一种人肺癌循环肿瘤细胞系及其应用的制作方法

本发明涉及细胞系领域，特别涉及一种人肺癌循环肿瘤细胞系及其应用。

背景技术

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，已成为全球共同面对和急需解决的公共卫生问题。由于人口老龄化、吸烟、大气污染等问题导致肺癌高危人群迅速扩大，而早期诊断技术的发展促使肺癌早期手术患者的比例不断升高。针对早期术后患者进行及早干预进而预防肺癌转移是提高总体生存期的关键，但目前仍缺乏有效的干预策略。

目前术后化疗是肺癌术后的标准治疗措施，但对早期患者的无病生存期获益有限。靶向治疗对于早期肺癌术后患者的研究表明也不能使受试者获益。此外，基于肿瘤细胞表面标志物的免疫治疗进展迅速，但是针对早期肺癌患者的临床试验研究，包括magrit、ercc-1等，均因没有达到提高总生存期的预期目标而被终止。重要原因在于以上研究主要根据术后标本的原代肿瘤细胞进行的，而不是基于发生转移的关键—循环肿瘤细胞进行精准干预。因此，深入研究循环肿瘤细胞在转移发生中的作用并积极干预，有望显著提高转移的预防效果。

循环肿瘤细胞是指从原发灶或转移灶脱落进入外周血中的肿瘤细胞，它与肺癌的转移具有十分密切的关系，在肺癌的预后、临床分期及疗效评价等方面具有重要意义。以循环肿瘤细胞为靶点的药物研发和治疗策略的制订很可能成为肺癌临床疗效瓶颈的突破口。因为，当前肺癌治疗主要基于瘤体本身，通过对瘤灶的病理分析确定治疗方案。但在早期肺癌术后患者，其体内已无明确病灶，此时针对瘤体本身的治疗方案不能体现精准治疗的理念，这是患者获益有限的主要原因。因为肿瘤细胞的异质性问题，存在于患者外周血中的循环肿瘤细胞已经发生了上皮间质转化事件，导致循环肿瘤细胞与原发灶的生物学特性相比已发生明显改变，而术后化疗的一个重要依据就是消除体内残存的病灶。据此推断，针对于瘤灶本身的靶向药物和化疗药物，由于其依据主要是根据原发灶得出的细胞学和分子生物学层次的信息，而不是起到促进转移作用的循环肿瘤细胞，因此对早期肺癌患者的无病生存期获益有限。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题就是针对现有的人肺癌细胞系都来自于实体瘤，体外用于筛选抗转移药物相差较大这一技术问题，提供一种新的人肺癌循环肿瘤细胞系及其应用。本发明的人肺癌循环肿瘤细胞系性状稳定，可稳定多次传代，在动物体内具有成瘤性和肺转移能力，可以成功制备肺癌转移动物模型，可以用来分析体内外对药物的敏感性和耐药性，进而建立体外、体内两个抗肿瘤转移药物检测平台，是应用于基础研究和临床前期应用的理想人循环肺癌细胞系，使得通过原代培养建立的人源循环肿瘤细胞更接近与肿瘤转移的临床生物学特性，对药物的敏感性和耐药性具有更好的预测性，可用于临床前抗肿瘤转移药物的活性检测，为进一步研究肿瘤的发生发展、转移机制和药物抗肿瘤转移活性检测提供了理想的材料。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种人肺癌循环肿瘤细胞系，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:c2017273。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：本发明所述的人肺癌循环肿瘤细胞系的用途，所述的人肺癌循环肿瘤细胞系用于制备在免疫缺陷哺乳动物中产生肺癌的试剂。

本发明所述的免疫缺陷哺乳动物为本领域常规的免疫缺陷哺乳动物，较佳的为免疫缺陷小鼠，所述的免疫缺陷小鼠较佳的为nod-scid小鼠。所述的人肺癌循环肿瘤细胞为本领域较为稀少的体外成功培养的肺癌细胞。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是：一种药物抑制肺癌转移的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：将待测药物施用于细胞模型中，施用后抑制细胞转移的药物为临床上具有抑制肺癌转移的药物，其中所述的细胞模型是本发明所述的人肺癌循环肿瘤细胞系。

其中所述检测方法为本领域常规使用的检测方法，所述检测方法较佳地包括以下步骤：

(1)将一定数量的人肺癌循环肿瘤细胞接种于转移小室中，将不同的待测化合物添加于细胞内，待测化合物作用24小时后通过测定细胞转移率，计算不同待测化合物对细胞转移的抑制能力，用以判断待测化合物的抑制肿瘤转移的活性。

