本发明涉及放线菌次级代谢产物制备活性化合物领域，具体涉及一种3位取代的十字孢碱类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
：十字孢碱(staurosporine,STA)，是于1977年从土壤中的放线菌的培养基中分离出来的最早的一种吲哚咔唑类生物碱。此后的大量研究表明，其具有多种药理活性，如抗肿瘤活性、抗菌作用、抑制血小板聚集等。最重要的是其具有广谱的蛋白激酶抑制活性，如对蛋白激酶C(PKC)、酪氨酸激酶(TPK)，细胞周期依赖性激酶蛋白(CDK)等的活性均具有显著的抑制作用。其中，Rho相关蛋白激酶(ROCK)是近十年来发现参与细胞运动的主要激酶之一，对细胞的分裂、迁移、粘附、分泌、收缩等活动具有重要调节作用。ROCK分为ROCKI(ROCKB)和ROCKII(ROCKA)两种类型，完整的ROCKI和ROCKII约含有1300个氨基酸，分子质量在160kD左右，一级结构具有65％的同源性，其中前者主要存在于非神经组织如肺、心脏、骨胳肌等细胞；后者主要存在于中枢神经系统，如海马锥体神经元、大脑皮质、小脑浦肯野细胞等。ROCKI和ROCKII均属于丝/苏氨酸蛋白激酶，其表达或激活与许多心脑血管疾病的发生发展密切相关，故Rho激酶已经成为新药研发的重要靶点之一(Rhokinase,apromisingdrugtargetforneurologicaldisorders.[J]NatRevDrugDiscov.2005；4:387-389)。而Rho激酶抑制剂的不断发现为心血管、神经系统等疾病的治疗提供了新的希望。因此，挖掘吲哚咔唑类衍生物，并筛选出选择性更优、抑制活性更高的ROCK蛋白激酶抑制剂对于抗肿瘤以及神经性变性疾病相关的如阿尔兹海默、亨廷顿和帕金森等疾病的新药研发具有重要的社会和经济意义。技术实现要素：本发明提供了一种新型的3位取代的十字孢碱类衍生物，该化合物为由放线菌通过大米发酵及提纯后得到的天然产物，对蛋白激酶PKCα和ROCKII的活性具有明显的抑制作用，因此可制备用于治疗与蛋白激酶异常表达相关的各种疾病的药物。具体技术方案如下：一种3位取代的十字孢碱类衍生物，结构式如下式(I)所示：式中，R1选自H或OCH3；当R1为H时，R3选自H或当R1为H，R3为H时，R2选自OH、NH2或OCH2CH3；当R1为H，R3为时，R2选自OH、NH2、F、OCH3、OCH2CH3、Cl或Br；当R1为OCH3时，R3为H，R2选自OH、NH2、F、OCH3、OCH2CH3、Cl或Br。基团中的虚线代表该基团连接母核基团。本发明还公开了所述的3位取代的十字孢碱类衍生物的制备方法，包括以下步骤：(1)将放线菌接种于高氏一号液体培养基中，摇床培养，得到种子液；(2)将种子液接种于大米发酵培养基中，静置培养，得到固体发酵产物；(3)固体发酵产物经分离纯化获得所述3位取代的十字孢碱类衍生物；所述放线菌为链霉菌Streptomycessp.，保藏号为CICC11026。作为优选，步骤(1)中，所述摇床培养的条件为：20～35℃摇床培养2～5天。作为优选，步骤(2)中，所述大米发酵培养基由大米、水和海盐组成，大米、水与海盐的用量为40g：40～80mL：0.5～3g；所述静置培养的条件为：23～33℃静置培养60～80天。作为优选，步骤(3)中，所述分离纯化包括：a)固体发酵产物经乙酸乙酯萃取，提取萃取液；b)将萃取液浓缩后，经常压凝胶色谱粗分离，得到粗产物；c)粗产物经中压制备液相色谱分离，再经高压制备液相色谱纯化。进一步优选，步骤a)中，将固体发酵产物与等体积乙酸乙酯混合，浸泡萃取至少一次。进一步优选，步骤b)中，所述常压凝胶色谱的条件为：以羟丙基葡聚糖凝胶(LH-20)为填料，以体积百分数为20～100％的甲醇-水体系为洗脱剂，进行梯度洗脱。洗脱产物为包含有目标化合物的混合组分。本发明中，体积百分数为20％的甲醇-水体系是指甲醇和水的体积比为20：80，体积百分数为100％的甲醇-水体系是指甲醇和水的体积比为100：0。进一步优选，步骤c)中：所述中压制备液相色谱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以体积百分数为40～100％的甲醇/水体系为流动相，并以10mL/min进行梯度洗脱，经TLC分析后合并含目标化合物的洗脱产物；所述高压制备液相色谱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以体积百分数为20～48％的乙腈-水溶液为流动相，并以10mL/min进行梯度洗脱，收集不同时间的色谱峰，回收溶剂，得到不同结构的3位取代的十字孢碱类衍生物。