相关申请的交叉引用
本申请在35u.s.c.§119下要求2011年10月4日提交的美国临时申请系列号61/543,242、2011年2月2日提交的美国临时申请系列号61/438,903、2011年1月28日提交的美国临时申请系列号61/437,503、和2210年11月15日提交的美国临时申请系列号61/413,905的优先权。前述申请与本申请共有，并且它们的整个内容特此明确地通过引用以整体并入，如同在本文中完整地阐述。
本发明一般地涉及用于体外和体内递送生物活性剂的转染试剂领域。更具体地，本发明涉及可生物降解的且生物相容的脂质和使用它们制备的转染复合物，所述转染复合物可以用于将核酸或其它生物活性剂引入体外或体内细胞中。
背景技术：
基因治疗(诸如通过施用基于核苷酸的药物来治疗疾病)已经变成一个重要的医学领域。通常，近年来已经使用了作为基因转移载体的经修饰的病毒。但是，当使用病毒载体时对可能的不希望的副作用(诸如不希望的免疫应答)的担心，已经导致开发非病毒替代物(例如，聚合的递送系统、脂质体制剂和“裸”dna注射剂)的努力。尽管这些替代方案尚未实现病毒载体的临床有效性，由这些方法提供的潜在安全性、加工和经济效益是有前途的。
因此，需要更好的无毒的、可生物降解的、生物相容的脂质，其可容易地且经济地、有效地制备以用于转染核酸。这样的脂质具有几种用途，包括在基因治疗中以及在诊断剂、治疗剂和预防剂的包装和/或递送中递送核酸。本发明的说明书描述了这样的新转染试剂及其合成方法。
技术实现要素：
本发明涉及含胺的转染试剂及其合成方法。本发明的其它实施方案涉及含胺的转染试剂用于制备转染复合物的用途，所述转染复合物适用于一种或多种生物活性剂向体外细胞或人或动物体内组织的细胞内递送。
根据本发明的一些实施方案，提供了具有一般结构i的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物：
其中x1和x2中的每一个是独立地选自下述的部分：o、s、n-a和c-a，其中a选自氢和c1-c20烃链；y和z中的每一个是独立地选自下述的部分：ch-oh、c＝o、c＝s、s＝o和so2；r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7中的每一个是独立地选自下述的部分：氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基，x是独立地具有1-10(包括端值)的值的整数，n是独立地具有1-3(包括端值)的值的整数，m是独立地具有0-20(包括端值)的值的整数，p是独立地具有0或1的值的整数，其中如果m＝p＝0，那么r2是氢，其它条件是，如果n或m中的至少一个具有2的值，那么r3和在结构i中的氮形成选自下述的部分：
其中g、e和f中的每一个是独立地具有1-6(包括端值)的值的整数，“hcc”代表烃链，且每个*表示在结构i中的氮原子。
根据本发明的其它实施方案，提供了具有一般结构ii的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐：
其中当n＝p＝0时，r2是h。
根据本发明的其它实施方案，提供了用于合成具有结构i的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括，使一个或多个当量的不饱和组分与一个当量的氨基组分反应，所述不饱和组分包括至少2种选自下述的化合物：具有结构r1-x1-y-(cr4r5)n-br的第一中间体和具有结构r2-x2-z-(cr6r7)m-br的第二中间体，其中在所述结构的(cr4r5)n和(cr6r7)m部分中，每个r4是相同的或不同的，每个r5是相同的或不同的，每个r6是相同的或不同的，且每个r7是相同的或不同的，其中所述第一中间体和所述第二中间体是相同的或不同的，所述氨基组分包括伯胺nh2-r3、二胺、多胺或它们的组合。
本发明的含胺的转染化合物可以以中性形式或作为阳离子存在。在某些实施方案中，在位于或接近生理中性的ph(例如ph约5至约8)，根据本文描述的实施方案的含胺的转染化合物的优势形式是阳离子。在其它实施方案中，在位于或接近生理中性的ph(例如，ph约5至约8)，根据本文描述的实施方案的含胺的转染化合物的优势形式是中性的。
在另一组非限制性的实施方案中，本文提供了转染复合物，其适用于向体外或体内细胞或组织递送一种或多种生物活性剂。所述转染复合物可以包括本文所述的含胺的转染化合物中的一种或多种。在某些实施方案中，可以任选地与一种或多种辅助脂质相组合、任选地与一种或多种聚乙二醇化脂质相组合、任选地与一种或多种阳离子脂质相组合、和任选地与一种或多种靶向部分相组合，制备所述转染复合物。在某些实施方案中，可以用肽或非肽转染促进剂、融合肽或非肽试剂、肽或非肽胞内体释放剂或核靶向剂(例如，含有一种或多种核定位序列的肽，正如本领域技术人员无需过多实验即可容易地明白的)完成转染。
适用于制备和形成本文公开的转染复合物的辅助脂质可以包括，但不限于，胆固醇、胆固醇衍生物、一种或多种甾醇(包括植物甾醇、动物甾醇和藿烷类)、或者已知会实现或促进外源性生物活性分子向细胞或组织内部的引入的中性或阳离子脂质中的任一种。在某些实施方案中，可以在本文所述的转染复合物的配制中使用超过一种辅助脂质。
适合用作根据本文所述的实施方案的辅助脂质的示例性的、但非限制性的中性或阳离子脂质可以包括：饱和的和不饱和的烷基醚和脂环族醚以及胺、酰胺或其衍生物的酯。阳离子脂质的直链和支链烷基和烯烃基可以含有1至约25个碳原子。在某些实施方案中，直链或支链烷基或烯烃基具有6个或更多个碳原子。在某些实施方案中，直链或支链烷基或烯烃基具有8个至约20个碳原子。脂环族基团可以含有约6-30个碳原子，或者，在某些实施方案中，含有8-20个碳原子。在某些实施方案中，所述脂环族基团包括胆固醇和其它类固醇基团。可以用多种抗衡离子(阴离子)制备阳离子脂质，所述抗衡离子尤其包括：cl-、br-、i-、f-、乙酸根、三氟乙酸根、硫酸根、亚硝酸根、三氟甲基磺酸根和硝酸根。
预见到用于制备本文公开的转染复合物的示例性的、但非限制性的中性或阳离子脂质可以包括选自下述的一种或多种脂质：bmop(n-(2-溴乙基)-n,n-二甲基-2,3-二(9-十八烯基氧基)-丙铵溴化物)、ddpes(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺)、dspc、ctab:dope(鲸蜡基三甲基溴化铵(catb)和dope的制剂)、popc(1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dope(二油酰磷脂酰乙醇胺)、dmg、dmap(4-二甲基氨基吡啶)、dmpe(二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺)、domg、dma、dopc(二油酰磷脂酰胆碱)、dmpc(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)、dpepc(二棕榈酰乙基磷脂酰胆碱)、dodac(二油酰基二甲基氯化铵)、dosper(1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基精胺基)-丙基酰胺)、dotma(n-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵)、ddab(双十二烷基甲基溴化铵)、dotap(n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基-铵甲基硫酸盐)、dotap·cl、dc-chol(3,β-n,(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇)、dospa(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-n,n-二甲基-铵三氟乙酸盐)、dc-6-14(o,o'-双十四碳酰基-n-(α三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物)、dcpe(二己酰磷脂酰乙醇胺)、dlrie(二月桂基氧基丙基-3-二甲基羟基乙基溴化铵)、dodap(1,2-二油酰基-3-二甲铵-丙烷)、乙基-pc、dospa(2,3-二油酰基氧基-n-[2-(精胺甲酰氨基乙基]-n,n-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐)、dogs(双十八烷基酰氨基甘氨酰羧基精胺)、dmrie(n-[1-(2,3-二肉豆蔻基氧基)丙基]-n,n-二甲基-n-(2-羟乙基)溴化铵)、doepc(二油酰基乙基-磷酸胆碱)、dohme(n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n-[1-(2-羟乙基)]-n