其中步骤(1)所述人肺癌循环肿瘤细胞系的接种量较佳的为100,000/孔。所述检测不同化合物的抑制细胞转移率，用以判断待测化合物的抗肿瘤转移能力的方法为本领域常规检测和计算方法。其中所述的转移实验采用的转移小室孔径为12μm，细胞转移时间为18h。

本发明还提供一种药物的治疗肺癌转移的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：将测试化合物施用于动物模型，施用后导致肺癌症状改善或肺部转移灶减少的测试化合物就是治疗肺癌的候选化合物，其中所述的动物模型具有如上述的人肺癌循环肿瘤细胞系所导致的肺癌肿瘤。本发明所述检测方法较佳地包括以下步骤：

(1)将所述的肺癌循环肿瘤细胞制备成单细胞悬液，接种于哺乳动物尾静脉，进行饲养，获得人肺癌转移动物模型；

(2)观察和测量动物的体重、肺部转移灶数目等情况；

(3)将测试化合物施用于动物模型，施用后导致肺癌症状改善或减少肺部转移灶数目的测试化合物就是治疗肺癌转移的候选化合物。

其中，所述的动物模型较佳地为免疫缺陷动物，优选地为nod-scid小鼠。较佳的可采用细胞悬液注射方法来建立动物模型。在施用步骤中，将测试化合物通过尾静脉注射、腹腔注射或口服等方式施用于肺癌转移动物。较佳的使用对照实验，一种优选的对照实验方式是：同时还使用不含测试化合物的溶剂施用于肺癌转移动物作为对照。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

相对于现有技术，本发明的积极进步效果在于：

1、本发明的人肺癌循环肿瘤细胞系性状稳定，可稳定多次传代，为肺癌转移研究提供了一种新的更接近与临床肿瘤生物学特性的实验材料；

2、本发明的人肺癌循环肿瘤细胞系可以用来分析体外对药物的敏感性和耐药性、体内动物实验对药物的敏感性和耐药性，进而建立体外、体内两个相关联的抗肺癌转移的药物活性检测平台，是应用于基础研究和临床前期应用的理想细胞系。

生物材料保藏信息

本发明的人肺癌循环肿瘤细胞系，于2017年12月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国·武汉.武汉大学，邮编430072，培养物名称为人肺癌循环肿瘤细胞ctc-tjh-01，保藏编号为cctccno:c2017273。

附图说明

图1为ctc-tjh-01细胞的形态学观察结果图(100×)。

图2为ctc-tjh-01细胞的免疫荧光鉴定(200×)。

图3为ctc-tjh-01细胞生长曲线图。

图4为ctc-tjh-01细胞转移结果图(100×)，其中：图4a为8μm孔径的转移小室；图4b为12μm孔径的转移小室。

图5为ctc-tjh-01细胞药物敏感性结果图，其中：图5a为ctc-tjh-01细胞对泰素帝的敏感性；图5b为ctc-tjh-01细胞对顺铂的敏感性；

图6为ctc-tjh-01细胞流式细胞术结果图，其中：图6a为ctc-tjh-01细胞的ck蛋白的表达；图6b为ctc-tjh-01细胞的aldh1蛋白的表达；图6c为ctc-tjh-01细胞的cd44蛋白的表达；图6d为ctc-tjh-01细胞的cd47蛋白的表达；图6e为ctc-tjh-01细胞的cd133蛋白的表达；图6f为ctc-tjh-01细胞的cd45蛋白的表达。

图7为ctc-tjh-01细胞的成瘤性，其中：图7a为ctc-tjh-01细胞在nod-scid小鼠体内生长曲线(肿瘤体积)；图7b为ctc-tjh-01细胞移植瘤对小鼠体重的影响结果图；图7c为ctc-tjh-01细胞在nod-scid小鼠体内所成肿瘤；图7d为ctc-tjh-01细胞移植瘤的组织病理学结果图(400×)。

图8为ctc-tjh-01细胞的肺转移能力，其中：图8a为ctc-tjh-01细胞在nod-scid小鼠体内的肺转移灶数目；图8b为ctc-tjh-01细胞在nod-scid小鼠肺脏内所成的转移灶；图8c为ctc-tjh-01细胞的肺转移灶组织病理学结果图(400×)。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1ctc-tjh-01细胞系的建立

