本发明涉及一种大豆蛋白肽及其制备方法和应用，属于食品加工技术领域。
背景技术：
骨质疏松症是一种因钙化骨密度降低、骨质致密物逐渐消失而导致骨髓腔扩大的系统性的骨骼疾病，其特征是骨组织的骨质量变低，骨质脆性增加，易发生骨折，是一项严重的健康问题，据研究表明骨质疏松症正影响着全球数千万人的健康。骨质量受多种因素的影响，包括遗传、营养、荷尔蒙变化、体育锻炼和生活习惯。而老龄化、运动不足、低体重、吸烟、低钙饮食、绝经和卵巢切除都是骨质疏松症的致病原因。尽管目前已有许多抗骨质疏松药物如双膦酸盐，选择性雌激素受体调节剂和降钙素等，但长期使用这些药物会导致严重的副作用，开发具有防治骨质疏松功能但无副作用的功能性食品成分是有益的。
大豆是中国第四大粮食作物，2016/17年度中国大豆总产量1294万吨，比上年度增加133万吨，预测2017/18年度，大豆总产量将达到1473万吨。大豆中蛋白质含量高达40%，是一种优质植物蛋白来源，作为大宗农产品加工的主要副产物，大豆蛋白有着丰富的来源和较高的产量，并且有着较高的营养价值。大豆蛋白的研究与利用已引起人们广泛的关注。而为了进一步提高大豆蛋白产品的营养性以及产品附加值，大豆多肽的研究成为了热门研究课题。
大豆多肽是通过将大豆蛋白水解,并进行进一步处理得到的分解产物。研究表明大豆多肽具有良好的生物活性,如降血压、降血糖、抗氧化以及增强骨密度等。evans等人发现大豆蛋白水解物能够降低绝经后妇女的骨转换，omim等人用大豆多肤喂养骨成型的小鼠,结果表明大豆多肽可明显增强小鼠的机械骨强度。但未有研究提及分子量大小的大豆蛋白肽对促进成骨细胞增殖活性的作用。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种具有促进成骨细胞增殖活性的大豆蛋白肽的制备方法，获得的大豆蛋白肽能够显著促进成骨细胞的增殖，提高了大豆蛋白的综合价值。
本发明的一种大豆蛋白肽的制备方法，具体包含以下步骤：
一、原料预处理：将大豆分离蛋白溶于超纯水中，配制成3～7%的溶液，调节溶液ph为7～9；
二、酶解：在步骤一所得溶液中加入碱性蛋白酶，加酶量为800～1600u/g，酶解温度为50℃，酶解时间为3～8h，90～95℃灭酶10～20min，室温冷却后以3000～4000r/min离心10～15min，所得上清液即为粗大豆肽液；
三、超滤分离：使用超滤膜对步骤二所得的大豆肽进行超滤分离，收集滤出液，冷冻干燥，得到初步分离纯化的大豆蛋白活性肽；
优选的，所使用超滤膜孔径为1~10kda超滤膜。
四、葡聚糖凝胶柱层析：选用交联葡聚糖sephadexg-15对步骤三所得的活性肽样品进行进一步分离，洗脱液为超纯水，蛋白浓度为0.5～2%，流速为1.5ml/min，检测波长为220nm，对洗脱所得的蛋白质按出峰曲线合并收集，浓缩后真空冷冻干燥；
五、通过cck-8法测定步骤四所得的大豆肽对于促进成骨细胞mc3t3-e1增殖的活性，表明所得的大豆肽具有良好的促进成骨细胞增殖活性。
本发明还公开了采用上述方法制备得到的大豆蛋白肽，及所述大豆蛋白肽在制备促进成骨细胞增殖的食品或药品中的应用。
本发明具有促进成骨细胞增殖活性的大豆蛋白肽的制备方法，是以大豆分离蛋白为原料，利用碱性蛋白酶对大豆分离蛋白进行一定时间的酶解，得到具有促进成骨细胞增殖活性的大豆蛋白粗肽，再经超滤和葡聚糖凝胶层析对大豆蛋白肽进行分离纯化，并进行真空冻干得到最终产品的制备。本发明的大豆蛋白肽对成骨细胞具有显著的促进增殖作用，对预防和治疗骨质疏松药品的开发具有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例1的分离色谱图；