,n-二甲基碘化铵)、gap-dlrie:dope(n-(3-氨基丙基)-n,n-二甲基-2,3-二(十二烷氧基)-1-丙铵溴化物/二油烯基磷脂酰乙醇胺)、dppc(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、dopg(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(3-赖氨酰基(1-甘油))·cl)、n-月桂酰基肌氨酸、(r)-(+)-柠檬烯、卵磷脂(和它们的衍生物)；磷脂酰乙醇胺(和它们的衍生物)；磷脂酰乙醇胺类、二油酰磷脂酰乙醇胺)、dphpe(二植烷酰磷脂酰乙醇胺)、dppe(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、o-chol(3β[1-鸟氨酰胺氨甲酰基]胆固醇)、pope(棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；磷脂酰胆碱；磷脂酰胆碱类、dppc(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、popc(棕榈酰油酰磷脂酰胆碱)和二硬脂酰磷脂酰胆碱；磷脂酰甘油；基于哌嗪的阳离子脂质、磷脂酰甘油类，诸如dopg(二油酰磷脂酰甘油)、dppg(二棕榈酰磷脂酰甘油)和二硬脂酰磷脂酰甘油；磷脂酰丝氨酸(和它们的衍生物)；磷脂酰丝氨酸类，诸如二油酰基-或二棕榈酰磷脂酰丝氨酸；二季铵盐类诸如n,n'-二油烯基-n,n,n',n'-四甲基-1,2-乙二胺(tmedece)、n,n'-二油烯基-n,n,n',n'-四甲基-1,3-丙二胺(propece)、n,n'-二油烯基-n,n,n',n'-四甲基-1,6-己二胺(hexece)和它们的对应的n,n'-二鲸蜡基饱和类似物(tmedace、propace和hexace)、二磷脂酰甘油类；脂肪酸酯类；单阳离子转染脂质诸如1-脱氧-1-[双十六烷基(甲基)铵基]-d-木糖醇；1-脱氧-1-[甲基(双十四烷基)铵基]-d阿拉伯糖醇；1-脱氧-1-[双十六烷基(甲基)铵基]-d-阿拉伯糖醇；1-脱氧-1-[甲基(双十八烷基)铵基]-d阿拉伯糖醇、甘油酯类；鞘脂类；强心脂类(cardolipin)；脑苷脂类；和神经酰胺类；以及它们的混合物。中性脂质也包括胆固醇和其它3βoh-甾醇类以及它们的衍生物，磷脂酰胆碱或商购可得的阳离子脂质混合物，例如，
适用于制备和形成本文公开的转染复合物的聚乙二醇化脂质可以是这样的任意脂质或脂质混合物：其与本文所述的转染复合物的形成相容，且与所述转染复合物向动物、或向人体内、或向体外组织或细胞的施用相容。在本发明中使用的聚乙二醇化脂质包括具有下述分子量的peg聚合物：约250道尔顿至约12,000，或者，在某些实施方案中，约350道尔顿至约6,000道尔顿，或者，在某些实施方案中，约500道尔顿至约1,000道尔顿，或者，在某些实施方案中，约1,000道尔顿至约2,000道尔顿，或者，在某些实施方案中，约2,000道尔顿至5,000道尔顿。
在某些实施方案中，所述转染复合物可以包括一种或多种要递送至细胞或递送至体外或体内靶组织的生物活性剂。合适的生物活性剂可以包括这样的任意分子：所述分子能够与本文所述的含胺的转染试剂形成转染复合物，且当被递送至一个或多个细胞内部或被递送至体内或体外组织时会引起生物应答。预见到用于本文所述的实施方案中的生物活性剂可以是阳离子的、中性的或阴离子的试剂。通过非限制性例子，适用于配制转染复合物的示例性生物活性剂可以包括、但不限于：核酸(包括、但不限于单链或双链直链或环状dna分子(包括cdna分子)、单链或双链rna分子、小干扰rna(sirna)分子、小发夹rna(shrna)分子、微rna(mirna)分子、寡核苷酸、反义寡核苷酸、有义寡核苷酸)、多肽、抗体、寡肽、治疗性的肽或蛋白分子、肽核酸(pna)、阳离子的、阴离子的或中性的有机分子或药物，以及它们的药学上可接受的盐。
在本发明的某些非限制性的示例性实施方案中，提供了转染复合物和方法，其使用本发明的化合物将核酸分子递送进体外或体内细胞或组织中，包括将rna干扰分子(rnai)或小干扰rna分子(sirna、shrna或mirna)递送进细胞中用于抑制基因表达。
在某些非限制性的示例性实施方案中，还提供了转染复合物和方法，其使用本发明的化合物将mrna分子递送进体内或体外细胞或组织中，以促进特定蛋白或多种蛋白的表达。
在本发明的其它非限制性的示例性实施方案中，还提供了转染复合物和方法，其使用本发明的化合物将dna分子(包括cdna分子)递送进体内或体外细胞或组织中，以促进特定蛋白或多种蛋白的表达，或者以合成特定的rna分子，包括、但不限于mrna分子或rnai或mirna或shrna分子。
在某些实施方案中，本文所述的转染复合物可以任选地包括一种或多种融合肽或细胞穿透肽。融合肽或细胞穿透肽是能够促进含脂质复合物与细胞膜(质膜或胞内体膜)的融合的任何肽分子。多种融合肽或细胞穿透肽是本领域已知的，并且在从业人员的技能水平内，无需过多实验即可鉴别出合适的融合肽或细胞穿透肽及其在本发明中的使用条件。
在某些实施方案中，本文所述的转染复合物可以任选地包括一种或多种转染辅助剂或靶向部分。靶向部分可以是肽、经修饰的肽、抗体、经修饰的抗体、受体分子、经修饰的受体分子、单链或双链核酸分子、经修饰的单链或双链核酸分子、肽或核酸适体、经修饰的肽或核酸适体、有机分子、多糖、或这样的任意其它分子：所述分子能够将转染复合物靶向特定组织或细胞类型以给其靶向递送生物活性剂，正如本领域普通技术人员会容易地明白的。在某些实施方案中，肽、抗体、核酸、适体等的修饰可以包括，将所述肽、抗体、核酸、适体等与peg部分缀合。可替换地，肽、抗体、核酸、适体等的修饰可以包括，将所述肽、抗体、核酸、适体等与peg-脂质部分缀合。多种靶向部分是本领域技术人员广泛已知的，且都被预见到与本文所述的实施方案一起使用，但不限于此。
在某些实施方案中，本文提供的转染复合物可以稳定最多1年，且可以要么与要转染的细胞或组织接触，要么在形成后立即或不久施用给动物或人，或者可以任选地在与细胞或组织接触或施用给动物或人之前保存一段时间。所述转染复合物是稳定的，且可以在室温或在大于冰点直到约室温的温度保存下述时间段：至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少10小时、至少15小时、至少20小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少5天、至少7天、至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年。应当理解，本文所述的制剂可以包括一种或多种稳定剂、防腐剂、缓冲剂等，其辅助生物活性制剂的长期稳定和贮存，正如生物学和药学领域的熟练的从业人员会容易地理解的，且无需过度实验即可实现。还应当理解，贮存期可以是这些时间段中的任一种，例如31分钟至1小时，或1小时至24小时。
在某些实施方案中，提供了用于制备功能性转染复合物的方法。所述方法通常包括：通过在组合物中包囊生物活性剂，形成脂质聚集体，所述组合物含有本文所述的含胺的转染化合物中的一种或多种，任选地与一种或多种辅助脂质、稳定化脂质、转染辅助剂、聚乙二醇化脂质或靶向部分相组合。这样的方法可以包括：a1)在醇/水溶液中混合一种或多种含胺的转染化合物、至少一种辅助脂质(任选地超过一种辅助脂质)和一种或多种聚乙二醇化脂质或其盐，其中醇浓度<50％；a2)在使得一种或多种含胺的转染化合物以15％-50％存在的摩尔百分比，混合一种或多种含胺的转染化合物、至少一种辅助脂质(任选地超过一种辅助脂质)和一种或多种聚乙二醇化脂质或其盐；a3)在使得聚乙二醇化脂质以<50％存在的摩尔百分比，混合一种或多种含胺的转染化合物、至少一种辅助脂质(任选地超过一种辅助脂质)和一种或多种聚乙二醇化脂质或其盐；和a4)混合一种或多种含胺的转染化合物、至少一种辅助脂质(任选地超过一种辅助脂质)和一种或多种聚乙二醇化脂质或其盐，其中所述聚乙二醇化脂质具有约2000-12000的聚乙二醇分子量以及c6-c20烷基或c10-c20烯基的脂肪酸链长度；和在醇/水溶液中使所述脂质聚集体与生物活性剂复合以形成转染复合物，其中醇浓度<50％，优选地小于40％。在某些实施方案中，所述方法包括例如：a1)和a2)、a2)和a3)、a1)和a3)、a2)和a4)、a3)和a4)、a1)和a4)、或a1)-a)4。在某些实施方案中，所述醇是c1-c4醇。在某些实施方案中，所述醇是乙醇。在某些实施方案中，所述醇是药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇(二乙二醇单乙基醚tm)、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400或它们的混合物。在某些实施方案中，用于混合的醇不同于用于复合的醇。
