本发明涉及环境检测技术领域，尤其涉及检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法。
背景技术：
甲状腺是脊椎动物非常重要的腺体，属于内分泌器官，其分泌的甲状腺激素是体内至关重要的新陈代谢调节物，在促进机体基础代谢、生长发育等方面发挥重要作用。如果胎儿发育期间甲状腺激素缺乏，将导致体型矮小、智力迟钝、骨骼营养不良以及新陈代谢低下等一些不良症状。同时，与中枢神经系统成熟相关的过程以及骨骼、肝脏和血液等的发育和功能维持都离不开甲状腺激素的调控。
近年来不断有研究证明，环境中的一些内分泌干扰物能影响下丘脑－腺垂体－甲状腺作用轴。这类影响生物体甲状腺激素的合成、分泌、运输、作用和代谢等过程的化合物统称为甲状腺激素干扰物(tdcs，thyroiddisruptingchemicals)。
由于甲状腺激素在基础代谢以及生长发育调节方面的重要作用，甲状腺激素干扰引起了科学界巨大的关注，同时环境甲状腺激素干扰物也成为继环境雌激素污染后最重要的一类内分泌干扰物。现有甲状腺激素干扰物的鉴别与毒性评价方法，主要有体外测试方法(in-vitro)与活体测试方法(invivo)两种，离体方法主要有t-screen筛选方法、重组雌激素受体基因酵母测试方法等；活体测试根据研究者研究领域等方面的不同，有利用非洲爪蟾、大鼠、兔、鸡及鱼的。但现有这些检测方法存在操作复杂，而且时间长，费用高，难以满足现有的快速筛查的需求。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法，该方法快速简便、成本低廉、省时省力，能够反映环境样品中甲状腺激素干扰物效应，并通过标准曲线计算得到样品中甲状腺激素干扰物的毒性当量值，可以作为环境样品和可疑甲状腺激素干扰物的快速筛查手段。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：
采用大鼠垂体瘤gh3细胞作为检测手段，半贴壁培养至指数生长期，加入环境样品的有机溶剂提取液，继续培养后，加入mtt溶液，通过酶标仪490nm波长检测光密度值，以3,3',5-三碘-l-甲腺原氨酸(简称t3)为标准化合物，绘制t3对gh3细胞的生长诱导的剂量-效应关系标准曲线，进而评价样品中甲状腺激素干扰物的毒性效应。
本发明检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的具体方法如下：
s1、接种：取96孔板，选择生长良好的大鼠垂体瘤gh3细胞制备5×104个/ml的细胞悬液，按照200μl/孔接种，于含5％co2的培养箱中37℃条件下培养2-3d；
s2、上样：待细胞贴壁后，取步骤s1得到的96孔板，弃去上清液；取离心管，每个离心管中加入990μl无酚红f12培养基，再加入10μl溶于dmso的待测样品；另外取离心管，添加10μldmso作为对照，按每孔200μl添加于96孔板中，在co2培养箱中暴露96h；
s3、反应：反应结束前4h取出步骤s2得到的96孔板，弃去上清液，每孔加入mtt溶液50μl，置于co2培养箱中继续孵育4h，待反应产物甲瓒(英文：formazan)结晶形成后，小心吸取上清液，加入150μldmso终止反应，室温下于96孔板摇床震荡充分溶解还原产物；
s4、样品检测：用酶标仪检测步骤s3待测样品反应液的光密度值；
s5、标准曲线制作：以时间为横坐标，酶标仪检测经过步骤s3反应后不同浓度的t3的反应液的光密度值为纵坐标，绘制剂量－效应标准曲线，将样品的光密度值与标准曲线对比得到样品的t3毒性当量。
优选地，步骤s1中接种大鼠垂体瘤gh3细胞的方法是：取经过传代培养至对数生长期的大鼠垂体瘤gh3细胞，弃去培养液，加入dmem胰酶和edta进行消化，消化完全后加入胎牛血清终止消化，然后将gh3细胞吹打脱壁，吸至无菌培养瓶中加入培养基调节细胞浓度，混匀后用血小球计数板计数，再接种至96孔板中。
