本发明涉及医药检验技术领域，特别涉及一种革兰氏阴性菌自动药敏试验装置及应用方法。
背景技术：
大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、沙门氏菌等是主要人畜共患革兰氏阴性病原菌，可造成腹泻及其他感染，给人类健康、畜禽养殖业等生活与生产都带来了极大的危害。抗菌药物的使用极大降低了这种危害，是人类、畜禽、渔业等医学史上重要的里程碑之一。使用抗生素正确的治疗方法应为在患者感染初期进行感染菌培养和药敏试验，以指导临床合理选用药物。同时，监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，也为经验性用药提供参考，从而避免因盲目用药造成的病原菌耐药性。
药敏试验即指在体外测定病原菌对某种抗菌药物的敏感或耐受程度。目前，在常规的临床微生物工作中，药敏试验多采用纸片法、稀释法和抗生素浓度梯度法等。纸片检验法是通过观察贴在固体培养基表面上药物纸片形成的药物抑菌圈来确定细菌对药物的敏感性；稀释法和抗生素浓度梯度法是通过观察检测不同药物和不同药物浓度试验容器中细菌的生长情况来确定其对药物的敏感性。这些方法均需经过较长的周期(一般不少于1周)。如果在药敏试验得到结果后再治疗，就会严重影响治疗时机的选择。近年来，基于分子生物学技术(如聚合酶链式反应、基因芯片、全基因组测序等)的快速方法也得到了广泛的研究，药敏试验周期得到了明显缩短，但仍然存在操作繁琐、费用高的问题，且不能获得最低抑菌浓度(mic)值。此外，还有利用仪器鉴定药物敏感性的方法(例如bactec-tb460系统及bactec960系统)，其优点是自动化程度较高，操作简单，试验过程时间较短，但仪器和使用成本都很高，不易推广。
技术实现要素：
本发明一方面提供了一种革兰氏阴性菌自动药敏试验装置。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种革兰氏阴性菌自动药敏试验装置，包括：温控装置，其具有恒温腔，所述恒温腔内设置若干个顶端开口的测定工作通道；每个测定工作通道包括依次同轴设置的接收电极l、接收电极s和激励电极a，三个电极均通过固定板竖直固定在恒温腔中；一次性检测管，为一端开口，另一端封闭的玻璃管或pvc管，所述一次性检测管通过恒温腔顶端的开口插入测定工作通道内并从所述接收电极l、接收电极s和激励电极a中穿过；一次性细菌滤器，可拆卸连接于所述一次性检测管的顶端。温控装置为现有产品，恒温腔的温度在0～70℃范围内可调，腔内温度不均匀度≤0.5℃。
革兰氏阴性菌自动药敏试验装置的工作原理：一次性检测管内装有含抗生素的待测菌培养液，插在测定工作通道中，在激励电极a上施加一个高频交流信号，该信号通过检测管与电极之间的空气、检测管管壁与管内的被测混合液形成耦合电容c复，与接收电极l和接收电极s之间的溶液分别构成等效电阻rl和rs，因此在接收电极上分别得到两个电容-电阻耦合复值(c-r)复l和(c-r)复s。由于只有反映溶液导电能力变化的电阻值与细菌活动呈相关性，其他信号值会对检测形成干扰，故通过电容耦合非接触电导监测器实时采集并记录接收电极(c-r)复l和(c-r)复s的差值(记作电导率差值δc)来降低干扰信号，以增强标示细菌增殖信号的灵敏度。
进一步地，还包括电容耦合非接触电导监测器和计算机，所述接收电极l、接收电极s和激励电极a分别与电容耦合非接触电导监测器连接，所述计算机与电容耦合非接触电导监测器连接。电容耦合非接触电导监测器型号为er815，产自澳大利亚edaq公司，内装电容耦合非接触电导监测器驱动程序teraterm。
具体地，接收电极l、接收电极s和激励电极a均为壁厚0.95mm的铜筒，所述激励电极a、接收电极s和接收电极l的长度分别为16mm、16mm和10mm。铜筒电极的外径为4.00mm，内径为3.05mm。
根据实际试验工作的需要和er815的性能，测定工作通道数量为1、8、16、24或32个。
在某些实施方式中，所述一次性检测管的长度为12±2cm，内、外径分别为2.60mm和3.00mm。
优选地，所述一次性细菌滤器选用0.22μm。
本发明另一方面提供了一种革兰氏阴性菌自动药敏试验装置的应用方法，其采用上述的革兰氏阴性菌自动药敏试验装置进行药敏试验，包括如下步骤：
a.配制待测菌培养液；
b.配制抗生素溶液；
c.将待测菌培养液与抗生素溶液于灭菌后的一次性检测管中混合，一次性测管顶端插入一次性细菌滤器；
d.设定电容耦合非接触电导监测器的激励电压为1000v，激励频率为1.6mhz，信号采集与记录频率为1s/次，采集与记录次数为20000～30000；
e.将一次性检测管插入恒温腔中的测定工作通道中，电容耦合非接触电导监测器采集并记录接收电极s和接收电极l之间的电导率差值δc；