本文描述的其它实施方案提供了为体内组织靶向(tissue-biased)递送筛选大量转染化合物的方法。这样的方法可以包括：制备多种含有化合物的转染复合物，所述化合物可容易地促进与试验转染化合物相组合的标志物的检测，将所述多种转染复合物中的每一种递送给试验动物，和检测所述标志物。
在某些实施方案中，用于筛选转染复合物的组织靶向(tissue-biased)递送的方法可以包括：制备多种转染复合物，每种转染复合物具有与至少一种促进向组织的递送的检测的核酸相组合的至少一种试验转染化合物。所述核酸可以是rna分子或dna分子，其编码可被直接检测的蛋白(例如，绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白、萤光素酶等)，或者编码这样的蛋白：所述蛋白影响可以直接检测的蛋白的表达。
在一个实施方案中，用于筛选转染复合物的组织靶向(tissue-biased)递送的方法可以包括：制备多种独特的转染复合物，每种转染复合物具有与编码绿色荧光蛋白的mrna或cdna相组合的至少一种试验转染化合物。每种独特的转染复合物可以静脉内地、皮下地递送给试验动物(诸如小鼠)或递送给其组织。在预定量的时间以后，可以从小鼠收获组织，并通过肉眼检查、组织学检查或通过分子检测(pcr、蛋白质印迹法等)，可以检测不同组织中的gfp的表达，以确定含有特定转染化合物的转染复合物递送至哪个或那些组织。
在一个实施方案中，用于筛选转染复合物的组织靶向(tissue-biased)递送的方法可以包括：制备多种独特的转染复合物，每种转染复合物具有与编码萤光素酶的mrna或cdna相组合的至少一种试验转染化合物。每种独特的转染复合物可以静脉内地、皮下地递送给试验动物(诸如小鼠)或递送给其组织。在预定量的时间以后，可以从小鼠收获组织，并通过肉眼检查、组织学检查或通过分子检测(pcr、蛋白质印迹法等)，可以检测不同组织中的萤光素酶的表达，或者使用
在一个实施方案中，用于筛选转染复合物的组织靶向(tissue-biased)递送的方法可以包括：制备多种独特的转染复合物，每种转染复合物具有与编码特定转录因子的mrna或cdna相组合的至少一种试验转染化合物。每种独特的转染复合物可以静脉内地、皮下地递送给转基因动物或递送给其组织，所述转基因动物表达在特定转录因子控制下的报道基因(例如，萤光素酶)。在预定量的时间以后，可以从转基因动物收获组织，并通过肉眼检查、组织学检查或通过分子检测(pcr、蛋白质印迹法等)，可以检测不同组织中的报道基因的表达。如果报道基因是萤光素酶，使用
参考下面的描述、附图和所附权利要求，将会更好地理解本发明的这些和其它特征。
附图说明
图1显示的图描绘了使用根据本发明的一些实施方案的化合物制备的脂质组合物的一些性能；
图2显示的图描绘了使用根据本发明的其它实施方案的化合物制备的脂质组合物的一些性能；
图3显示的图描绘了使用根据本发明的其它实施方案的化合物制备的脂质组合物的一些性能；
图4显示的图描绘了使用根据本发明的其它实施方案的化合物制备的脂质组合物的一些性能；和
图5显示的图描绘了使用根据本发明的其它实施方案的化合物制备的脂质组合物的一些性能。
图6a和6b显示了完整动物和完整组织固定图像，其描绘了使用根据本发明的其它实施方案的化合物制备的脂质组合物的一些性能。
图7a–7f显示的图描绘了使用根据本发明的其它实施方案的化合物制备的脂质组合物的一些性能。
具体实施方式
现在将详细地提及本发明的一些实施方案。尽管将结合下面讨论的实施方案来描述本发明，应该理解，它们无意将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明意图覆盖被包括在所附权利要求限定的发明内的替代方案、改进方案和等同方案。
i.定义和缩写
应当理解，本发明不限于特定装置或生物系统，它们当然可以变化。还应当理解，在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。因而，例如，对“脂质”的提及包括一种或多种脂质。还应当进一步理解，本文使用的任何术语仅用于描述特定实施方案的目的，无意成为限制性的。
贯穿本说明书使用的术语通常具有它们在本领域中、在本发明范围内、和在每个术语所使用的特定上下文中的普通含义。在下面或者在说明书中的别处讨论了某些术语，以给从业人员提供描述本发明的一般实施方案以及如何制备和使用它们的额外指导。容易理解，可以以超过一种方式描述相同的事物。所以，替代性的语言和同义词可以用于本文讨论的术语中的任意一种或多种，不能根据是否在本文中更详细地阐述或讨论术语来确定任何特殊的重要性。提供了某些术语的同义词。对一种或多种同义词的叙述不排除其它同义词的使用。在本说明书中的任何地方的实例(包括本文讨论的任何术语的实例)的使用仅仅是示例性的，且绝不限制本发明或任何例证的术语的范围和含义。
本发明的化合物可以以特定几何或立体异构形式存在。本发明预见到所有这样的化合物，包括顺式-和反式-(toms-)异构体、r-和s-对映异构体、非对映异构体、(d)-异构体、(l)-异构体、它们的外消旋混合物和它们的其它混合物，都落入本发明的范围内。其它不对称的碳原子存在于诸如烷基等取代基中。所有这样的异构体及其混合物意图被包括在本发明中。
根据本发明使用含有多种异构体比例中的任一种的异构混合物。例如，在组合仅2种异构体的情况下，含有50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2、99:1或100:0异构体的混合物都被本发明预见到。本领域普通技术人员会容易地明白，为更复杂的异构体混合物预见到类似的比例。例如，如果需要本发明的化合物的特定对映异构体，通过不对称合成或者通过用手性助剂衍生化来制备它，其中分离得到的非对映异构的混合物，并切掉辅助基团以得到纯的希望的对映异构体。可替换地，在所述分子含有碱性官能团(诸如氨基)或酸性官能团(诸如羧基)的情况下，用适当的光学活性的酸或碱形成非对映异构的盐，随后通过本领域众所周知的分步结晶或色谱法拆分如此形成的非对映异构体，并随后回收纯的对映异构体。
除非另外说明，本文使用的下述术语、定义和缩写意图具有下述含义：
本文使用的术语“保护基”表示这样的基团：其暂时阻断特定官能部分，例如，o、s或n，使得反应在多官能化合物中的另一个反应位点处选择性地进行。保护基以良好的产率选择性地反应，以产生对计划的反应稳定的受保护的底物，并且所述保护基可被不攻击其它官能团的可容易得到的试剂以良好的产率选择性地除去；所述保护基形成可容易地分离的衍生物；并且所述保护基具有最少的额外官能度(functionality)以避免其它反应位点。
如本文详细描述的，使用氧、硫、氮和碳保护基。示例性的羟基保护基的非限制性例子包括：甲基、甲氧基甲基(mom)、甲硫基甲基(mtm)、叔丁硫基甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(smom)、苄氧基甲基(bom)、对甲氧基苄氧基甲基(pmbm)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(p-aom)、愈创木酚甲基(gum)、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基(pom)、硅氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(mem)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、二(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基(semor)、四氢吡喃基(thp)、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基(mthp)、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基s,s-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(ctmp)、1,4-二噁烷-2-基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氢-7,8,8-三甲基-4,7-甲桥苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苯基氧硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苯甲基、对甲氧基苯甲基、3,4-二甲氧基苯甲基、邻硝基苯甲基、对硝基苯甲基、对卤苯甲基、2,6-二氯苯甲基、对氰基苯甲基、对苯基苯甲基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基n-氧代、二苯甲基、p,p'-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯甲基、α-萘基二苯甲基、对甲氧基苯基二苯甲基、二(对甲氧基苯基)苯甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4'-溴苯酰氧基苯基)二苯甲基、4,4′,4″-三(4,5-二氯邻苯二甲酰亚胺基苯基)甲基、4,4′,4″-三(乙酰丙酰氧基苯基)甲基、4,4′,4″-三(苯甲酰氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)二(4′,4″-二甲氧基苯基)甲基、1,1-二(4-甲氧基苯基)-1'-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1,3-苯并二硫杂环戊-2-基、苯并异噻唑基s,s-二氧代、三甲基甲硅烷基(tms)、三乙基甲硅烷基(tes)、三异丙基甲硅烷基(tips)、二甲基异丙基甲硅烷基(ipdms)、二乙基异丙基甲硅烷基(deips)、二甲基叔己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)、叔丁基二苯基甲硅烷基(tbdps)、三苯甲基甲硅烷基、三-对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯甲基甲硅烷基(dpms)、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基(tbmps)、甲酸酯、苯甲酰基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-氧代戊酸酯(乙酰丙酸酯)、4,4-(亚乙基二硫基)戊酸酯(乙酰丙酰基二硫基缩醛)、新戊酸酯、金刚烷酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(
为了保护1,2-或1,3-二醇，示例性的保护基的非限制性例子包括：亚甲基缩醛、亚乙基缩醛、1-叔丁基亚乙基缩酮、1-苯亚乙基缩酮、(4-甲氧基苯基)亚乙基缩醛、2,2,2-三氯亚乙基缩醛、丙酮化合物、亚环戊基缩酮、亚环己基缩酮、亚环庚基缩酮、亚苄基缩醛、对甲氧基亚苄基缩醛、2,4-二甲氧基亚苄基缩酮、3,4-二甲氧基亚苄基缩醛、2-硝基亚苄基缩醛、甲氧基亚甲基缩醛、乙氧基亚甲基缩醛、二甲氧基亚甲基原酸酯、1-甲氧基亚乙基原酸酯、1-乙氧基亚乙基原酸酯、1,2-二甲氧基亚乙基原酸酯、α-甲氧基亚苄基原酸酯、1-(n,n-二甲基氨基)亚乙基衍生物、α-(n,n'-二甲基氨基)亚苄基衍生物、2-氧杂亚环戊基原酸酯、二-叔丁基亚甲硅基(dtbs)、1,3-(1,1,3,3-四异丙基二亚硅氧烷基)衍生物(tipds)、四-叔丁氧基二硅氧烷-1,3-二亚基衍生物(tbds)、环状碳酸酯、环状硼酸酯、硼酸乙酯和硼酸苯酯。
示例性的氨基保护基的非限制性例子包括：氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸-9-芴基甲酯(fmoc)、氨基甲酸-9-(2-磺基)芴基甲酯、氨基甲酸-9-(2,7-二溴)芴基甲酯、氨基甲酸-2,7-二-叔丁基-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢噻吨基)]甲酯(dbd-tmoc)、氨基甲酸-4-甲氧基苯酰酯(phenoc)、氨基甲酸-2,2,2-三氯乙酯(troc)、氨基甲酸-2-三甲基甲硅烷基乙酯(teoc)、氨基甲酸-2-苯乙酯(hz)、氨基甲酸-1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙酯(adpoc)、氨基甲酸-1,1-二甲基-2-卤乙酯、氨基甲酸-1,1-二甲基-2,2-二溴乙酯(db-t-boc)、氨基甲酸-1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙酯(tcboc)、氨基甲酸-1-甲基-1-(4-联苯基)乙酯(bpoc)、氨基甲酸-1-(3,5-二-叔丁基苯基)-1-甲基乙酯(t-bumeoc)、氨基甲酸-2-(2'-和4'-吡啶基)乙酯(pyoc)、氨基甲酸-2-(n,n-二环己基甲酰氨基)乙酯、氨基甲酸叔丁酯(boc)、氨基甲酸-1-金刚烷酯(adoc)、氨基甲酸乙烯酯(voc)、氨基甲酸烯丙酯(alloc)、氨基甲酸-1-异丙基烯丙酯(ipaoc)、氨基甲酸肉桂酯(coc)、氨基甲酸-4-硝基肉桂酯(noc)、氨基甲酸-8-喹啉基酯、氨基甲酸-n-羟基哌啶基酯、氨基甲酸烷基二硫酯、氨基甲酸苯甲酯(cbz)、氨基甲酸对甲氧基苯甲酯(moz)、氨基甲酸对硝基苯甲酯、氨基甲酸对溴苯甲酯、氨基甲酸对氯苯甲酯、氨基甲酸-2,4-二氯苯甲酯、氨基甲酸-4-甲基亚磺酰基苯甲酯(msz)、氨基甲酸-9-蒽基甲酯、氨基甲酸二苯基甲酯、氨基甲酸-2-甲硫基乙酯、氨基甲酸-2-甲基磺酰基乙酯、氨基甲酸-2-(对甲苯磺酰基)乙酯、氨基甲酸-[2-(1,3-二噻烷基)]甲酯(dmoc)、氨基甲酸-4-甲基噻吩酯(mtpc)、氨基甲酸-2,4-二甲基噻吩基酯(bmpc)、氨基甲酸-2-磷鎓乙酯(peoc)、氨基甲酸-2-三苯基磷鎓异丙酯(ppoc)、氨基甲酸-1,1-二甲基-2-氰基乙酯、氨基甲酸间氯对酰氧基苯甲酯、氨基甲酸对(二羟基硼基)苯甲酯、氨基甲酸-5-苯并异噁唑基甲酯、氨基甲酸-2-(三氟甲基)-6-色酮基甲酯(tcroc)、氨基甲酸间硝基苯酯、氨基甲酸-3,5-二甲氧基苯甲酯、氨基甲酸邻硝基苯甲酯、氨基甲酸-3,4-二甲氧基-6-硝基苯甲酯、氨基甲酸苯基(邻硝基苯基)甲酯、吩噻嗪基-(10)-羰基衍生物、n'-对甲苯磺酰基氨基羰基衍生物、n'-苯基氨基硫羰基衍生物、氨基甲酸叔戊酯、氨基甲酸-s-苯甲基硫酯、氨基甲酸对氰基苯甲酯、氨基甲酸环丁酯、氨基甲酸环己酯、氨基甲酸环戊酯、氨基甲酸环丙基甲酯、氨基甲酸对癸氧基苯甲酯、氨基甲酸-2,2-二甲氧基羰基乙烯酯、氨基甲酸邻(n,n-二甲基甲酰氨基)苯甲酯、氨基甲酸-1,1-二甲基-3-(n,n-二甲基甲酰氨基)丙酯、氨基甲酸-1,1-二甲基丙炔基酯、氨基甲酸-二(2-吡啶基)甲酯、氨基甲酸-2-呋喃基甲酯、氨基甲酸-2-碘乙酯、氨基甲酸异硼烷酯、氨基甲酸异丁酯、氨基甲酸异烟酰酯、氨基甲酸-p-(p'-甲氧基苯偶氮基)苯甲酯、氨基甲酸-1-甲基环丁酯、氨基甲酸-1-甲基环己酯、氨基甲酸-1-甲基-1-环丙基甲酯、氨基甲酸-1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙酯、氨基甲酸-1-甲基-1-(对苯基偶氮苯基)乙酯、氨基甲酸-1-甲基-1-苯乙酯、氨基甲酸-1-甲基-1-(4-吡啶基)乙酯、氨基甲酸苯酯、氨基甲酸对(苯基偶氮基)苯甲酯、氨基甲酸-2,4,6-三叔丁基苯酯、氨基甲酸-4-(三甲基铵)苯甲酯、氨基甲酸-2,4,6-三甲基苯甲酯、甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯基乙酰胺、3-苯基丙酰胺、吡啶酰胺、3-吡啶基羧酰胺、n-苯甲酰基苯基丙氨酰基衍生物、苯甲酰胺、对苯基苯甲酰胺、邻硝基苯基乙酰胺、邻硝基苯氧基乙酰胺、乙酰乙酰胺、(n'-二硫代苄氧基羰基氨基)乙酰胺、3-(对羟基苯基)丙酰胺、3-(邻硝基苯基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻硝基苯氧基)丙酰胺、2-甲基-2-(邻苯基偶氮苯氧基)丙酰胺、4-氯丁酰胺、3-甲基-3-硝基丁酰胺、邻硝基肉桂酰胺、n-乙酰甲硫氨酸衍生物、邻硝基苯甲酰胺、邻(苯甲酰氧基甲基)苯甲酰胺、4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、n-邻苯二甲酰亚胺、n-二硫杂琥珀酰亚胺(dts)、n-2,3-二苯基马来酰亚胺、n-2,5-二甲基吡咯、n-1,1,4,4-四甲基二甲硅烷基氮杂环戊烷加合物(stabase)、5-取代的1,3-二甲基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、5-取代的1,3-二苯甲基-1,3,5-三氮杂环己-2-酮、1-取代的3,5-二硝基-4-吡啶酮、n-甲胺、n-烯丙基胺、n-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲胺(sem)、n-3-乙酰氧基丙胺、n-(1-异丙基-4-硝基-2-氧代-3-吡咯啉-3-基)胺、季铵盐、n-苯甲胺、n-二(4-甲氧基苯基)甲胺、n-5-二苯并环庚胺、n-三苯基甲胺(tr)、n-[(4-甲氧基苯基)二苯甲基]胺(mmtr)、n-9-苯基芴基胺(phf)、n-2,7-二氯-9-芴基亚甲基胺、n-二茂铁基甲基氨基(fcm)、n-2-吡啶甲基氨基n'-氧化物、n-1,1-二甲基硫基亚甲基胺、n-亚苄基胺、n-对甲氧基亚苄基胺、n-二苯基亚甲基