一种幼年大鼠视网膜色素上皮细胞分离培养方法与流程

本发明涉及细胞分离培养技术领域，尤其是一种幼年大鼠视网膜色素上皮细胞分离培养方法。

背景技术

视网膜色素上皮细胞(rpe细胞)是视网膜外部的单层细胞，因其多边形形态和胞质内丰富的黑色素而得名，它们在视网膜细胞的维持和自我更新上发挥重要的功能，如：吞噬消化脱落的光感受器细胞外节盘膜；促进视循环中11-顺视黄醛的再生；分泌神经营养因子；参与形成视网膜-血管屏障等。rpe细胞的这些生理功能异常被认为与相关眼科疾病的发生密切相关，如年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,amd)和莱伯氏先天性黑蒙症(lebercongenitalamaurosis,lca)等。

rpe细胞具有极性，其基底膜与bruch膜相连构成bruch膜内层，其顶部微绒毛和感光细胞外节相连。在成年大鼠中rpe细胞基底面和bruch膜连接紧密，rpe细胞微绒毛和感光细胞外节连接紧密，这些都使得rpe细胞的分离变得困难。由于新生大鼠(出生后2周内)感光细胞外节还未发育完全，其与rpe细胞易于分离。因此大多数方法均选择在这一时间段内，但也有成年大鼠的rpe细胞分离方法的报导。目前已有报导使用木瓜蛋白酶(papain)、胶原酶(collagenase)和dispase分散酶等多种方法分离新生大鼠的rpe细胞。这些已有的从新生大鼠中分离rpe细胞的方法均采用机械方法将rpe细胞从视网膜上剥离，操作所需时间长，难度大，并且容易造成视网膜相关细胞污染。

此外，这些方法使用的均是色素大鼠，由于其rpe细胞含黑色素，便于机械分离时识别rpe细胞和视网膜。对于白化大鼠而言这些方法的局限更加明显，由于白化大鼠的rpe细胞不含色素，难于与视网膜区分开来，目前还没有分离新生白鼠rpe细胞的报导。

技术实现要素：

本发明针对已有方法的不足，进而提供一种幼年大鼠视网膜色素上皮细胞分离培养方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种幼年大鼠视网膜色素上皮细胞分离培养方法，包括以下步骤:

(1)取大鼠眼球用0.02mg/mldispase酶消化处理；

(2)解剖眼球，去除角膜、晶体和脉络膜组织，分离视网膜，并剪成视网膜片，将视网膜片放入培养箱中孵育，孵育结束后，轻轻摇培养皿使视网膜片在培养皿内流动，促进视网膜上皮细胞片与视网膜片分离；

(3)吸取分离后的视网膜上皮细胞片，清洗；

(4)清洗后的视网膜上皮细胞片转移到新的含pbs的培养皿中，加入胰酶消化、吹打，再种植于细胞培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)所述大鼠为白化大鼠，视网膜色素上皮细胞无色素。需要说明的是本发明的方法也同样适用于色素大鼠，只是对于难以用常规方法处理的白化大鼠更为适用。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)所述大鼠为新生10天大鼠。

在本发明的一个实施方式中，将大鼠脱颈处死，无菌条件下取出眼球。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，大鼠眼球先用含100u/ml青霉素与100mg/ml链霉素的pbs冲洗，再用0.02mg/mldispase酶消化。

细胞培养液和pbs缓冲液中加入青霉素和链霉素，俗称“双抗”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。

dispase酶中文名称为中性蛋白酶，也称为分散酶，是一种非特异性的金属蛋白酶，被用来从各种不同组织或器官中消化细胞外基质，释放并制备原代单细胞。

蛋白水解酶类，如胰蛋白酶、胶原酶和链酶蛋白酶都被用语来分散组织、分类细胞，但他们常伤害细胞，并且在培养时不稳定，甚至可能引入支原体污染。dispase就没有这个问题，不会给细胞膜带来伤害，而且因为其来自细菌，故不会引入支原体或任何动物病毒；温度、ph、血清成分等的差异对dispase影响很小。dispase经稀释后其活性就大大降低，这也方便了后续的培养。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，用0.02mg/mldispase酶消化处理的条件是：37℃消化20～30分钟。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，解剖眼球是在含10v/v％fbs(即为体积百分含量)的dmem/f12培养基中进行。

步骤(2)中将视网膜片放入培养箱中孵育，可能的原理是因为视网膜组织很柔软，分离后或剪成片状后易发生卷曲，但rpe细胞层相对而言硬质些，孵育后视网膜卷在一起而rpe由于相对硬质不易卷曲，因此会分离。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，分离后的视网膜剪成视网膜片是采用以下方法进行的：用显微眼科剪刀直接剪成小片，显微眼科剪刀采用弯头结构。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，视网膜片放入培养箱中孵育的条件是：37℃培养箱中孵育20～30分钟。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，使视网膜片在培养皿内流动的方法是：按顺时针或逆时针方向轻轻摇培养皿使视网膜片在培养皿内流动。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，孵育结束后，使视网膜片在培养皿内流动后，用体式镜观察是否分离完全，若未完全分离则再继续孵育10分钟。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中收集和转移分离的视网膜色素上皮细胞片的方法为用带10ul吸头的10ul移液器吸取和转移。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，清洗是在含pbs的培养皿中清洗。

