一种检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法与流程

文档序号:15457502发布日期:2018-09-15 01:31

本发明涉及环境检测技术领域,尤其涉及检测环境中甲状腺激素 干扰物诱导活性的方法。



背景技术:

甲状腺是脊椎动物非常重要的腺体,属于内分泌器官,其分泌的 甲状腺激素是体内至关重要的新陈代谢调节物,在促进机体基础代谢、 生长发育等方面发挥重要作用。如果胎儿发育期间甲状腺激素缺乏, 将导致体型矮小、智力迟钝、骨骼营养不良以及新陈代谢低下等一些 不良症状。同时,与中枢神经系统成熟相关的过程以及骨骼、肝脏和 血液等的发育和功能维持都离不开甲状腺激素的调控。

近年来不断有研究证明,环境中的一些内分泌干扰物能影响下丘 脑-腺垂体-甲状腺作用轴。这类影响生物体甲状腺激素的合成、分 泌、运输、作用和代谢等过程的化合物统称为甲状腺激素干扰物 (TDCs,Thyroid Disrupting Chemicals)。

由于甲状腺激素在基础代谢以及生长发育调节方面的重要作用, 甲状腺激素干扰引起了科学界巨大的关注,同时环境甲状腺激素干扰 物也成为继环境雌激素污染后最重要的一类内分泌干扰物。现有甲状 腺激素干扰物的鉴别与毒性评价方法,主要有体外测试方法(in-vitro) 与活体测试方法(in vivo)两种,离体方法主要有T-screen筛选方法、 重组雌激素受体基因酵母测试方法等;活体测试根据研究者研究领域 等方面的不同,有利用非洲爪蟾、大鼠、兔、鸡及鱼的。但现有这些 检测方法存在操作复杂,而且时间长,费用高,难以满足现有的快速 筛查的需求。



技术实现要素:

为了克服现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种检测环境 中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法,该方法快速简便、成本低廉、 省时省力,能够反映环境样品中甲状腺激素干扰物效应,并通过标准 曲线计算得到样品中甲状腺激素干扰物的毒性当量值,可以作为环境 样品和可疑甲状腺激素干扰物的快速筛查手段。

为实现上述目的,本发明的技术方案是:

采用大鼠垂体瘤GH3细胞作为检测手段,半贴壁培养至指数生 长期,加入环境样品的有机溶剂提取液,继续培养后,加入MTT溶 液,通过酶标仪490nm波长检测光密度值,以3,3',5-三碘-L-甲腺原 氨酸(简称T3)为标准化合物,绘制T3对GH3细胞的生长诱导的 剂量-效应关系标准曲线,进而评价样品中甲状腺激素干扰物的毒性 效应。

本发明检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的具体方法如下:

S1、接种:取96孔板,选择生长良好的大鼠垂体瘤GH3细胞制 备5×104个/mL的细胞悬液,按照200μL/孔接种,于含5%CO2的培 养箱中37℃条件下培养2-3d;

S2、上样:待细胞贴壁后,取步骤S1得到的96孔板,弃去上清 液;取离心管,每个离心管中加入990μL无酚红F12培养基,再加 入10μL溶于DMSO的待测样品;另外取离心管,添加10μL DMSO 作为对照,按每孔200μL添加于96孔板中,在CO2培养箱中暴露96h;

S3、反应:反应结束前4h取出步骤S2得到的96孔板,弃去上 清液,每孔加入MTT溶液50μL,置于CO2培养箱中继续孵育4h, 待反应产物甲瓒(英文:formazan)结晶形成后,小心吸取上清液, 加入150μL DMSO终止反应,室温下于96孔板摇床震荡充分溶解还 原产物;

S4、样品检测:用酶标仪检测步骤S3待测样品反应液的光密度 值;

S5、标准曲线制作:以时间为横坐标,酶标仪检测经过步骤S3 反应后不同浓度的T3的反应液的光密度值为纵坐标,绘制剂量-效 应标准曲线,将样品的光密度值与标准曲线对比得到样品的T3毒性 当量。