胺、n-[(2-吡啶基)间三甲基苯基]亚甲基胺、n-(n',n'-二甲基氨基亚甲基)胺、n,n'-亚异丙基二胺、n-对硝基亚苄基胺、n-亚水杨基胺、n-5-氯亚水杨基胺、n-(5-氯-2-羟基苯基)苯基亚甲基胺、n-亚环己基胺、n-(5,5-二甲基-3-氧代-1-环己烯基)胺、n-硼烷衍生物、n-二苯基硼酸衍生物、n-[苯基(五羰基铬-或钨)羰基]胺、n-铜螯合物、n-锌螯合物、n-硝基胺、n-亚硝酸胺、胺n-氧化物、二苯基膦酰胺(dpp)、二甲基硫基膦酰胺(mpt)、二苯基硫基膦酰胺(ppt)、氨基磷酸二烷基酯、氨基磷酸二苯甲酯、氨基磷酸二苯酯、苯次磺酰胺、邻硝基苯次磺酰胺(nps)、2,4-二硝基苯次磺酰胺、五氯苯次磺酰胺、2-硝基-4-甲氧基苯次磺酰胺、三苯甲基次磺酰胺、3-硝基吡啶次磺酰胺(npys)、对甲苯磺酰胺(ts)、苯磺酰胺、2,3,6,-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺(mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(mte)、4-甲氧基苯磺酰胺(mbs)、2,4,6-三甲基苯磺酰胺(mts)、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺酰胺(imds)、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰胺(pmc)、甲磺酰胺(ms)、β-三甲基甲硅烷基乙磺酰胺(ses)、9-蒽磺酰胺、4-(4',8'-二甲氧基萘基甲基)苯磺酰胺(dnmbs)、苯甲基磺酰胺、三氟甲基磺酰胺和苯酰基磺酰胺。
无论单独使用还是在前面带有术语“任选地”，术语“取代”和本发明各式中所含的取代基都表示，用特定取代基替代给定结构中的氢基。当任何给定结构中的超过一个位置被超过一个选自特定组的取代基取代时，在每个位置处的取代基是相同的或不同的。术语“取代”包括有机化合物的所有可允许的取代基。从广义上看，可允许的取代基包括有机化合物的无环的和环状的、支链的和直链的、碳环的和杂环的、芳族和非芳族取代基。杂原子可具有氢取代基和/或本文所述的有机化合物的任何可允许的取代基，所述取代基满足所述杂原子的化合价。此外，本发明无意以任何方式受限于有机化合物的可允许的取代基。取代基和变量的组合是会导致形成稳定化合物的组合。
本文使用的术语“稳定的”表示这样的化合物：其具有足以允许制备的稳定性，并且会使化合物的完整性维持一段足以被检测出的时间，且优选一段足以用于本文所详述的目的的时间。
本文使用的术语“脂族基”包括饱和的和不饱和的、直链(即，未分枝)、支链、无环、环状或多环脂族烃，其任选地被一个或多个官能团取代。术语“脂族基”包括、但不限于：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基和环炔基部分。
术语“烷基”包括直链、支链和环状烷基。类似惯例适用于诸如“烯基”或“炔基”等其它通用术语。术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括被取代的和未被取代的基团。在本发明中烷基、烯基和炔基含有1-20个脂族碳原子。“低级烷基”用于表示具有1-6个碳原子的烷基(环状、无环、被取代的、未被取代的、支链或直链)。
示例性的脂族基团包括、但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、-ch2-环丙基、乙烯基、烯丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、-ch2-环丁基、正戊基、仲戊基、异戊基、叔戊基、环戊基、-ch2-环戊基、正己基、仲己基、环己基和-ch2-环己基部分，所述基团可具有一个或多个取代基。示例性的烯基包括、但不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基和1-甲基-2-丁烯-1-基。代表性的炔基包括、但不限于：乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)和1-丙炔基。
本文使用的术语“烷基”表示，通过除去单个氢原子从含有1-20个碳原子的烃部分衍生出的饱和直链或支链烃基。示例性的烷基包括、但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基和十二烷基。
本文使用的术语“烯基”表示，通过除去单个氢原子从具有至少一个碳-碳双键的烃部分衍生出的单价基团。示例性的烯基包括、但不限于：乙烯基、丙烯基、丁烯基和1-甲基-2-丁烯-1-基。
本文使用的术语“炔基”表示，通过除去单个氢原子从具有至少一个碳-碳三键的烃衍生出的单价基团。示例性的炔基包括、但不限于：乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)和1-丙炔基等。
本文使用的术语“烷氧基”和“硫烷基”表示，分别通过氧原子或通过硫原子与母体分子连接的如先前所定义的烷基。在某些实施方案中，烷基、烯基和炔基含有1-20个脂族碳原子。示例性的烷氧基包括、但不限于：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、新戊氧基和正己氧基。示例性的硫烷基包括、但不限于：甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、正丁硫基等。
本文使用的术语“烷基氨基”表示具有结构-nhr'的基团，其中r'是含有1-20个脂族碳原子的如上定义的脂族基团。示例性的烷基氨基包括、但不限于：甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、异丙基氨基、环丙基氨基、正丁基氨基、叔丁基氨基、新戊基氨基、正戊基氨基、己基氨基和环己基氨基。
本文使用的术语“二烷基氨基”表示具有结构-nrr1的基团，其中r和r1各自是含有1-20个脂族碳原子的如上定义的脂族基团。r和r1是相同的或不同的，或者连接以形成芳族或非芳族环状结构。示例性的二烷基氨基包括、但不限于：二甲基氨基、甲基乙基氨基、二乙基氨基、甲基丙基氨基、二(正丙基)氨基、二(异丙基)氨基、二(环丙基)氨基、二(正丁基)氨基、二(叔丁基)氨基、二(新戊基)氨基、二(正戊基)氨基、二(己基)氨基和二(环己基)氨基。示例性的环状二氨基烷基包括、但不限于：氮丙啶基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、吡咯基、咪唑基、1,3,4-三唑基和四唑基。
本文使用的术语“羧酸”表示含有式-cooh的基团的化合物。
本发明的化合物的上述脂族和其它部分的取代基的一些实例包括、但不限于：脂族基、杂脂族基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷硫基、芳硫基、杂烷硫基、杂芳硫基、-f、-cl、-br、-i、-oh、-no2、-cn、-cf3、-ch2cf3、-chcl2、-ch2oh、-ch2ch2oh、-ch2nh2、-ch2so2ch3、-c(o)rx、-co2(rx)、-con(rx)2、-oc(o)rx、-oco2rx、-ocon(rx)2、-n(rx)2、-s(o)2rx和-nrx(co)rx，其中rx在每次出现时独立地包括、但不限于：脂族基、杂脂族基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基，其中上文和本文所述的脂族基、杂脂族基、芳烷基或杂芳烷基取代基中的任一个是被取代的或未被取代的支链或直链、环状或无环基团，且其中上文和本文所述的芳基或杂芳基取代基中的任一个是被取代的或未被取代的。
本文使用的术语“芳基”和“杂芳基”表示，具有3-14个碳原子的稳定的单环或多环、杂环、多环和多杂环不饱和部分，所述碳原子中的每一个是被取代的或未被取代的。取代基包括、但不限于：上面关于脂族部分列举的任意取代基。术语“芳基”包括具有一个或两个芳族环的单环或双环碳环环系，包括、但不限于：苯基、萘基、四氢萘基、茚满基和。术语“杂芳基”包括具有5到10个环原子的环状芳族基团，所述环原子中的1-3个环原子选自s、o和n，且剩余的环原子为碳，所述基团经由任何环原子与分子的其它部分连接，所述杂芳基例如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基或异喹啉基。