对本发明制备的具有式(I)结构式所示的3位取代的十字孢碱类衍生物进行活性评价试验，发现：对蛋白激酶PKCα和ROCKII具有抑制活性，因此，可以制备用于治疗与蛋白激酶异常表达相关疾病的药物中的应用。所述疾病包括与肿瘤相关的疾病和与神经性变性疾病相关的疾病。所述与肿瘤相关的疾病包括急性髓系白血病、非小细胞肺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等；与神经性变性疾病相关的疾病包括阿尔兹海默、亨廷顿和帕金森等。进一步试验发现，采用人前列腺癌细胞株PC3细胞进行活性评价试验，具有如下式(I-1)、(I-4)、(I-11)所示结构的三种3位取代的十字孢碱类衍生物均显示出良好的抑制活性。式中，R1为H，R2为OH，R3为H；式中，R1为OCH3，R2为OH；式中，R1为H，R2为OH，R3为其中，结构式如(I-1)所示的3位取代的十字孢碱类衍生物，对蛋白激酶ROCKII呈现出超强的抑制活性，可应用于与神经性变性疾病如阿尔兹海默、亨廷顿和帕金森等疾病的新药研发。与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明公开了一种结构新颖的3位取代的十字孢碱类衍生物，由放线菌通过大米发酵及提纯后得到，其结构为天然产物中首次发现；该十字孢碱类化合物对蛋白激酶PKCα和ROCKII具有抑制活性，可以制备用于治疗与蛋白激酶异常表达相关疾病的药物中的应用。尤其对治疗前列腺癌，以及与蛋白激酶ROCKII相关的神经性变性疾病如阿尔兹海默、亨廷顿，眼部疾病如青光眼，老年黄斑病的新药研发具有重要的应用价值。具体实施方式实施例1一、化合物的发酵放线菌采用中国工业微生物菌种保藏管理中心出售的链霉菌Streptomycessp.CICC11026；1)将放线菌Streptomycessp.CICC11026接种于500mL锥形瓶中，每瓶含250mL高氏一号液体培养基，培养条件为28℃、180rpm的摇床中培养3天，获得可发酵培养的种子液；2)将步骤1)所得的种子液接种至大米培养基(大米培养基，由以下组分制成：大米40g，水60mL，海盐1.5g)，接种体积为12mL，培养条件为28℃下恒温静置培养70天，得到含有本发明具有抗肿瘤活性的化合物的固体发酵产物。二、十字孢碱类化合物的制备及结构确证将含有本发明具有抗肿瘤活性的化合物的固体发酵产物用乙酸乙酯浸泡萃取3次，溶剂回收浓缩，将所得乙酸乙酯部位进行常压凝胶色谱(采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶LH-20)粗分离，洗脱剂为体积百分数20％-100％的甲醇-水体系梯度洗脱，每1/4柱体积为一个馏分，TLC分析合并含有目标化合物的馏分。对目标组分采用中压制备色谱分离(SepaxAmethystC-18(10μm,30×400mm)色谱柱，检测波长295nm)，流动相为体积百分数40％-100％的甲醇-水溶液以10mL/min梯度洗脱，TLC分析合并含目标化合物的馏分。将含目标化合物的组分采用高效制备液相色谱分离(AgilentPursuitC-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长292nm)，采用的流动相为体积百分数35％-40％(40min)乙腈/水体系以10mL/min梯度洗脱，收集21-22min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物I-1，其结构如下所示。分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS计算为C20H13N3O2(m/z＝[M+H]+328.1080,calculated328.1086)核磁数据见表1，因此鉴定该化合物为(3-hydroxy-k252c)具体结构如下：将含目标化合物的组分采用高效制备液相色谱分离(AgilentPursuitC-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长292nm)，采用的流动相为体积百分数38％-42％(40min)乙腈/水体系以10mL/min梯度洗脱，收集20-21min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物I-4，其结构如下所示。