.4，本次检测仅包被AE2蛋白，每个血清样品做一个重复即可)，结果如下表所示(所有数值均为5只猪只检测后平均OD450值，每组数据的STEDV值均在10％以下)：在二免前，随着免疫剂量的增大，OD450均值也在随之增大，但是在二免后，OD450均值增加不明显；所用免疫组在二免后OD450均值均在1.25以上，比实施例7中所用的阳性血清效价均要高。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

序列表

<110> 浙江海隆生物科技有限公司

<120> 稳定的非典型猪瘟病毒亚单位蛋白及其疫苗和制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 4

<211> 621

<212> DNA

<213> 密码子优化后的AE2基因序列()

<400> 4

tcctgtcaca agcgccagga ccattacaat atccagctgg tggtggagga gaagacaggc 60

gtggagaaga ggtctatcat gggcaagtgg accgtgatca caagagaggg aagggagcca 120

aggctgatgg agcagatcaa catggtgtcc aatgactccc tgagcgagac ctactgctat 180

aaccggctga atacatccag ctggggcaga cagcctgcta ggcagagggg atgtggacag 240

accgtgccat actggcctgg cgataacgtg ctggaggagc agtactattc caccggctat 300

tgggtgaatg ctacaggagg atgccagctg agggagggcg tgtggctgag caggaagggc 360

aacgtgcagt gtcagcggaa tggctcttcc ctgatcctgc agctggccat caaggaggag 420

aacgacacca tggagatccc atgcgatccc gtggagacag agagcatggg acctgtggct 480

cagggaacct gcgtgtactc ttgggccttc gctccacggg gctggtacta taacagaaag 540

gacggctact ggctgcagta catcaagaag aatgattacc agtactggac aaagatgcca 600

accacaagct ctgccgctac c 621

<210> 4

<211> 621

<212> DNA

<213> 密码子优化前的AE2基因序列()

<400> 4

tcgtgccaca aaagacaaga ccattacaat atccagctag ttgtcgaaga aaaaacaggt 60

gtagaaaaac gatctataat gggcaaatgg actgtgataa ccagggaagg ccgggaacca 120

agattgatgg agcaaataaa tatggtgtca aatgatagcc tgtcagaaac ttactgctat 180

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actgtgccct attggcctgg tgacaatgtt ctagaagaac aatactatag tacaggttac 300

tgggtgaacg caacaggcgg ttgtcaactg agagaaggcg tgtggctgtc aagaaagggc 360

aatgtacagt gccagcgtaa cggctcatcc ttaatactgc aattggcgat aaaagaagag 420

aatgacacta tggaaatacc atgtgatcct gtggaaacag aaagcatggg tccagttgca 480

cagggcactt gtgtatatag ctgggcattc gccccaagag ggtggtatta taataggaaa 540

gacggttatt ggcttcagta cataaagaaa aatgactacc agtactggac aaaaatgcct 600

actacctcgt ccgctgcaac g 621

<210> 4

<211> 207

<212> PRT

<213> AE2氨基酸序列()

<400> 4

Ser Cys His Lys Arg Gln Asp His Tyr Asn Ile Gln Leu Val Val Glu

1 5 10 15

Glu Lys Thr Gly Val Glu Lys Arg Ser Ile Met Gly Lys Trp Thr Val

20 25 30

Ile Thr Arg Glu Gly Arg Glu Pro Arg Leu Met Glu Gln Ile Asn Met

35 40 45

Val Ser Asn Asp Ser Leu Ser Glu Thr Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Asn

50 55 60

Thr Ser Ser Trp Gly Arg Gln Pro Ala Arg Gln Arg Gly Cys Gly Gln

65 70 75 80

Thr Val Pro Tyr Trp Pro Gly Asp Asn Val Leu Glu Glu Gln Tyr Tyr

85 90 95

Ser Thr Gly Tyr Trp Val Asn Ala Thr Gly Gly Cys Gln Leu Arg Glu

100 105 110

Gly Val Trp Leu Ser Arg Lys Gly Asn Val Gln Cys Gln Arg Asn Gly

115 120 125

Ser Ser Leu Ile Leu Gln Leu Ala Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr Met

130 135 140

Glu Ile Pro Cys Asp Pro Val Glu Thr Glu Ser Met Gly Pro Val Ala

145 150 155 160

Gln Gly Thr Cys Val Tyr Ser Trp Ala Phe Ala Pro Arg Gly Trp Tyr

165 170 175

Tyr Asn Arg Lys Asp Gly Tyr Trp Leu Gln Tyr Ile Lys Lys Asn Asp

180 185 190

Tyr Gln Tyr Trp Thr Lys Met Pro Thr Thr Ser Ser Ala Ala Thr

195 200 205