芳基和杂芳基是未被取代的或被取代的，其中取代包括其上面的一个、两个、三个或三个以上氢原子独立地被包括但不限于以下部分中的任一个或多个部分替代：脂族基、杂脂族基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷基硫基、芳基硫基、杂烷基硫基、杂芳基硫基、-f、-cl、-br、-i、-oh、-no2、-cn、-cf3、-ch2cf3、-chcl2、-ch2oh、-ch2ch2oh、-ch2nh2、-ch2so2ch3、-c(o)rx、-co2(rx)、-con(rx)2、-oc(o)rx、-oco2rx、-ocon(rx)2、-n(rx)2、-s(o)2rx和-nrx(co)rx，其中rx在每次出现时独立地包括、但不限于：脂族基、杂脂族基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中上文和本文所述的脂族基、杂脂族基、芳烷基或杂芳烷基取代基中的任一个是被取代的或未被取代的支链或直链、环状或无环基团，且其中上文和本文所述的芳基或杂芳基取代基中的任一个是被取代的或未被取代的。
本文使用的术语“环烷基”尤其表示，具有3个到7个、优选3个到10个碳原子的基团。适当的环烷基包括、但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基，它们可以任选地被包括、但不限于下述的取代基取代：脂族基、杂脂族基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷基硫基、芳基硫基、杂烷基硫基、杂芳基硫基、-f、-cl、-br、-i、-oh、-no2、-cn、-cf3、-ch2cf3、-chcl2、-ch2oh、-ch2ch2oh、-ch2nh2、-ch2so2ch3、-c(o)rx、-co2(rx)、-con(rx)2、-oc(o)rx、-oco2rx、-ocon(rx)2、-n(rx)2、-s(o)2rx和-nrx(co)rx，其中rx在每次出现时独立地包括、但不限于：脂族基、杂脂族基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中上文和本文所述的脂族基、杂脂族基、芳烷基或杂芳烷基取代基中的任一个是被取代的或未被取代的支链或直链、环状或无环基团，且其中上文和本文所述的芳基或杂芳基取代基中的任一个是被取代的或未被取代的。
本文使用的术语“杂脂族基”表示，含有一个或多个例如氧、硫、氮、磷或硅原子以替代碳原子的脂族部分。杂脂族部分是支链、直链、环状或无环部分，并且包括饱和的和不饱和的杂环，诸如吗啉代、吡咯烷基等。通过用一个或多个包括、但不限于以下部分的部分独立地替代杂脂族部分上的一个或多个氢原子，对所述杂脂族部分进行取代：脂族基、杂脂族基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷基硫基、芳基硫基、杂烷基硫基、杂芳基硫基、-f、-cl、-br、-i、-oh、-no2、-cn、-cf3、-ch2cf3、-chcl2、-ch2oh、-ch2ch2oh、-ch2nh2、-ch2so2ch3、-c(o)rx、-co2(rx)、-con(rx)2、-oc(o)rx、-oco2rx、-ocon(rx)2、-n(rx)2、-s(o)2rx和-nrx(co)rx，其中rx在每次出现时独立地包括、但不限于：脂族基、杂脂族基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中上文和本文所述的脂族基、杂脂族基、芳烷基或杂芳烷基取代基中的任一个是被取代的或未被取代的支链或直链、环状或无环基团，且其中上文和本文所述的芳基或杂芳基取代基中的任一个是被取代的或未被取代的。
本文使用的术语“卤”和“卤素”表示选自氟、氯、溴和碘的原子。
术语“卤代烷基”表示，连接有一个、两个或三个卤素原子的如本文所定义的烷基，且其可通过诸如氯甲基、溴乙基和三氟甲基等基团示范说明。
本文使用的术语“杂环烷基”或“杂环”表示，具有1-3个独立地选自氧、硫和氮的杂原子的非芳族的5元、6元或7元环或多环基团，包括、但不限于双环或三环基团，包括稠合的6元环，其中：(i)每个5元环具有0-1个双键，且每个6元环具有0-2个双键；(ii)氮杂原子和硫杂原子任选地被氧化；(iii)氮杂原子可任选地季铵化；且(iv)上述杂环中的任一个与苯环稠合。代表性的杂环包括、但不限于：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基和四氢呋喃基。利用术语“被取代的杂环烷基或杂环基”，且如本文所使用，其表示通过用、但不限于以下基团独立替代其上一个、两个或三个氢原子而被取代的的如上文所定义的杂环烷基或杂环基：脂族基、杂脂族基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、烷氧基、芳氧基、杂烷氧基、杂芳氧基、烷基硫基、芳基硫基、杂烷基硫基、杂芳基硫基、-f、-cl、-br、-i、-oh、-no2、-cn、-cf3、-ch2cf3、-chcl2、-ch2oh、-ch2ch2oh、-ch2nh2、-ch2so2ch3、-c(o)rx、-co2(rx)、-con(rx)2、-oc(o)rx、-oco2rx、-ocon(rx)2、-n(rx)2、-s(o)2rx和-nrx(co)rx，其中rx在每次出现时独立地包括、但不限于：脂族基、杂脂族基、杂芳基、芳基烷基或杂芳基烷基，其中上文和本文所述的脂族基、杂脂族基、芳烷基或杂芳烷基取代基中的任一个是被取代的或未被取代的支链或直链、环状或无环基团，且其中上文和本文所述的芳基或杂芳基取代基中的任一个是被取代的或未被取代的。
在本发明的化合物中包含的示例性的非限制性的杂环和芳族杂环基团包括：3-甲基-4-(3-甲基苯基)哌嗪、3-甲基哌啶、4-(二-(4-氟苯基)甲基)哌嗪、4-(二苯甲基)哌嗪、4-(乙氧基羰基)哌嗪、4-(乙氧基羰基甲基)哌嗪、4-(苯甲基)哌嗪、4-(1-苯乙基)哌嗪、4-(1,1-二甲基乙氧基羰基)哌嗪、4-(2-(二-(2-丙烯基)氨基)乙基)哌嗪、4-(2-(二乙基氨基)乙基)哌嗪、4-(2-氯苯基)哌嗪、4-(2-氰基苯基)哌嗪、4-(2-乙氧基苯基)哌嗪、4-(2-乙基苯基)哌嗪、4-(2-氟苯基)哌嗪、4-(2-羟乙基)哌嗪、4-(2-甲氧基乙基)哌嗪、4-(2-甲氧基苯基)哌嗪、4-(2-甲基苯基)哌嗪、4-(2-甲基噻吩基)哌嗪、4-(2-硝基苯基)哌嗪、4-(2-硝基苯基)哌嗪、4-(2-苯乙基)哌嗪、4-(2-吡啶基)哌嗪、4-(2-嘧啶基)哌嗪、4-(2,3-二甲苯基)哌嗪、4-(2,4-二氟苯基)哌嗪、4-(2,4-二甲氧基苯基)哌嗪、4-(2,4-二甲苯基)哌嗪、4-(2,5-二甲苯基)哌嗪、4-(2,6-二甲苯基)哌嗪、4-(3-氯苯基)哌嗪、4-(3-甲基苯基)哌嗪、4-(3-三氟甲基苯基)哌嗪、4-(3,4-二氯苯基)哌嗪、4-3,4-二甲氧基苯基)哌嗪、4-(3,4-二甲苯基)哌嗪、4-(3,4-甲桥二氧基苯基)哌嗪、4-(3,4,5-三甲氧基苯基)哌嗪、4-(3,5-二氯苯基)哌嗪、4-(3,5-二甲氧基苯基)哌嗪、4-(4-(苯基甲氧基)苯基)哌嗪、4-(4-(3,1-二甲基乙基)苯甲基)哌嗪、4-(4-氯-3-三氟甲基苯基)哌嗪、4-(4-氯苯基)-3-甲基哌嗪、4-(4-氯苯基)哌嗪、4-(4-氯苯基)哌嗪、4-(4-氯苯甲基)哌嗪、4-(4-氟苯基)哌嗪、4-(4-甲氧基苯基)哌嗪、4-(4-甲基苯基)哌嗪、4-(4-硝基苯基)哌嗪、4-(4-三氟甲基苯基)哌嗪、4-环己基哌嗪、4-乙基哌嗪、4-羟基-4-(4-氯苯基)甲基哌啶、4-羟基-4-苯基哌啶、4-羟基吡咯烷、4-甲基哌嗪、4-苯基哌嗪、4-哌啶基哌嗪、4-(2-呋喃基)羰基)哌嗪、4-((1,3-二草脲胺-5-基)甲基)哌嗪、6-氟-1,2,3,4-四氢-2-甲基喹啉、1,4-二氮杂环庚烷、2,3-二氢吲哚基、3,3-二甲基哌啶、4,4-亚乙基二氧基哌啶、1,2,3,4-四氢异喹啉、1,2,3,4-四氢喹啉、氮杂环辛烷、十氢喹啉、哌嗪、哌啶、吡咯烷、硫代吗啉和三唑。
本文使用的术语“碳环”表示，环中的每个原子都为碳原子的芳族或非芳族环。
术语“独立地选自”在本文中表示，所述基团是相同的或不同的。
本文使用的术语“标记”意图表示，化合物与至少一种元素、同位素或化合物连接，以使得能够如下检测所述化合物：使用放射性标记或重同位素标记或免疫标记(诸如抗体或抗原)或从有色的、发光的、磷光的或荧光染料衍生出的标记。采用例如被一个或多个卤素部分取代的邻-、间-和对-叠氮基苯甲酰基的光亲和标记(包括、但不限于4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸)，被用于直接阐明生物系统中的分子间相互作用。
本文使用的术语“动物”可以表示人类以及非人动物，包括、例如，哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、灵长类动物或猪)、禽类、爬行动物、两栖动物和鱼。
术语“细胞”通常表示任意类型且来自任意来源的真核细胞。真核细胞的类型包括上皮细胞、成纤维细胞细胞、神经细胞、造血细胞和来自来自原代细胞、肿瘤细胞或永生化细胞系的类似细胞。这样的细胞的来源包括：任意的动物，诸如人、犬、小鼠、仓鼠、猫、牛、猪、猴、类人猿、绵羊、鱼、昆虫、真菌，和任意的植物，包括作物植物、藻类、观赏植物和树。