优选地,步骤S1中接种大鼠垂体瘤GH3细胞的方法是:取经过 传代培养至对数生长期的大鼠垂体瘤GH3细胞,弃去培养液,加入 DMEM胰酶和EDTA进行消化,消化完全后加入胎牛血清终止消化, 然后将GH3细胞吹打脱壁,吸至无菌培养瓶中加入培养基调节细胞 浓度,混匀后用血小球计数板计数,再接种至96孔板中。

优选地,步骤S1消化完全后加入的胎牛血清为新鲜胎牛血清, 添加量为2ml。

优选地,所述大鼠垂体瘤GH3细胞的培养方法如下:

(a)冻存:在F10培养基中加入10%-50%血清和8%DMSO配 制成冻存液,将大鼠垂体瘤GH3细胞在冻存液中混匀,加入冻存管 中,离心后吸出上清液,再加入冻存液吹打均匀,放入冻存盒置-80℃ 冰箱梯度降温3h以上,然后转放入液氮罐中保存;

(b)复苏:从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管,于 温水中水浴融化,离心、吸去上清液,加入10mL含15%胎牛血清和 5%马血清的F10培养基吹散均匀,置于5%CO2的恒温箱37℃条件 下培养;

(c)传代培养:24h后取出细胞培养瓶,用弯头吸管将培养基 吸出,用PBS缓冲液清洗3遍,加入0.05%DMEM胰蛋白酶和 2.5%EDTA在37℃条件下消化1min,加入含15%胎牛血清与5%马 血清的F10培养基,反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层至全部 冲下,混匀吸取细胞悬液于新的培养瓶中,在细胞瓶中添加新的含 15%胎牛血清和5%马血清的F10培养基,于含5%CO2的培养箱中 37℃条件下培养。

优选地,酶检测仪检测光密度值的波长为490nm。

相比现有技术,本发明的有益效果在于:

首次发明了采用大鼠垂体瘤GH3细胞作为检测手段来检测环境 中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法,方法快速简便、成本低廉、省 时省力,能够到样品中甲状腺激素干扰物的毒性当量值,可以作为环 境样品和可疑甲状腺激素干扰物的快速筛查手段。

附图说明

图1表示T3溶液对GH3细胞增殖影响的剂量-效应关系标准曲 线图的吸光度值;

图2为MgSO4对GH3细胞增殖影响的作用图。

具体实施方式

下面,结合附图以及具体实施方式,对本发明做进一步描述:

实施例1T3诱导标准曲线的绘制

1、大鼠垂体瘤GH3细胞的培养

(a)冻存:在F10培养基中加入10%-50%血清和8%DMSO配 制成冻存液,将大鼠垂体瘤GH3细胞在冻存液中混匀,加入冻存管 中,离心后吸出上清液,再加入冻存液吹打均匀,放入冻存盒置-80℃ 冰箱梯度降温3h以上,然后转放入液氮罐中保存;

(b)复苏:从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管,于 温水中水浴融化,离心、吸去上清液,加入10mL含15%胎牛血清和 5%马血清的F10培养基吹散均匀,置于5%CO2的恒温箱37℃条件 下培养;

(c)传代培养:24h后取出细胞培养瓶,用弯头吸管将培养基 吸出,用PBS缓冲液清洗3遍,加入0.05%DMEM胰蛋白酶和 2.5%EDTA在37℃条件下消化1min,加入含15%胎牛血清与5%马 血清的F10培养基,反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层至全部 冲下,混匀吸取细胞悬液于新的培养瓶中,在细胞瓶中添加新的含 15%胎牛血清和5%马血清的F10培养基,于含5%CO2的培养箱中 37℃条件下培养。

2、T3对GH3细胞增殖量的剂量-效应关系标准曲制作

S1、接种:取生长良好的大鼠垂体瘤GH3细胞(显微镜下观察,培养液中无杂质、细胞无悬浮或微量悬浮、细胞饱满透明,细胞贴壁均匀、细胞发亮),制备5×104个/mL的细胞悬液,;取96孔板,按 照200μL/孔接种,于含5%CO2的培养箱中37℃条件下培养2-3d;