f.根据监测结束时所记录的电导率差值δc判断细菌增殖情况，当δc≥10.0μs/cm标示细菌增殖，δc≤1.0μs/cm标示细菌未增殖，由细菌未增殖的一次性检测管中抗生素的最低浓度得到该抗生素的最小抑菌浓度值(mic)。
进一步地，接收电极s和接收电极l之间的电导率差值δc处于1.0μs/cm和10.0μs/cm之间时，需要重做试验排除偶然误差。
抗生素溶液用超纯水和抗生素混合配制而成。
本发明中对所有可能造成污染的器皿、工具、耗材均要进行灭菌处理。
优选地，每个一次性检测管中接种的细菌为2至5个cfu(菌落计数单位)，每批次检测时各一次性检测管内接种量相同。
进一步地，待测菌培养液中细菌为革兰式阴性菌，所述革兰式阴性菌为幽门螺旋杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、志贺菌属、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、不动杆菌属、耶尔森菌属、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、副百日咳杆菌、巴斯德菌属、霍乱弧菌或副溶血性杆菌。
进一步地，抗生素溶液中的抗生素包括头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、呋喃妥因、复方新诺明、阿莫西林和克拉霉素中的一种或多种。
进一步地，所述恒温腔的温度调节范围为0～70℃，腔内温度不均匀度≤0.5℃。
药敏试验耗时，即采集与记录次数与频率的乘积，与被测定细菌种类及培养条件有关，一般≤12小时。
本发明仪器和方法与现有技术对比的有益效果：
(1)结构简易，便携性好，设备成本低；无需光学、化学等任何指示剂，使用成本低。
(2)测定时不受样品溶液浊度、散光等影响，因而无需过滤等相关前处理。
(3)自动化程度高，无需中间取样、培养后计数等步骤，操作简易。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明试验装置的结构示意图；
其中：1.一次性细菌滤器；2.接收电极l；3.接收电极s；4.激励电极a；5.一次性检测管；6.恒温腔；7.固定板。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的装配及使用作进一步的解释，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种革兰氏阴性菌自动药敏试验装置，如图1所示，包括：温控装置，其具有恒温腔6，恒温腔6内设置若干个顶端开口的测定工作通道；每个测定工作通道包括依次同轴设置接收电极l2、接收电极s3和激励电极a4，接收电极l2、接收电极s3和激励电极a4均通过固定板7竖直固定在恒温腔6中；一次性检测管5，为一端开口，另一端封闭的玻璃管或pvc管，一次性检测管通过恒温腔6顶端的开口插入测定工作通道内并从接收电极l2、接收电极s3和激励电极a4中穿过；一次性细菌滤器1，可拆卸连接于所述一次性检测管5的顶端。温控装置为现有产品，恒温腔6的温度在0～70℃范围内可调，空间温度不均匀度≤0.5℃。
进一步地，还包括电容耦合非接触电导监测器和计算机，接收电极l2、激励电极a4和接收电极s3分别与电容耦合非接触电导监测器连接，计算机与电容耦合非接触电导监测器连接。电容耦合非接触电导监测器型号为er815，产自澳大利亚edaq公司，内装电容耦合非接触电导监测器驱动程序teraterm。
在一个具体的实施例中，接收电极l2的下端与接收电极s3的上端之间距离为5mm，接收电极s3的下端与激励电极a4的上端之间距离为10mm。一个测定工作通道内的三个电极同轴安装。
具体地，接收电极l2、激励电极a4和接收电极s3均为铜筒电极，所述所述激励电极a4、接收电极s3和接收电极l2的长度分别为16mm、16mm和10mm。铜筒电极的外径为4.00mm，内径为3.05mm。
根据实际试验工作的需要和er815的性能，测定工作通道数量为1、8、16、24或32个。
在某些实施方式中，所述一次性检测管5的长度为12±2cm，内、外径分别为2.60mm和3.00mm。
优选地，所述一次性细菌滤器1选用0.22μm。
实施例1
痢疾杆菌的左氧氟沙星药敏试验
步骤一、照图1装配一个八工作通道装置，其中温控装置采用htpot50干式恒温器(合肥艾本森科学仪器有限公司)，0.22μm一次性细菌滤器1采用浙江爱吉仁科技股份有限公司产品；铜筒电极的外径为4.00mm，内径为3.05mm，其中激励电极a4、接收电极s3和接收电极l2的长度分别为16mm、16mm和10mm，每个测定工作通道内，三者依次排列，采用固定板7竖直固定在恒温腔6内的一条直线上，之间距离分别为10mm和5mm；将工作电极通过电源线与一个电容耦合非接触电导监测器(型号er815，澳大利亚edaq公司)连接，然后连接便携式计算机(型号e470c，联想公司，内装电容耦合非接触电导监测器驱动程序teraterm)。