“递送”用于表示这样的过程：通过该过程，将所需化合物转移至靶细胞，使得所需化合物最终位于靶细胞内部或者在靶细胞膜中或表面上。在本发明的化合物的许多应用中，所需化合物不可被靶细胞容易地吸收，并且经由脂质聚集体或转染复合物来递送，即将所需化合物递送至细胞内的适当细胞隔室的方式。在某些应用中，特别是在体内条件下，向特定靶细胞类型的递送是优选的，且可以被本发明的化合物促进。
药物表示除了食物以外的任何治疗剂或预防剂，其被用于预防、诊断、减轻、治疗、或治愈人类或动物的疾病。
“试剂盒”表示转染或蛋白表达试剂盒，其包括一种或多种本发明的化合物或其混合物。这样的试剂盒可以包括运输装置，所述运输装置被分隔以在封闭空间中容纳一个或多个容器装置，诸如瓶、试管等。这样的容器装置中的每一个包含执行转染所需的组分或多种组分的混合物。这样的试剂盒可以包括一种或多种选自下述的组分：核酸(优选地一种或多种载体)、细胞、一种或多种本发明的化合物、形成脂质聚集体的化合物、转染促进剂、生物活性物质等。
当用在分子相互作用的上下文中时，术语“与……结合”表示，通过直接或间接共价或非共价相互作用连接的2个实体，所述相互作用例如氢键合、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性相互作用、静电相互作用等。
本文使用的术语“生物相容的”表示对细胞无毒的化合物。如果化合物向体外细胞的添加会导致小于或等于20％的细胞死亡，并且它们的体内施用不会诱导炎症或其它类似的不良作用，那么所述化合物是生物相容的。
本文使用的术语“可生物降解的”表示这样的化合物：当被引入细胞中时，其会分解成细胞可以再使用或处置的组分，而对细胞没有显著的毒性效应(即，当将所述组分添加给体外细胞时，少于约20％的细胞被杀死)。所述组分不会在体内诱导炎症或其它不良作用。分解可生物降解的化合物所依赖的化学反应通常无需催化。就活性剂而言，本文使用的术语“有效量”表示引起期望的生物应答所需的量。试剂或装置的有效量可以随诸如下述因素而变化：期望的生物端点、要递送的试剂、包囊基质的组成、靶组织等。“有效量的分子”的递送是足量的分子向细胞中的递送，使得所述分子引起生物应答，例如，调节细胞中的一个或多个基因的表达。在具体实施方案中，将有效量的分子递送至细胞，从而可以获得与所述细胞有关的疾病、病症或障碍的改善或改进。“有效量的sirna”或“有效量的rnai”的递送是，足量的sirna或其它rnai向细胞中的递送，以造成细胞中的靶基因的表达的减少。
术语“生物活性的试剂”、“生物活性剂”等通常表示这样的组合物、复合物、化合物或分子：其具有生物学效应，或者其修饰、造成、促进、增强、阻断或减少生物学效应，或者其增强或限制具有生物学效应的第二分子的产生或活性、与所述第二分子的反应和/或结合。所述第二分子可以、但不一定是内源分子(例如，通常存在于靶细胞中的分子，诸如蛋白或核酸)。生物学效应可以是，但不限于：刺激或造成免疫反应应答的效应；影响细胞、组织或生物体(例如，在动物中)中的生物学过程的效应；影响病原体或寄生物中的生物学过程的效应；产生可检测信号或造成可检测信号的产生的效应；调节蛋白或多肽的表达的效应；终止或抑制蛋白或多肽的表达的效应；或造成或增强蛋白或多肽的表达的效应。生物活性的组合物、复合物、化合物或分子可以用于研究性的、治疗性的、预防性的和诊断性的方法和组合物中，且通常起作用。
术语“阳离子脂质”表示，可以用于转染且其在生理条件下具有至少一个正电荷的任意阳离子脂质。尽管应当理解，形成本公开内容的基础的某些含胺的转染剂在生理条件下也作为阳离子存在，该术语也延伸至、但不限于可以用于共配制本文所述的转染复合物的任何阳离子辅助脂质。除了本文所述的新颖的含胺的转染剂以外的其它阳离子脂质可以包括、但不限于，例如，dospa、dotma、dmrie、dotap、dogs和tmtps、以及在本文中描述为“辅助脂质”的任意阳离子脂质。
“靶细胞”或“靶组织”表示，使用脂质聚集体或转染复合物作为所需化合物的载体，向其递送所需化合物的任何细胞或组织。
转染在本文中用于表示，将任意核酸、蛋白或其它大分子递送给体外或体内(即，在动物、植物或人中)靶细胞或组织，使得所述核酸、蛋白或其它大分子在所述细胞中表达、给所述细胞赋予表型、或在所述细胞中具有生物学功能。
术语“可表达的核酸”包括任意分子量的dna和rna，且术语“表达”是指核酸在细胞内的功能性存在的任何表现，包括、但不限于，瞬时表达和稳定表达。
本文使用的术语“转染复合物”通常表示这样的组合物：其被配制用于将生物活性剂(诸如核酸、蛋白、大分子等)递送给细胞或体内或体外组织。本文使用的转染复合物可以包括与要递送的生物活性化合物相组合的至少一种或多种含胺的转染化合物，除了要递送的生物活性剂以外，所述转染化合物任选地与一种或多种辅助脂质、一种或多种聚乙二醇化脂质、一种或多种靶向部分相组合。为了本文描述的目的，术语“转染复合物”可以视作与生物活性剂接触的脂复合物或脂质聚集体。因而，在下述公开内容的有些情况下，诸如脂复合物、脂质聚集体等术语可以用于表示缺少一种或多种生物活性剂或“净荷”的转染复合物。
本文使用的术语“辅助脂质”通常表示，适用于制备和形成本文公开的转染复合物的脂质。合适的辅助脂质可以包括，但不限于，胆固醇、胆固醇衍生物、甾醇类(包括植物甾醇、动物甾醇和藿烷类)、或者已知会实现或促进外源性生物活性分子向细胞或组织内部的引入的中性或阳离子脂质中的任一种。在某些实施方案中，可以在本文所述的转染复合物的配制中使用超过一种辅助脂质。预见到用于制备本文公开的转染复合物的示例性的、但非限制性的中性或阳离子脂质可以包括：选自下述的一种或多种脂质：bmop(n-(2-溴乙基)-n,n-二甲基-2,3-二(9-十八烯基氧基)-丙铵溴化物)、ddpes(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺)、dspc、ctab:dope(鲸蜡基三甲基溴化铵(catb)和dope的制剂)、popc(1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dope(二油酰磷脂酰乙醇胺)、dmg、dmap(4-二甲基氨基吡啶)、dmpe(二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺)、domg、dma、dopc(二油酰磷脂酰胆碱)、dmpc(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)、dpepc(二棕榈酰乙基磷脂酰胆碱)、dodac(二油酰基二甲基氯化铵)、dosper(1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基精胺基)-丙基酰胺)、dotma(n-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵)、ddab(双十二烷基甲基溴化铵)、dotap(n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基-铵甲基硫酸盐)、dotap·cl、dc-chol(3,β-n,(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇)、dospa(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-n,n-二甲基-铵三氟乙酸盐)、dc-6-14(o,o'-双十四碳酰基-n-(α三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物)、dcpe(二己酰磷脂酰乙醇胺)、dlrie(二月桂基氧基丙基-3-二甲基羟基乙基溴化铵)、dodap(1,2-二油酰基-3-二甲铵-丙烷)、乙基-pc、dospa(2,3-二油酰基氧基-n-[2-(精胺甲酰氨基乙基]-n,n-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐)、dogs(双十八烷基酰氨基甘氨酰羧基精胺)、dmrie(n-[1-(2,3-二肉豆蔻基氧基)丙基]-n,n-二甲基-n-(2-羟乙基)溴化铵)、doepc(二油酰基乙基-磷酸胆碱)、dohme(n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n-[1-(2-羟乙基)]-n,n-二甲基碘化铵)、gap-dlrie:dope(n-(3-氨基丙基)-n,n-二甲基-2,3-二(十二烷氧基)-1-丙铵溴化物/二油烯基磷脂酰乙醇胺)、dppc(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、dopg(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