图2是本发明实施例4的增殖率平均值；
图3是本发明实施例4的增殖率平均值。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。本发明的保护内容不局限于以下实施例。
实施例1：将大豆分离蛋白溶于超纯水中，配制成3%的溶液，调节溶液ph为7；加入碱性蛋白酶，加酶量为800u/g，酶解温度为50℃，酶解时间为3h，90℃灭酶10min，室温冷却后以3000r/min离心10min，所得上清液即为粗大豆肽液；使用3kda超滤膜对大豆肽进行超滤分离，收集滤出液，冷冻干燥；选用交联葡聚糖sephadexg-15进行进一步分离，洗脱液为超纯水，蛋白浓度为0.5%，流速为1.5ml/min，检测波长为220nm，对洗脱所得的蛋白质按出峰曲线合并收集，浓缩后真空冷冻干燥；通过cck-8法测定步骤四所得的大豆肽对于促进成骨细胞mc3t3-e1增殖的活性。
实施例2：将大豆分离蛋白溶于超纯水中，配制成5%的溶液，调节溶液ph为8；加入碱性蛋白酶，加酶量为1200u/g，酶解温度为50℃，酶解时间为5h，95℃灭酶15min，室温冷却后以3500r/min离心15min，所得上清液即为粗大豆肽液；使用10kda超滤膜对大豆肽进行超滤分离，收集滤出液，冷冻干燥；选用交联葡聚糖sephadexg-15进行进一步分离，洗脱液为超纯水，蛋白浓度为1%，流速为1.5ml/min，检测波长为220nm，对洗脱所得的蛋白质按出峰曲线合并收集，浓缩后真空冷冻干燥；通过cck-8法测定步骤四所得的大豆肽对于促进成骨细胞mc3t3-e1增殖的活性。
实施例3：将大豆分离蛋白溶于超纯水中，配制成7%的溶液，调节溶液ph为9；加入碱性蛋白酶，加酶量为1600u/g，酶解温度为50℃，酶解时间为8h，95℃灭酶20min，室温冷却后以4000r/min离心15min，所得上清液即为粗大豆肽液；使用1kda超滤膜对大豆肽进行超滤分离，收集滤出液，冷冻干燥；选用交联葡聚糖sephadexg-15进行进一步分离，洗脱液为超纯水，蛋白浓度为2%，流速为1.5ml/min，检测波长为220nm，对洗脱所得的蛋白质按出峰曲线合并收集，浓缩后真空冷冻干燥；通过cck-8法测定步骤四所得的大豆肽对于促进成骨细胞mc3t3-e1增殖的活性。
实施例4：大豆蛋白肽对成骨细胞增殖活性的影响
在模拟环境为5%co2，37℃和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养成骨细胞mc3t3-e1，每隔48h更换1次培养液，当细胞生长汇合率达到80%左右时，对细胞进行胰蛋白酶降解收集，在经过细胞计数器计数之后再加入新鲜培养液配置成50000个/ml的细胞悬浮液，按照每孔加100μl细胞悬浮液铺满96孔板，培养24h后分别加入0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、200μg/ml不同浓度梯度的大豆蛋白肽样品，继续培养24h、48h后加入10μl/孔cck-8溶液，在96孔板中继续培养2h，以便细胞和cck-8充分反应。在2h后37℃条件下使用酶标仪在450nm下测吸光值。记录加样组的吸光度od样品、不加样组的吸光度od对照、以及不含细胞孔的吸光度od空白。按以下公式计算细胞增殖率。
细胞增殖率=（od样品-od空白）/(od对照-od空白)
根据图2、图3可知葡聚糖凝胶分离的大豆蛋白肽组分1具有较好的促进成骨细胞增殖活性，其在加样24h和48h后的细胞增殖率可分别达到110%和116%。