从上海中医药大学附属龙华医院获得新鲜的肺癌患者外周血标本2ml(女，48岁，原发性肺癌，民族：汉族，籍贯上海，病理诊断结果为：浸润性腺癌)，200×g离心去除上层富血小板血浆，用hank平衡盐溶液(hbss)重悬至2ml，加入epcam抗体修饰和egfr抗体修饰的免疫磁珠(0.8μm)室温孵育1h。同时用含3％的bsa和10％的山羊血清的pbs溶液以0.3ml/h注入鱼骨型微流控芯片封闭1h。芯片上放置一块磁铁(40mm×20mm×6mm)，处理后的样本以2ml/h注入，然后hbss溶液清洗5min，去除未结合细胞和游离的磁珠，撤去磁铁，再用hbss以3.6ml/h的流速冲洗芯片30s，收集ctcs悬液。

将富集分选得到的ctcs加入96孔板中，加入rpmi1640培养基(含20ng/ml上皮生长因子egf，20ng/ml碱性纤维生长因子fgf2，b27添加剂及1％的抗生素)于37℃、5％co2、3％o2的培养箱中培养，待ctcs开始增殖时转至正常氧气浓度下培养。

传代培养：当细胞由96孔板中长满培养板孔底后，进行细胞传代，具体步骤如下：吸弃旧培养液，向孔中加入200μl的pbs溶液，轻轻润洗贴壁细胞层，吸弃，再加入100μl新鲜的0.05％胰蛋白酶溶液，于37℃培养箱中孵育，观察到细胞质回缩、细胞间隙增大，待细胞脱落后，加入200μl新鲜的完全培养液，仔细吹打，使之脱离孔壁形成细胞悬液；收集全部细胞，离心，接种于新的6孔板内。传代至20代以上。

本发明中，来源于肺癌患者外周血中的循环肿瘤细胞及传代培养细胞呈上皮样，倒置显微镜下在完全培养基中细胞贴壁生长，分散均匀，大小不等，形状呈不规则多边形，细胞形态较为均一，细胞核突出，核质比较大，初期生长速度较为缓慢；随着传代次数的增加，生长速度逐步加快；将原代培养传代20代以上，得到细胞系，将该细胞系命名为ctc-tjh-01。本发明的人肺癌循环肿瘤细胞系，于2017年12月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，培养物名称为人肺癌循环肿瘤细胞ctc-tjh-01，保藏编号为cctccno:c2017273。

实施例2ctc-tjh-01细胞的生物学特性及应用

本发明采用含有胎牛血清的f12k培养液培养实施例1所得ctc-tjh-01细胞，使其能体外长期生长和稳定传代。但细胞传至10代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传学和细胞来源鉴定，直至第20代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证，体外生长的ctc-tjh-01细胞呈上皮样，倒置显微镜下细胞贴壁生长，分散均匀，大小不等，形状呈不规则多边形，失去接触生长抑制，呈恶性生长。该ctc-tjh-01细胞能在nod-scid小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。该ctc-tjh-01细胞能在nod-scid小鼠体内形成肺转移灶，具有肺转移能力。该细胞可以为研究体外、体内和临床抗癌、抗转移药物敏感性及耐药性的相关性，以及肺癌的发生、发展、转移和生物标志物提供新的试验材料。具体如下：

a.形态学观察

将ctc-tjh-01细胞接种于6cm皿中贴壁培养，在倒置显微镜下拍照。结果见图1所示：细胞贴壁生长，分散均匀，大小不等，形状为不规则多边形，明显核仁，不规则的核轮廓，细胞核与细胞质比例高，具有上皮样细胞特征。

b.免疫荧光鉴定

将ctc-tjh-01细胞接种于盖玻片上培养，待细胞伸展后，用4％多聚甲醛固定，进行免疫荧光染色。检测结果如图2所示，该结果显示了ctc-tjh-01细胞符合循环肿瘤细胞的特征：表达细胞角蛋白ck、不表达cd45、dapi染核阳性。结合三种荧光染色情况判断，该细胞为循环肿瘤细胞。

c.细胞生长曲线

取对数生长期的细胞，胰酶消化后，用新鲜培养基重悬，接种3000细胞/孔的细胞密度在96孔细胞培养板中，放入37℃的co2培养箱中培养，分别在0、1、2、3、4天，取出一块板，按照细胞增殖计数试剂盒(该试剂盒采购自dojindo，货号为ck04)的说明书，加10μl的cck-8试剂，培养3h后在450nm波长下测吸光值。将5天的测量值汇总绘制细胞生长曲线，如图3所示，以测定的时间为横坐标，测出的吸光值为纵坐标。在5天的观察期内，细胞生长速度呈时间依赖性，根据体外药效学的实验要求，结合该生长曲线，可以确定3000/孔的细胞密度可以作为细胞毒性实验的接种密度。