步骤二、将恒温腔6设定为36℃，空间温度不均匀度≤0.5℃。
步骤三、灭菌所有可能造成污染的器皿、工具、耗材、液体肠杆菌科的强选择培养基，然后置于无菌室内冷却至室温。该培养基中牛肉粉、示月胨、乳糖、3号胆盐、枸橼酸钠、硫代硫酸钠和枸橼酸铁的浓度分别为5.0、5.0、10.0、8.5、8.5、8.5和1.0g/l。
步骤四、用超纯水配制0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0g/l系列浓度左氧氟沙星。
步骤五、取一个10ml离心管，加入8.0ml灭菌的液体肠杆菌科的强选择培养基。
步骤六、从事先培养好痢疾杆菌的培养皿中挑取16个生长状态好、特征明显的单个菌落，接种到10ml离心管中，混匀，形成待测菌培养液。
步骤七、采用长12cm、内外径分别为2.60mm和3.00mm的封底玻璃管作为一次性检测管5。向8个一次性检测管5中分别加入995μl待测菌培养液和5μl左氧氟沙星溶液，混匀，使得1至8号管中抗生素浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0mg/l。
步骤八、在每个一次性检测管5口塞上一个一次性细菌滤器1。
步骤九、在便携式计算机上启动电容耦合非接触电导监测器的工作软件teraterm，设定激励电压为1000v，激励频率为1.6mhz，信号采集与记录频率为1s/次，采集与记录次数为21600。
步骤十、将8个一次性检测管5分别插入8个测定工作通道，监测器自动采集并记录接收电极s3和接收电极l2之间的电导率差值δc。
步骤十一、药敏试验测定结束时，发现1至3号管中所记录的δc≥18.0μs/cm，标示细菌增殖了，而4至8号管中δc≤1.0μs/cm，标示细菌未增殖。从而得出mic值为2.0mg/l。
实施例2
左氧氟沙星和克拉霉素对幽门螺旋杆菌的协同药效表征
步骤一和步骤二同实施例1中步骤一和步骤二。
步骤三、灭菌所有可能造成污染的器皿、工具、耗材和液体幽门螺旋杆菌培养基(青岛海博生物技术有限公司)，然后置于无菌室内冷却至室温。
步骤四、用超纯水配制0.2、0.4、0.6和0.8g/l系列浓度的左氧氟沙星；用乙醇配制0.2、0.4、0.6和0.8g/l系列浓度的克拉霉素。
步骤五、取一个10ml离心管，加入8.0ml灭菌的液体幽门螺旋杆菌培养基。
步骤六、从事先培养好幽门螺旋杆菌的培养皿中挑取12个生长状态好、特征明显的单个菌落，接种到10ml离心管中，混匀，形成待测菌培养液。
步骤七、采用长12cm、内外径分别为2.60mm和3.00mm的封底pvc管作为一次性检测管5。向1至4号检测管分别加入995μl菌悬液和5μl左氧氟沙星溶液，混匀，使得其中左氧氟沙星浓度分别为0.10、0.20、0.30和0.40mg/l；向5至8号检测管分别加入990μl菌悬液、5μl左氧氟沙星溶液和5μl克拉霉素溶液，混匀，使得其中左氧氟沙星和克拉霉素的浓度都分别为0.10、0.20、0.30和0.40mg/l。
步骤八、在每个一次性检测管5口塞上一个一次性细菌滤器1。
步骤九、在便携式计算机上启动电容耦合非接触电导监测器的工作软件teraterm，设定激励电压为1000v，激励频率为1.6mhz，信号采集与记录频率为1s/次，采集与记录次数为28800。
步骤十、将8个一次性检测管5分别插入8个工作通道，监测器自动采集并记录接收电极s3和接收电极l2之间的电导率差值δc。
步骤十一、药敏试验测定结束时，发现1至4号管中δc≥22.0μs/cm，标示幽门螺旋杆菌增殖了，即没有被左氧氟沙星抑制生长。5号和6号管中δc≥17.0μs/cm，标示相应浓度的左氧氟沙星和克拉霉素联合也不能抑制细菌生长。但7号和8号管中δc≤1.0μs/cm，标示细菌未增殖。
步骤十二、采用长12cm、内外径分别为2.60mm和3.00mm的封底pvc管作为一次性检测管5。向1至4号检测管分别加入995μl菌悬液和5μl克拉霉素溶液，混匀，使得其中克拉霉素浓度分别为0.10、0.20、0.30和0.40mg/l。
步骤十三、在每个一次性检测管5口塞上一个一次性细菌滤器1。
步骤十四、将4个一次性检测管5同时插入4个工作通道，采用和步骤九、步骤十相同的方法测定电导率差值δc。
步骤十五、测定结束时，发现1至4号管中所记录的δc≥14.0μs/cm，标示幽门螺旋杆菌增殖了，即没有被克拉霉素抑制生长。
步骤十六、由步骤十一和步骤十五结果可知，0.20mg/l及以上浓度的克拉霉素对左氧氟沙星抑菌具有明显的协同作用，但不足以独立达到抑菌作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。