优选地，步骤s1消化完全后加入的胎牛血清为新鲜胎牛血清，添加量为2ml。
优选地，所述大鼠垂体瘤gh3细胞的培养方法如下：
(a)冻存：在f10培养基中加入10％-50％血清和8％dmso配制成冻存液，将大鼠垂体瘤gh3细胞在冻存液中混匀，加入冻存管中，离心后吸出上清液，再加入冻存液吹打均匀，放入冻存盒置-80℃冰箱梯度降温3h以上，然后转放入液氮罐中保存；
(b)复苏：从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管，于温水中水浴融化，离心、吸去上清液，加入10ml含15％胎牛血清和5％马血清的f10培养基吹散均匀，置于5％co2的恒温箱37℃条件下培养；
(c)传代培养：24h后取出细胞培养瓶，用弯头吸管将培养基吸出，用pbs缓冲液清洗3遍，加入0.05％dmem胰蛋白酶和2.5％edta在37℃条件下消化1min，加入含15％胎牛血清与5％马血清的f10培养基，反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层至全部冲下，混匀吸取细胞悬液于新的培养瓶中，在细胞瓶中添加新的含15％胎牛血清和5％马血清的f10培养基，于含5％co2的培养箱中37℃条件下培养。
优选地，酶检测仪检测光密度值的波长为490nm。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
首次发明了采用大鼠垂体瘤gh3细胞作为检测手段来检测环境中甲状腺激素干扰物诱导活性的方法，方法快速简便、成本低廉、省时省力，能够到样品中甲状腺激素干扰物的毒性当量值，可以作为环境样品和可疑甲状腺激素干扰物的快速筛查手段。
附图说明
图1表示t3溶液对gh3细胞增殖影响的剂量－效应关系标准曲线图的吸光度值；
图2为mgso4对gh3细胞增殖影响的作用图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
实施例1t3诱导标准曲线的绘制
1、大鼠垂体瘤gh3细胞的培养
(a)冻存：在f10培养基中加入10％-50％血清和8％dmso配制成冻存液，将大鼠垂体瘤gh3细胞在冻存液中混匀，加入冻存管中，离心后吸出上清液，再加入冻存液吹打均匀，放入冻存盒置-80℃冰箱梯度降温3h以上，然后转放入液氮罐中保存；
(b)复苏：从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管，于温水中水浴融化，离心、吸去上清液，加入10ml含15％胎牛血清和5％马血清的f10培养基吹散均匀，置于5％co2的恒温箱37℃条件下培养；
(c)传代培养：24h后取出细胞培养瓶，用弯头吸管将培养基吸出，用pbs缓冲液清洗3遍，加入0.05％dmem胰蛋白酶和2.5％edta在37℃条件下消化1min，加入含15％胎牛血清与5％马血清的f10培养基，反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层至全部冲下，混匀吸取细胞悬液于新的培养瓶中，在细胞瓶中添加新的含15％胎牛血清和5％马血清的f10培养基，于含5％co2的培养箱中37℃条件下培养。
2、t3对gh3细胞增殖量的剂量-效应关系标准曲制作
s1、接种：取生长良好的大鼠垂体瘤gh3细胞(显微镜下观察，培养液中无杂质、细胞无悬浮或微量悬浮、细胞饱满透明，细胞贴壁均匀、细胞发亮)，制备5×104个/ml的细胞悬液,；取96孔板，按照200μl/孔接种，于含5％co2的培养箱中37℃条件下培养2-3d；