分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS计算为C20H13N3O2(m/z＝[M+H]+358.1188,calculated358.1192)，核磁数据见表1，因此鉴定该化合物为(7-methoxy-3-hydroxy-k252c)具体结构如下：表11H600MHz,13C125MHz将含目标化合物的组分采用高效制备液相色谱分离(AgilentPursuitC-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长292nm)，采用的流动相为体积百分数23％-30％(40min)乙腈/水体系以10mL/min梯度洗脱，收集16-18min的色谱峰，回收溶剂，得到化合物I-11，其结构如下所示。分子式根据高分辨质谱HR-ESI-MS计算为C26H24N4O4(m/z＝[M+H]+457.1873,calculated457.1876)，核磁数据见表2，因此鉴定该化合物为(3-hydroxy-holyrineA)，命名为A61-37E，具体结构如下：表21H600MHz,13C125MHz三、其余单体化合物的结构确证其中：化合物I-2：R1＝H，R3＝H，R2＝NH2；化合物I-3：R1＝H，R3＝H，R2＝OCH2CH3；化合物I-5：R1＝OCH3，R3＝H，R2＝NH2；化合物I-6：R1＝OCH3，R3＝H，R2＝F；化合物I-7：R1＝OCH3，R3＝H，R2＝OCH3；化合物I-8：R1＝OCH3，R3＝H，R2＝OCH2CH3；化合物I-9：R1＝OCH3，R3＝H，R2＝Cl；化合物I-10：R1＝OCH3，R3＝H，R2＝Br；化合物I-12：R1＝H，R3＝i，R2＝NH2；化合物I-13：R1＝H，R3＝i，R2＝F；化合物I-14：R1＝H，R3＝i，R2＝OCH3；化合物I-15：R1＝H，R3＝i，R2＝OCH2CH3；化合物I-16：R1＝H，R3＝i，R2＝Cl；化合物I-17：R1＝H，R3＝i，R2＝Br。记为i。化合物I-2～I-3均采用HPLC制备，乙腈水35-40％(40min)，tR＝22min，tR＝21.9min。化合物I-5～I-9均采用HPLC制备，乙腈水38-42％(40min)，tR＝20-21min，tR＝22min，tR＝21min，tR＝23min，tR＝20-21min；化合物I-10、I-12～I-17均采用HPLC制备，乙腈水23-30％(40min)，tR＝16min，tR＝17min，tR＝16-17min，tR＝18min，tR＝19min，tR＝20-21min，tR＝21min。化合物I-2:HR-ESI-MS计算为C20H15N4O(m/z＝[M+H]+327.1248,calculated327.1246)1H600MHzinCD3OD,7.50(d,8.4,H-1),6.9(dd,8.4,2.9,H-2),8.76(d,2.6,H-4),5.00(s),8.1(d,7.6,H-8),7.30(m,H-9),7.37(m,H-10),7.67(d,7.5,H-11)13C125MHz(inCD3OD),113.3(C-1),114.3(C-2),146.4(C-3),116.2(C-4),125.2(C-4a),114.5(C-4b),119.4(C-4c),175.8(C-5),47.9(C-7),133.6(C-7a),117.5(C-7b),126.5(C-7c),122.4(C-8),121.3(C-9),123.2(C-10),112.2(C-11),141.3(C-11a),132.2(C-12a),128.5(C-12b),138.3(C-13a).化合物I-3:HR-ESI-MS计算为C22H18N3O2(m/z＝[M+H]+356.1394,calculated356.1399)1H600MHzinCD3OD,1H600MHzinCD3OD,7.52(d,8.6,H-1),7.00(dd,8.6,2.7,H-2),8.79(d,2.7,H-4),5.03(s),8.08(d,7.7,H-8),7.36(m,H-9),7.48(m,H-10),7.75(d,7.7,H-11),4.09(q,5.4,-CH2-),1.33(t,5.4,-CH3)13C125MHz(inCD3OD),110.7(C-1),116.8(C-2),152.9(C-3),111.3(C-4),126.4(C-4a),116.1(C-4b),119.4(C-4c),174.2(C-5),46.5(C-7),134.8(C-7a),119.2(C-7c),124.5(C-7c),122.4(C-8),120.6(C-9),126.8(C-10),112.4(C-11),141.6(C-11a),129.8(C-12a),126.8(C-12b),133.5(C-13a)，64.9(-OCH2CH3)，15.8(-OCH2CH3)化