S2、上样:取步骤S1得到的96孔板,弃去培养液;取离心管, 每个离心管中加入990μL无酚红F12培养基,再分别加入10μL溶于 DMSO的浓度各为1×10-12mol/L、5×10-12mol/L、1×10-11mol/L、5×10 11mol/L、1×10-10mol/L、5×10-10mol/L、1×10-8mol/L、1×108mol/L 的T3溶液;另外取离心管,添加10μL DMSO作为对照,按每孔 1000μL添加于96孔板中,在CO2培养箱中暴露96h;

S3、反应:反应结束前4h取出步骤S2得到的96孔板,弃去上 清液,每孔加入MTT溶液50μL,置于CO2培养箱中继续孵育4h, 4h后加入150μL DMSO终止反应,室温下于96孔板摇床混匀;

S4、检测:用酶标仪在波长为490nm条件下检测步骤S3样品反 应液的光密度值;

S5、标准曲线制作:

以T3诱导的细胞增殖光密度值为纵坐标,T3浓度为横坐标,绘 制标准曲线,如附图1所示。

由附图可得出:3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸的最低效应值出现在5 ×10-10mol/L,最高效应值出现在1×10-8mol/L,EC50值约为2×10-10 mol/L,检测区间为5×10-10mol/L-1×10-8mol/L。与其他诸多研究结 果有可比较性,离体大鼠垂体瘤能适应各个实验室条件,对甲状腺激 素物质有着较一致的灵敏反应。

实施例2重金属样品样品甲状腺激素干扰物诱导活性的检测

1、大鼠垂体瘤GH3细胞的培养

(a)冻存:在F10培养基中加入10%-50%血清和8%DMSO配 制成冻存液,将大鼠垂体瘤GH3细胞在冻存液中混匀,加入冻存管 中,离心后吸出上清液,再加入冻存液吹打均匀,放入冻存盒置-80℃ 冰箱梯度降温3h以上,然后转放入液氮罐中保存;

(b)复苏:从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管,于 温水中水浴融化,离心、吸去上清液,加入10mL含15%胎牛血清和 5%马血清的F10培养基吹散均匀,置于5%CO2的恒温箱37℃条件 下培养;

(c)传代培养:24h后取出细胞培养瓶,用弯头吸管将培养基 吸出,用PBS缓冲液清洗3遍,加入0.05%DMEM胰蛋白酶和 2.5%EDTA在37℃条件下消化1min,加入含15%胎牛血清与5%马 血清的F10培养基,反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层至全部 冲下,混匀吸取细胞悬液于新的培养瓶中,在细胞瓶中添加新的含 15%胎牛血清和5%马血清的F10培养基,于含5%CO2的培养箱中 37℃条件下培养。

2、重金属样品甲状腺激素诱导活性检测

S1、接种:取经过传代培养至对数生长期的大鼠垂体瘤GH3细 胞,弃去培养液,加入DMEM胰酶和EDTA进行消化,消化完全后 加入2ml当天采得的新鲜胎牛血清终止消化,然后将GH3细胞吹打 脱壁,吸至无菌培养瓶中加入培养基调节细胞浓度,制成5×104个 /mL的细胞悬液;取96孔板,按照200μL/孔接种,于含5%CO2的 培养箱中37℃条件下培养2-3d;

S2、上样:取步骤S1得到的96孔板,弃去培养液;取离心管, 每个离心管中加入990μL无酚红F12培养基,再分别加入10μL溶于 DMSO的MgSO4溶液(浓度为1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5); 另外取离心管,添加10μL DMSO作为对照,按每孔200μL添加于 96孔板中,在CO2培养箱中暴露96h;

S3、反应:反应结束前4h取出步骤S2得到的96孔板,弃去溶 液,每孔加入MTT溶液50μL,置于CO2培养箱中继续孵育4h,4h 后加入150μL DMSO终止反应,室温下于96孔板摇床混匀;

S4、检测:用酶标仪在波长为490nm的条件下检测步骤S3待测 样品反应液的光密度值,结果如附图2所示,将检测到的光密度值与 标准曲线对比得到金属样品的T3毒性当量。

对本领域的技术人员来说,可根据以上描述的技术方案以及构思, 做出其它各种相应的改变以及形变,而所有的这些改变以及形变都应 该属于本发明权利要求的保护范围之内。

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