在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，加入胰酶消化的条件是：用0.25％胰酶37℃消化1～2分钟。

在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，种植于细胞培养皿中的细胞种植密度是15000～18000cells/cm²。

在本发明的一个实施方式中，步骤(4)完成后，每2天更换一次培养基。

在本发明的一个实施方式中，简易快速的新生10天sd大鼠视网膜色素上皮细胞分离培养方法，包括以下步骤：

(1)新生10天sd大鼠脱颈处死，无菌条件下取出眼球，用含100u/ml青霉素与100mg/ml链霉素的pbs冲洗，放入0.02mg/mldispase酶37℃消化20～30分钟。

(2)在含10v/v％fbs的dmem/f12培养基中解剖眼球，去除角膜，晶体和脉络膜等组织，分离视网膜并剪成小片，放入37℃培养箱中孵育20～30分钟。孵育结束后按顺时针或逆时针方向轻轻摇培养皿使视网膜片在培养皿内流动，促进视网膜上皮细胞与视网膜分离。体式镜下观察是否分离完全，若未完全分离则再继续孵育10分钟。

(3)用移液器吸取分离后的视网膜上皮细胞片，转移到含pbs的3cm培养皿中清洗，再吸取清洗后的视网膜上皮细胞片并转移到新的3cm培养皿中。

(4)加入0.25％胰酶，37℃消化1～2分钟，终止消化并吹打，按16000cells/cm²种植于细胞培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。之后每2天更换一次培养基。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

本发明所提供的幼年大鼠视网膜色素上皮细胞分离培养方法是一种简易快速的分离幼年大鼠视网膜色素上皮细胞的方法。通过酶消化后分离视网膜并剪成小片，经培液孵育分离后，能培养获得大量视网膜色素上皮细胞，无杂细胞污染，无需人为的机械分离操作，过程简易，缩短分离时间。

附图说明

图1为sd大鼠视网膜色素上皮细胞分离的具体步骤示意图(图1a为消化酶消化后分离的视网膜；图1b为剪成片状的视网膜；图1c为与视网膜分离的视网膜上皮细胞，其中箭头1指示为视网膜色素上皮细胞，箭头2指示为视网膜)。

图2为体外培养7d的sd大鼠视网膜色素上皮细胞。

图3为da大鼠视网膜色素上皮细胞分离的具体步骤示意图(图3a为消化酶消化后分离的视网膜；图3b为剪成片状的视网膜；图3c为与视网膜分离的视网膜上皮细胞，其中箭头1指示为视网膜色素上皮细胞，箭头2指示为视网膜)。

图4为体外培养7d的da大鼠视网膜色素上皮细胞。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

新生10天sd大鼠视网膜色素上皮细胞的分离和培养。

(1)新生10天sd大鼠脱颈处死，无菌条件下取出眼球，用含100u/ml青霉素与100mg/ml链霉素的pbs冲洗，放入0.02mg/mldispase酶37℃消化30分钟。

(2)在含10v/v％fbs的dmem/f12培养基中解剖眼球，去除角膜，晶体和脉络膜等组织，分离视网膜并剪成小片，放入37℃培养箱中孵育30分钟(图1a和b)。孵育结束后按顺时针(或逆时针)方向轻轻摇培养皿使视网膜片在培养皿内流动，促进视网膜上皮细胞与视网膜分离(图1c)。体式镜下观察是否分离完全，若未完全分离则再继续孵育10分钟。

(3)用移液器吸取分离后的视网膜上皮细胞片，转移到含pbs的3cm培养皿中清洗，再吸取清洗后的视网膜上皮细胞片并转移到新的3cm培养皿中。

(4)加入0.25％胰酶，37℃消化2分钟，终止消化并吹打，按16000cells/cm²种植于细胞培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。之后每2天更换一次培养基。

体外培养7d的sd大鼠视网膜色素上皮细胞如图2所示。

实施例2

新生10天da大鼠视网膜色素上皮细胞的分离和培养。

(1)新生10天da大鼠脱颈处死，无菌条件下取出眼球，用含100u/ml青霉素与100mg/ml链霉素的pbs冲洗，放入0.02mg/mldispase酶37℃消化30分钟。

(2)在含10v/v％fbs的dmem/f12培养基中解剖眼球，去除角膜，晶体和脉络膜等组织，分离视网膜并剪成小片，放入37℃培养箱中孵育30分钟(图3a和b)。孵育结束后按顺时针或逆时针方向轻轻摇培养皿使视网膜片在培养皿内流动，促进视网膜上皮细胞与视网膜分离(图3c)。体式镜下观察是否分离完全，若未完全分离则再继续孵育10分钟。

(3)用移液器吸取分离后的视网膜上皮细胞片，转移到含pbs的3cm培养皿中清洗，再吸取清洗后的视网膜上皮细胞片并转移到新的3cm培养皿中。

(4)加入0.25％胰酶，37℃消化2分钟，终止消化并吹打，按16000cells/cm²种植于细胞培养皿中，置于37℃，5％co2培养箱中培养。之后每2天更换一次培养基

体外培养7d的da大鼠视网膜色素上皮细胞如图4所示。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。