合物I-5HR-ESI-MS计算为C21H17N4O2(m/z＝[M+H]+357.1356,calculated357.1352)7.47(d,8.7,H-1),7.05(dd,8.7,2.8,H-2),8.58(d,2.8,H-4),6.45(s),8.27(d,7.6,H-8),7.30(m,H-9),7.40(m,H-10),7.67(d,7.4,H-11),3.23(s).13C125MHz(inCD3OD),111.3(C-1),117.3(C-2),152.4(C-3),111.5(C-4),125.5(C-4a),117.5(C-4b),119.9(C-4c),175.4(C-5),86.4(C-7),133.1(C-7a),116.1(C-7c),124.6(C-7c),124.1(C-8),121.7(C-9),127.5(C-10),112.8(C-11),141.9(C-11a),129.3(C-12a),129.4(C-12b),139.5(C-13a),51.7(-OCH3).化合物I-6HR-ESI-MS计算为C21H15FN3O2(m/z＝[M+H]+372.1343,calculated372.1348)7.44(d,8.2,H-1),7.02(dd,8.2,2.4,H-2),8.79(d,2.4,H-4),6.40(s),8.24(d,7.6,H-8),7.22(m,H-9),7.43(m,H-10),7.65(d,7.3,H-11),3.21(s).13C125MHz(inCD3OD),111.3(C-1),117.2(C-2),135.4(C-3),111.4(C-4),125.6(C-4a),117.8(C-4b),119.7(C-4c),175.8(C-5),86.3(C-7),133.2(C-7a),116.5(C-7c),124.2(C-7c),124.5(C-8),121.2(C-9),127.4(C-10),112.7(C-11),141.5(C-11a),128.9(C-12a),129.9(C-12b),139.6(C-13a),51.6(-OCH3).化合物I-7HR-ESI-MS计算为C22H18N3O2(m/z＝[M+H]+372.1343,calculated372.1348)7.44(d,8.7,H-1),7.15(dd,8.7,2.8,H-2),8.53(d,2.8,H-4),6.41(s),8.21(d,7.6,H-8),7.31(m,H-9),7.43(m,H-10),7.61(d,7.1,H-11),3.25(s).13C125MHz(inCD3OD),111.1(C-1),117.3(C-2),152.5(C-3),111.5(C-4),125.4(C-4a),117.3(C-4b),119.7(C-4c),175.6(C-5),86.5(C-7),133.3(C-7a),116.2(C-7c),124.3(C-7c),124.7(C-8),121.8(C-9),127.3(C-10),112.7(C-11),141.6(C-11a),128.3(C-12a),128.9(C-12b),139.4(C-13a),52.1(-OCH3).化合物I-8HR-ESI-MS计算为C23H20N3O3(m/z＝[M+H]+386.1504,calculated386.1505)7.43(d,8.2,H-1),7.25(dd,8.2,2.1,H-2),8.52(d,2.1,H-4),6.43(s,H-7),8.25(d,7.7,H-8),7.31(m,H-9),7.41(m,H-10),7.62(d,7.4,H-11),3.22(s,7-OCH3).4.0(q,5.8),1.3(t,5.8)13C125MHz(inCD3OD),112.5(C-1),116.8(C-2),154.2(C-3),112.1(C-4),125.2(C-4a),117.2(C-4b),119.6(C-4c),174.8(C-5),85.9(C-7),133.2(C-7a),115.1(C-7c),124.7(C-7c),124.5(C-8),121.8(C-9),126.5(C-10),112.9(C-11),141.6(C-11a),128.3(C-12a),129.5(C-12b),139.6(C-13a),51.9(7-OCH3),62.1(-OCH2CH3),14.9(-OCH2CH3)化合物I-9HR-ESI-MS计算为C21H15ClN3O2(m/z＝[M+H]+376.0856,calculated376.0853)1H600MHzinCD3OD,7.42(H-1),7.48(H-2),9.22(d,2.