d.细胞转移检测

取对数生长期的细胞，胰酶消化后，用新鲜的无血清培养基重悬。接种100,000细胞/孔的细胞密度于转移小室的上室，下室添加含20％血清的培养基，于37℃的co2培养箱中培养12h。取出小室，用吉姆萨染液染色，用棉签擦去内室未转移细胞，晾干后于倒置显微镜下观察拍照。如图4a和4b所示，图4a为8μm孔径的转移小室；图4b为12μm孔径的转移小室。图4a和4b的结果表明，ctcs细胞的大小影响了ctcs细胞的体外转移能力。

e.细胞药物敏感性检测

取对数生长期的细胞，胰酶消化后，用新鲜培养基重悬，接种3000细胞/孔的细胞密度在96孔细胞培养板中，放入37℃的co2培养箱中培养24h后，加入不同浓度的顺铂和泰素帝含药培养基继续培养24、48、72小时，加10μl的cck-8试剂，培养3h后测吸光值。将3天的测量值汇总绘制细胞存活曲线，结果如图5a和5b所示，图5a为ctc-tjh-01细胞对泰素帝的敏感性；图5b为ctc-tjh-01细胞对顺铂的敏感性。上述结果表明，泰素帝和顺铂对ctc-tjh-01细胞增殖的抑制呈现浓度依赖性，其中对顺铂的敏感性较差。

f.流式细胞术蛋白表达检测

取对数生长期的ctc-tjh-01细胞、95-d细胞和a549细胞，胰酶消化后，用4％多聚甲醛固定，用tritonx-100破膜，进行一抗孵育和相应荧光二抗孵育，上流式细胞术检测。检测结果如图6所示，其中，图6a为ctc-tjh-01细胞与95-d细胞和a549细胞之间ck蛋白的表达；图6b为ctc-tjh-01细胞与95-d细胞和a549细胞之间aldh1蛋白的表达；图6c为ctc-tjh-01细胞与95-d细胞和a549细胞之间cd44蛋白的表达；图6d为ctc-tjh-01细胞与95-d细胞和a549细胞之间cd47蛋白的表达；图6e为ctc-tjh-01细胞与95-d细胞和a549细胞之间cd133蛋白的表达；图6f为ctc-tjh-01细胞与95-d细胞和a549细胞之间cd45蛋白的表达。上述检测结果表明，ctc-tjh-01细胞高表达干细胞标志蛋白aldh1、cd44，以及高表达免疫调控蛋白cd47，表明其具有干细胞和免疫逃逸的特征。

g.细胞的成瘤性

体外大规模培养和收集ctc-tjh-01细胞，皮下接种nod-scid小鼠(每只动物接种1.0×10⁶个细胞)，共8只，接种后约1周，肿瘤形成并开始生长，每周两次测量肿瘤大小，计数肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，ctc-tjh-01细胞的成瘤性如图7所示。图7a为ctc-tjh-01细胞在nod-scid小鼠体内生长曲线(肿瘤体积)；图7b为ctc-tjh-01细胞移植瘤对小鼠体重影响结果图。ctc-tjh-01细胞在nod-scid小鼠体内所成肿瘤，图7c为ctc-tjh-01细胞移植瘤的he染色结果图。肿瘤组织细胞异型明显，血管生长丰富，排列致密，染色质增加，核内常用多个核仁，核大深染。其中肿瘤体积＝(长×宽×宽)÷2。肿瘤生长较慢，接种后45天肿瘤体积平均值达到400mm³，图7d为ctc-tjh-01细胞移植瘤的组织病理学结果图(400×)，如图7d所示，上述结果表明该肺癌循环肿瘤细胞系能在nod-scid小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。

h.细胞的肺转移性

体外大规模培养和收集ctc-tjh-01细胞，尾静脉注射接种nod-scid小鼠(每只动物接种5×10⁵个细胞)，共18只，接种后每隔2周，观察肺部转移灶生长情况，结果如图8所示。图8a为不同时间点ctc-tjh-01细胞在nod-scid小鼠体内肺转移灶数目；图8b为nod-scid小鼠肺脏转移灶照片；图8c为ctc-tjh-01细胞肺脏转移灶的he染色结果图。上述结果表明该肺癌循环肿瘤细胞系能在nod-scid小鼠体内形成肺转移灶，具有肺转移能力。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。