本发明属于生物法制备手性化合物，涉及一种应用皱褶假丝酵母脂肪酶立体选择性催化水解2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体合成单一构型的2-(4-甲基苯基)丙酸对映体的方法。将皱褶假丝酵母脂肪酶用于水解外消旋2-(4-甲基苯基)丙酸酯合成单一构型的(+)-2-(4-甲基苯基)丙酸。
背景技术：
2-(4-甲基苯基)丙酸是一种亲水性的合成非甾体高效抗炎药物中间体，由于其是合成洛索洛芬钠的药物前体。洛索洛芬钠一种非甾体消炎药抗炎效果好，副作用小。与其他非甾体抗炎药(nsaid)相比，作用明显且对胃肠道、肾脏毒害作用小。文献报道，对于非甾体高效抗炎药一般是(s)型对映体具有抗炎活性，而(r)型对映体无药效或有毒副作用；因此为了获得单一药物对映体必须首先获得单一药物中间体；为了减少给药量和对人体产生的毒副作用，开发单一对映体的制备方法具有重要意义。
单一手性药物对映体的获得方法主要有化学合成法和外消旋体拆分法。化学合成法易产生大量无效甚至对环境有害的对映体造成环境污染。到目前为止，工业应用中占主导地位的手性制备工艺仍然是外消旋体拆分法。它的工艺简单、易于工业化生产、成本较低、开发时间较短。常见的外消旋拆分技术包括结晶法、色谱法、膜法、酶或微生物法、萃取法等。其中手性溶剂萃取法因为容易实现连续生产、容易工业放大、操作简单、生产成本低、适用范围广等，正受到越来越多的关注，被认为是最具发展潜力和应用前景的手性拆分技术之一。目前困扰手性溶剂萃取法大规模工业应用的关键问题是手性萃取剂选择性不够高、产率低。而酶法拆分能够利用酶的高度立体、位点、区域选择性，催化化学合成的外消旋体或衍生物中的某一对映体进行水解以获得高产率、高选择性的单一对映体，具有选择性高、反应条件温和、反应较稳定及易于工业化的特点。同时，酶法拆分可以解决化学合成易造成环境污染，产生大量无效甚至对环境有害的对映体问题，对于保护人类的自然环境和健康具有极为重要的意义。
本发明中公开了一种利用皱褶假丝酵母脂肪酶立体选择性催化水解2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体合成单一构型的(+)-2-(4-甲基苯基)丙酸的方法，本发明利用皱褶假丝酵母脂肪酶对2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体的高选择性、高催化效率，利用绿色添加剂环糊精提高2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体的溶解度，获得底物转化率高、产物光学纯度高的(+)-2-(4-甲基苯基)丙酸。该技术解决了一般拆分技术所存在的低光学纯度和产率低的问题，同时该方法反应条件温和、绿色环保、操作简便。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种获得单一构型(+)-2-(4-甲基苯基)丙酸对映体的高效技术。
本发明针对于一般外消旋体拆分法分离手性对映体的产物光学纯度及其产率不高等难题，提出了一种获得单一构型(+)-2-(4-甲基苯基)丙酸的方法—利用皱褶假丝酵母脂肪酶对2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体的高选择性、高催化效率合成单一对映体(+)-2-(4-甲基苯基)丙酸的方法。
本发明的技术方案：首先将一定浓度的磷酸盐缓冲溶液作为反应体系，向磷酸盐缓冲溶液中加入一定量的环糊精；用磷酸调节溶液ph为3.0-9.0；将一定浓度的2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体和皱褶假丝酵母脂肪酶加入到上述溶液中，2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体的用量为5-120×10-3mmol，皱褶假丝酵母脂肪酶的浓度为5-60mg/ml，环糊精浓度为5-100mmol/l；于25ml的反应管中在一定转速下加热反应一定时间并对反应进行监测。并通过高效液相色谱仪对产物进行定性和定量检测；产物的光学纯度可达96.24%，底物转化率可达40.76%，立体选择性e可达145。
其中，磷酸盐选自磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾中的一种；
环糊精选自羟乙基-β-环糊精，羟丙基-β-环糊精，甲基化-β-环糊精，羧甲基-β-环糊精，磺丁基-β-环糊精中的其中一种；
2-(4-甲基苯基)丙酸酯选自2-(4-甲基苯基)丙酸甲酯、2-(4-甲基苯基)丙酸乙酯、2-(4-甲基苯基)丙酸丙酯、2-(4-甲基苯基)丙酸异丙酯、2-(4-甲基苯基)丙酸丁酯、2-(4-甲基苯基)丙酸异戊酯、2-(4-甲基苯基)丙酸己酯其中的一种。
本发明相比现有技术有如下优势：
本发明利用皱褶假丝酵母脂肪酶对2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体的高立体选择性、高催化效率以及环糊精对2-(4-甲基苯基)丙酸酯在水中的增溶作用，通过控制反应温度、磷酸盐缓冲溶液ph值、酶浓度、环糊精浓度等条件，可获得高产率、高选择性的(+)-2-(4-甲基苯基)丙酸，且该方法操作简便、反应条件温和、绿色环保、生物酶可重复利用。
【具体实施方式】
下面结合本发明的实施例对本发明做进一步说明：
一、测试与分析
本发明所述实施例中分离产物的对映体过剩量和底物转化率采用waterse2695高效液相色谱仪分析色谱柱为sunfiretmods-2色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)。
二、实施例
实施例1
将40×10-3mmol的2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体和10mg的皱褶假丝酵母脂肪酶依次加入到2mlph为6的磷酸二氢钠缓冲溶液中；于25ml的反应管中在300rpm、50℃下加热反应6h；底物转化率为12.40%，产物的光学纯度为92.12%。
实施例2
将20×10-3mmol的2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体和10mg的皱褶假丝酵母脂肪酶加入到1mlph为6的磷酸二氢钠缓冲溶液中；于25ml的反应管中在300rpm、反应温度为40℃，加热反应4h；此时，底物转化率为17.79%，产物的光学纯度为94.16%。
实施例3
将20×10-3mmol的2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体和10mg的皱褶假丝酵母脂肪酶加入到1mlph为6.5的磷酸二氢钠缓冲溶液中；于25ml的反应管中在300rpm、40℃下加热反应4h；此时，底物转化率为20.07%，产物的光学纯度为96.72%。
实施例4
将20×10-3mmol的2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体和12.5mg的皱褶假丝酵母脂肪酶加入到1mlph为6.5的磷酸二氢钠缓冲溶液中；于25ml的反应管中在300rpm、40℃下加热反应8h时间；此时，底物转化率为26.48%，产物的光学纯度为96.72%。
实施例5
将60×10-3mmol的2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体和12.5mg的皱褶假丝酵母脂肪酶加入到1mlph为6.5的磷酸二氢钠缓冲溶液中(缓冲溶液中含有35mmol/l的羟丙基-β-环糊精)；于25ml的反应管中在300rpm、40℃下加热反应20h；此时，底物转化率为20.15%，产物的光学纯度为97.82%。
实施例6
将60×10-3mmol的2-(4-甲基苯基)丙酸酯对映体和12.5mg的皱褶假丝酵母脂肪酶加入到1mlph=6.5的磷酸二氢钠缓冲溶液中(缓冲溶液中含有35mmol/l的羟丙基-β-环糊精)；于25ml的反应管中在300rpm、40℃下加热反应；对反应进度进行监测；当反应进行48h时底物转化率为40.76%，产物的光学纯度为96.24%。
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。