5,H-4),6.42(s,H-7),8.07(d,7.5,H-8),7.32(H-9),7.42(H-10),8.16(d,8.4,H-11),3.3(s,7-OCH3)13C125MHz(inCD3OD)108.4(C-1),128.1(C-2),124.4(C-3),129.6(C-4),125.8(C-4a),117.9(C-4b),120.3(C-4c),174.8(C-5),46.9(C-7),134.3(C-7a),116.7(C-7b),126.1(C-7c),122.9(C-8),121.4(C-9),126.7(C-10),118.1(C-11),141.8(C-11a),131.0(C-12a),127.3(C-12b),138.9(C-13a),53.8(7-OCH3)化合物I-10HR-ESI-MS计算为C21H15BrN3O2(m/z＝[M+H]+420.0345,calculated420.0348)1H600MHzinCD3OD,7.45(H-1),7.48(H-2),9.41(d,2.8,H-4),6.52(s,H-7),8.03(d,7.5,H-8),7.52(H-9),7.62(H-10),8.06(d,8.4,H-11),3.31(s,7-OCH3)13C125MHz(inCD3OD)109.4(C-1),127.5(C-2),125.5(C-3),128.7(C-4),125.7(C-4a),117.3(C-4b),121.7(C-4c),174.7(C-5),46.5(C-7),134.7(C-7a),116.1(C-7b),126.4(C-7c),122.2(C-8),121.4(C-9),126.7(C-10),118.6(C-11),141.3(C-11a),132.3(C-12a),127.8(C-12b),137.9(C-13a),53.4(7-OCH3)化合物I-12:HR-ESI-MS计算为C26H25N5O3(m/z＝[M+H]+456.2033,calculated456.2036)1H600MHzinCD3OD,7.50(d,2.7,H-1),7.02(dd,8.5,2.7,H-2),8.84(d,8.5,H-4),5.00(s,H-7),7.6(d,7.8,H-8),7.21(t,7.2,H-9),7.37(t,7.2,H-10),7.69(d,7.3,H-11),4.72(q,7.1,H-2′),4.15(s,H-3′),4.15(d,11.2,H-4),2.70(q,11.3,H-4′),2.07(d,12.3,H-5′),6.58(dd,11.4,2.7,H-6′),1.66,(d,7.0,2′-CH3).13C125MHz(inCD3OD),109.3(C-1),115.3(C-2),145.4(C-3),107.8(C-4),124.2(C-4a),115.5(C-4b),118.4(C-4c),175.4(C-5),46.3(C-7),135.7(C-7a),119.5(C-7c),123.7(C-7c),122.5(C-8),121.7(C-9),126.8(C-10),111.0(C-11),139.9(C-11a),129.3(C-12a),125.4(C-12b),132.9(C-13a),78.7(C-2’),65.9(C-3’),48.8(C-4’),32.1(C-5’),75.8(C-6’),14.8(C-CH3)化合物I-13:HR-ESI-MS计算为C26H23FN4O3(m/z＝[M+H]+459.1830,calculated459.1832)1H600MHzinCD3OD,7.7(d,2.6,H-1),7.15(dd,8.2,2.6,H-2),8.5(d,8.2,H-4),5.00(s,H-7),7.52(d,7.8,H-8),7.32(m,H-9),7.32(m,H-10),7.6(d,7.3,H-11),4.7(q,7.1,H-2′),4.2(s,H-3′),4.1(d,11.2,H-4),2.62(q,11.3,H-4′),2.01(d,12.3,H-5′),6.53(dd,11.4,2.7,H-6′),1.62,(d,7.0,2′-CH3).13C125MHz(inCD3OD),109.5(C-1),114.2(C-2),135.6(C-3),108.8(C-4),123.2(C-4a),117.5(C-4b),118.8(C-4c),175.4(C-5),46.8(C-7),136.1(C-7a),119.1(C-7c),123.5(C-7c),121.5(C-8),121.7(C-9),126.8(C-10),111.7(C-11),139.9(