s2、上样：取步骤s1得到的96孔板，弃去培养液；取离心管，每个离心管中加入990μl无酚红f12培养基，再分别加入10μl溶于dmso的浓度各为1×10－12mol/l、5×10－12mol/l、1×10－11mol/l、5×10－11mol/l、1×10－10mol/l、5×10－10mol/l、1×10－8mol/l、1×10－8mol/l的t3溶液；另外取离心管，添加10μldmso作为对照，按每孔1000μl添加于96孔板中，在co2培养箱中暴露96h；
s3、反应：反应结束前4h取出步骤s2得到的96孔板，弃去上清液，每孔加入mtt溶液50μl，置于co2培养箱中继续孵育4h，4h后加入150μldmso终止反应，室温下于96孔板摇床混匀；
s4、检测：用酶标仪在波长为490nm条件下检测步骤s3样品反应液的光密度值；
s5、标准曲线制作：
以t3诱导的细胞增殖光密度值为纵坐标，t3浓度为横坐标，绘制标准曲线，如附图1所示。
由附图可得出：3,3',5-三碘-l-甲腺原氨酸的最低效应值出现在5×10-10mol/l，最高效应值出现在1×10-8mol/l，ec50值约为2×10-10mol/l，检测区间为5×10-10mol/l-1×10-8mol/l。与其他诸多研究结果有可比较性，离体大鼠垂体瘤能适应各个实验室条件，对甲状腺激素物质有着较一致的灵敏反应。
实施例2重金属样品样品甲状腺激素干扰物诱导活性的检测
1、大鼠垂体瘤gh3细胞的培养
(a)冻存：在f10培养基中加入10％-50％血清和8％dmso配制成冻存液，将大鼠垂体瘤gh3细胞在冻存液中混匀，加入冻存管中，离心后吸出上清液，再加入冻存液吹打均匀，放入冻存盒置-80℃冰箱梯度降温3h以上，然后转放入液氮罐中保存；
(b)复苏：从液氮罐中快速取出装有冻存细胞的冻存小管，于温水中水浴融化，离心、吸去上清液，加入10ml含15％胎牛血清和5％马血清的f10培养基吹散均匀，置于5％co2的恒温箱37℃条件下培养；
(c)传代培养：24h后取出细胞培养瓶，用弯头吸管将培养基吸出，用pbs缓冲液清洗3遍，加入0.05％dmem胰蛋白酶和2.5％edta在37℃条件下消化1min，加入含15％胎牛血清与5％马血清的f10培养基，反复吸取培养液轻轻吹打瓶壁上的细胞层至全部冲下，混匀吸取细胞悬液于新的培养瓶中，在细胞瓶中添加新的含15％胎牛血清和5％马血清的f10培养基，于含5％co2的培养箱中37℃条件下培养。
2、重金属样品甲状腺激素诱导活性检测
s1、接种：取经过传代培养至对数生长期的大鼠垂体瘤gh3细胞，弃去培养液，加入dmem胰酶和edta进行消化，消化完全后加入2ml当天采得的新鲜胎牛血清终止消化，然后将gh3细胞吹打脱壁，吸至无菌培养瓶中加入培养基调节细胞浓度，制成5×104个/ml的细胞悬液；取96孔板，按照200μl/孔接种，于含5％co2的培养箱中37℃条件下培养2-3d；
s2、上样：取步骤s1得到的96孔板，弃去培养液；取离心管，每个离心管中加入990μl无酚红f12培养基，再分别加入10μl溶于dmso的mgso4溶液(浓度为1×10-8，1×10-7，1×10-6，1×10-5)；另外取离心管，添加10μldmso作为对照，按每孔200μl添加于96孔板中，在co2培养箱中暴露96h；
s3、反应：反应结束前4h取出步骤s2得到的96孔板，弃去溶液，每孔加入mtt溶液50μl，置于co2培养箱中继续孵育4h，4h后加入150μldmso终止反应，室温下于96孔板摇床混匀；
s4、检测：用酶标仪在波长为490nm的条件下检测步骤s3待测样品反应液的光密度值，结果如附图2所示，将检测到的光密度值与标准曲线对比得到金属样品的t3毒性当量。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。