C-11a),129.8(C-12a),124.4(C-12b),132.3(C-13a),73.7(C-2’),67.9(C-3’),48.2(C-4′),32.6(C-5′),75.4(C-6′),14.5(C-CH3)化合物I-14:HR-ESI-MS计算为C27H26N4O4(m/z＝[M+H]+471.2033,calculated471.2032)1H600MHzinCD3OD,7.50(d,2.1,H-1),7.05(dd,8.3,2.1,H-2),8.86(d,8.3,H-4),5.00(m,H-7),8.2(d,7.8,H-8),7.32(m,H-9),7.47(m,H-10),7.71(d,7.4,H-11),3.8(s,3-OCH3),4.77(q,7.3,H-2′),4.15(s,H-3′),4.20(d,11.2,H-4),2.70(m,H-4′),2.07(m,H-5′),6.48(dd,11.2,2.6,H-6’),1.66,(d,7.0,2′-CH3).13C125MHz(inCD3OD),111.3(C-1),115.3(C-2),156.4(C-3),112.9(C-4),124.8(C-4a),113.5(C-4b),119.9(C-4c),175.8(C-5),46.5(C-7),135.9(C-7a),113.1(C-7c),125.6(C-7c),121.1(C-8),124.3(C-9),126.8(C-10),112.6(C-11),149(C-11a),128.4(C-12a),127.4(C-12b),134.6(C-13a),78.8(C-2′),67.4(C-3′),48.6(C-4′),32.9(C-5′),76.1(C-6′),14.1(C-CH3),55.8(C-OCH3)化合物I-15:HR-ESI-MS计算为C28H28N4O4(m/z＝[M+H]+485.2188,calculated485.2189)1H600MHzinCD3OD,7.48(d,2.5,H-1),7.02(dd,8.7,2.5,H-2),8.86(d,8.7,H-4),5.00(m,H-7),8.15(d,7.5,H-8),7.35(m,H-9),7.46(m,H-10),7.77(d,7.8,H-11),3.6(s,3-OCH3),4.72(q,7.1,H-2′),4.11(s,H-3′),4.28(d,11.7,H-4),2.71(m,H-4′),2.01(m,H-5′),6.41(dd,11.4,2.1,H-6′),1.61,(d,7.0,2′-CH3),1.51(t,4.5,-OCH2CH3),3.5(q,4.5,-OCH2CH3).13C125MHz(inCD3OD),111.1(C-1),112.3(C-2),151.4(C-3),112.2(C-4),124.1(C-4a),113.2(C-4b),119.3(C-4c),175.1(C-5),47.3(C-7),135.9(C-7a),113.4(C-7c),125.7(C-7c),121.2(C-8),121.3(C-9),126.3(C-10),115.6(C-11),149.1(C-11a),127.4(C-12a),127.1(C-12b),132.6(C-13a),78.5(C-2′),67.1(C-3′),48.6(C-4′),32.1(C-5′),73.1(C-6′),14.3(C-CH3),59.8(C-OCH2CH3),14.1(C-OCH2CH3).化合物I-16:HR-ESI-MS计算为C26H23ClN4O3(m/z＝[M+H]+475.1735,calculated475.1537)1H600MHzinCD3OD,7.8(d,2.8,H-1),7.6(dd,8.1,2.8,H-2),9.27(d,8.1,H-4),5.00(m,H-7),8.21(d,7.8,H-8),7.32(m,H-9),7.47(m,H-10),7.71(d,7.4,H-11),4.15(s,H-3’),4.20(d,11.2,H-4),2.70(m,H-4′),2.07(m,H-5′),6.48(dd,11.2,2.6,H-6′),1.66,(d,7.0,2′-CH3).13C125MHz(inCD3OD),117.3(C-1),114.3(C-2),129.4(C-3),118.9(C-4),124.1(C-4a),113.2(C-4b),119.3(C-4c),175.3(C-5),46.3(C-7),135.1(C-7a),113.1(C-7b),125.6(C-7c),121.1(C-8),124.3(C-9),126.8(C-10),112.6(C-11),149(C-11a),125.4(C-12a),126.4(C-12b),136.6(C-13a),78.5(C-2′),67.2(C-3′),48.3(C-4′),32.2(C-5′),76.2(C-6′),14.8(C-CH3).化合物I-17:HR-ESI-MS计算为C26H23BrN4O3(m/z＝[M+H]+519.1034,calculated519.1032)1H600MHzinCD3OD,7.7(d,2.4,H-1),7.6(dd,8.1,2.4,H-2),9.39(d,8.1,H-4),5.00(m,H-7),8.1(d,7.8,H-8),7.32(m,H-9),7.47(m,H-10),7.74(d,7.6,H-11),4.25(s,H-3′),4.21(d,10.9,H-4),2.65(m,H-4′),2.37(m,H-5′),6.62(dd,11.2,2.6,H-6′),1.68,(d,6.9,2′-CH3).13C125MHz(inCD3OD),118.3(C-1),115.3(C-2),126.8(C-3),118.8(C-4),124.7(C-4a),116.2(C-4b),116.3(C-4c),175.5(C-5),46.4(C-7),135.7(C-7a),113.2(C-7b),124.6(C-7c),120.1(C-8),124.8(C-9),126.9(C-10),112.4(C-11),143(C-11a),124.4(C-12a),126.4(C-12b),137.6(C-13a),78.5(C-2′),67.8(C-3′),48.5(C-4′),31.2(C-5′),78.2(C-6′),14.9(C-CH3).四、抗肿瘤活性实验人前列腺癌细胞株PC3细胞对其中3-hydroxy-k252c(I-1)，7-methoxy-3-hydroxy-k252c(I-4)，3-hydroxy-holyrineA(I-11)测定IC50实验。采用SBR细胞实验，取对数生长期的细胞，1×105个/mL铺96孔板，CO2培养箱中培养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，加药完成后，培养板于微孔板振荡器上振荡混匀，置于CO2培养箱中继续培养48小时。取出培养板，在培养液表面每孔轻轻加入50μl预冷的50％的三氯醋酸(TCA)固定，静置5分钟后，再将培养板移至4℃放置1小时。倒掉固定液，每孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥。每孔加入100μlSRB液，在室温25℃放置10分钟，去上清液，用体积百分数1％醋酸洗涤5次，空气干燥，结合的SRB用150μl10mmol/L非缓冲Tris碱液(pH10.5)振荡溶解。置于酶标仪中测定各孔光吸收，测定波长为540nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖抑制率，根据各浓度抑制率，采用Logit法计算半数抑制浓度IC50。表3化合物IC50(μM)I-120.1I-417.7I-116.7五、蛋白激酶的抑制活性采用KinEASETM-TKassaykit(Cisbio)，以星孢菌素(STA)阳性药测定所得不同浓度化合物对蛋白激酶的抑制活性。HRFT值通过测定蛋白激酶在经340nm紫外光激发后665nm和620nm的荧光比值获得，即HTRF值T＝[F665nm/F620nm]×104。蛋白激酶(PKCα，ROCKII)抑制％＝((T待测)-(Tmin))/((Tmax)-(Tmin))×100，Tmax为反应液的HTRF值，Tmin为没有蛋白激酶的空白反应液HTRF值。最终根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度IC50如表3所示：表4从表3可以看出，采用人前列腺癌细胞株PC3细胞进行活性评价试验，结构式如(I-1)、(I-4)、(I-11)所示的三种化合物均显示出良好的抑制活性，其中式(I-11)的化合物显示一定的细胞毒性。从表4可以看出，结构式如(I-1)、(I-4)、(I-11)所示的三种化合物均显示出良好的蛋白激酶抑制活性，其中结构式如(I-1)的化合物对于ROCKII具有较强的抑制活性。说明该化合物在抗肿瘤、尤其在抗神经性疾病如老年痴呆，帕金森等具有巨大的应用潜力，可应用于制备神经类蛋白激酶相关的小分子抑制剂类药物和抗肿瘤药物研发，亦可以应用于视觉相关疾病如青光眼，老年黄斑病等。当前第1页1 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