(3-赖氨酰基(1-甘油))·cl)、n-月桂酰基肌氨酸、(r)-(+)-柠檬烯、卵磷脂(和它们的衍生物)；磷脂酰乙醇胺(和它们的衍生物)；磷脂酰乙醇胺类、二油酰磷脂酰乙醇胺)、dphpe(二植烷酰磷脂酰乙醇胺)、dppe(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、o-chol(3β[1-鸟氨酰胺氨甲酰基]胆固醇)、pope(棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；磷脂酰胆碱；磷脂酰胆碱类、dppc(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、popc(棕榈酰油酰磷脂酰胆碱)和二硬脂酰磷脂酰胆碱；磷脂酰甘油；基于哌嗪的阳离子脂质、磷脂酰甘油类，诸如dopg(二油酰磷脂酰甘油)、dppg(二棕榈酰磷脂酰甘油)和二硬脂酰磷脂酰甘油；磷脂酰丝氨酸(和它们的衍生物)；磷脂酰丝氨酸类，诸如二油酰基-或二棕榈酰磷脂酰丝氨酸；二季铵盐类诸如n,n'-二油烯基-n,n,n',n'-四甲基-1,2-乙二胺(tmedece)、n,n'-二油烯基-n,n,n',n'-四甲基-1,3-丙二胺(propece)、n,n'-二油烯基-n,n,n',n'-四甲基-1,6-己二胺(hexece)和它们的对应的n,n'-二鲸蜡基饱和类似物(tmedace、propace和hexace)、二磷脂酰甘油类；脂肪酸酯类；单阳离子转染脂质诸如1-脱氧-1-[双十六烷基(甲基)铵基]-d-木糖醇；1-脱氧-1-[甲基(双十四烷基)铵基]-d阿拉伯糖醇；1-脱氧-1-[双十六烷基(甲基)铵基]-d-阿拉伯糖醇；1-脱氧-1-[甲基(双十八烷基)铵基]-d阿拉伯糖醇、甘油酯类；鞘脂类；强心脂类(cardolipin)；脑苷脂类；和神经酰胺类；以及它们的混合物。中性脂质也包括胆固醇和其它3βoh-甾醇类以及它们的衍生物，磷脂酰胆碱或商购可得的阳离子脂质混合物，例如，
本文使用的术语“聚乙二醇化脂质”通常表示，与一种或多种聚乙二醇部分共价地缀合的脂质。用于本文的脂复合物实施方案的聚乙二醇化脂质包括：基于磷脂酰乙醇胺(pe)的聚乙二醇化脂质，例如，1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-mw]，其中mw表示聚乙二醇部分的平均mw。这样的二肉豆蔻酰基-peg-pe脂质被统称为14:0peg(mw)pe。聚乙二醇部分的平均mw可以是例如25、350、550、750、1000、2000、3000、5000、6000、8000或12000。基于磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇化脂质的脂肪酸链可以包括，例如，1,2-二油酰基(诸如就18:1peg(mw)pe而言)、1,2-二棕榈酰基(诸如就16:0peg(mw)pe而言)或1,2-二硬脂酰基(诸如就18:0peg(mw)pe而言)。其它基于磷脂酰乙醇胺(pe)的聚乙二醇化脂质包括，例如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[mod(聚乙二醇)-mw]，其也被称作dspe-modpeg(mw)，其中mod表示官能部分，诸如胺、生物素、羧酸、叶酸酯、马来酰亚胺、pdp或羧基荧光素部分。mw可以为例如2000或5000。用于本文所述的实施方案的聚乙二醇化脂质也包括基于神经酰胺的聚乙二醇化脂质，例如，n-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)mw]}，其被称作为c8peg(mw)神经酰胺，其中mw是例如750、2000或5000。可替换地，所述脂肪酸部分可以具有n-棕榈酰(c16)基(诸如就c16peg(mw)神经酰胺而言)。
“脂质体组合物”通常是包括一种或多种脂质体的制剂。在某些情况下，术语“脂质体组合物”可以与术语“转染复合物”互换使用。这些制剂通常是胶体，但是也可以是干燥的制剂。脂质体是由自装配的两亲分子组成的囊泡胶体颗粒。本发明的脂质体组合物通常包括至少一种或多种阳离子脂质，所述阳离子脂质是单独的，或者任选地与使用标准方法加工的一种或多种辅助脂质(即，中性脂质、胆固醇或胆固醇衍生物、阳离子脂质)相组合，以形成含有脂质体的胶体混悬液。本发明的脂质体组合物是含有一种或多种含胺的转染脂质、一种或多种辅助脂质、一种或多种聚乙二醇化脂质的那些组合物，所述脂质任选地与一种或多种中性脂质和/或辅助脂质或靶向部分相组合，它们通过本领域已知的、但不限于形成脂质体的任意标准方法来处理。通过粒度测量，可以将脂质体组合物彼此区分开。不同的组合物将表现出粒度和粒度均匀度(例如，平均粒度和多分散性)的差异。不同的组合物将表现出呈脂质体形式的组合物的程度的差异。在某些非限制性的实施方案中，脂质体组合物将表现出在120nm至800nm范围内的粒度，且将表现出通常较低的多分散性。脂复合物粒度(含有sirna或其它负荷)可以在约40nm至135nm范围内。在某些实施方案中，脂复合物粒度是50nm至120nm、50nm至100nm、60nm至90nm、70nm至90nm、或约85nm。
术语“脂质聚集体”或“脂复合物”是一般术语，其包括所有类型(单层和多层)的脂质体以及囊泡、胶束和更无定形的聚集体。阳离子脂质聚集体是这样的脂质聚集体：其包含一种或多种阳离子化合物的组合，所述阳离子化合物任选地与非阳离子脂质(包括中性脂质)相组合，使得所述脂质聚集体具有净正电荷。本发明的含胺的转染化合物可以形成脂质聚集体，任选地与辅助脂质一起，并进一步任选地与一种或多种聚乙二醇化脂质和/或一种或多种靶向部分一起，然后然后可以在与合适的生物活性剂接触时形成脂质–生物活性剂复合物。术语“脂质聚集体”或“脂复合物”在本文中通常用于表示“裸”转染复合物，即，通常缺少要向细胞或向体外或体内组织递送的生物活性剂净荷的转染复合物。
术语“脂质-生物活性剂”通常表示，脂质或脂质聚集体和生物活性剂(诸如核酸、多肽等)之间的非共价结合。
本文使用的“核酸”和它的语法等效词包括所有范围的单链或双链核苷酸聚合物，且包括这样的核酸(包括dna、rna和dna-rna杂种分子)：其分离自天然来源；其用诸如pcr扩增或化学合成等技术在体外制备；其经由例如重组dna技术在体内制备；或其通过任何已知方法制备或得到。核酸通常表示由2个或更多个核苷酸(脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸)或其变体、衍生物和/或类似物的直链组成的多核苷酸分子。精确大小将取决于许多因素，所述因素又取决于最终的使用条件，正如本领域众所周知的。本发明的核酸包括但不限于引物、探针、寡核苷酸、载体、构建体、质粒、基因、转基因、基因组dna、cdna、rna、rnai、sirna、shrna、strna、pcr产物、限制片段、寡核苷酸等。
本文使用的术语“核苷酸”包括含有糖部分(戊糖)、磷酸酯和含氮杂环碱基的dna或rna的任何单体单元，且也可以包括这样的核苷酸的单-、二-和三-磷酸酯形式。所述碱基通常经由糖苷碳(在戊糖的1’碳处)与糖部分连接，并且碱基和糖的组合被称作“核苷”。碱基表征了含有dna的下述4种常规碱基的核苷酸：腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)。肌苷(i)是合成碱基的一个例子，其可以用于置换4种天然存在的碱基(a、c、g或t)中的任一种。4种rna碱基是a、g、c和尿嘧啶(u)。因此，核酸可以是这样的核苷酸序列：其包含通过邻接戊糖的3’和5’碳之间的磷酸二酯键连接的核苷酸的线性阵列。其它经修饰的核苷酸是已知的，且可以用于实践本发明。术语核苷酸包括核糖核苷三磷酸酯atp、utp、itp、ctg、gtp和脱氧核糖核苷三磷酸酯诸如datp、dctp、ditp、dutp、dgtp、dttp或它们的衍生物。这样的衍生物包括，例如，[αs]datp、7-脱氮-dgtp和7-脱氮-datp，以及给含有它们的核酸分子赋予核酸酶抗性的核苷酸衍生物。本文使用的术语核苷酸也表示二脱氧核糖核苷三磷酸酯(ddntp)和它们的衍生物。二脱氧核糖核苷三磷酸酯的示例性例子包括、但不限于：ddatp、ddctp、ddgtp、dditp和ddttp。根据本发明，“核苷酸”可以是未标记的，或通过众所周知的技术可检测地标记。可检测的标记包括，例如，放射性的同位素、荧光标记、化学发光的标记、生物发光的标记和酶标记。本领域中已知的各种标记方法可以用于实践本发明。
“rna”或“rna分子”表示具有任意大小且具有来自任意来源的任意序列的任意rna分子或其功能部分，包括来自病毒、原核生物和真核生物的rna。rna分子可以经过化学修饰，且呈任意形式，包括、但不限于，线性或环状，和单链或双链。rna分子的非限制性例子包括rrna、trna、mrna、mtrna、tmrna、rnai、sirna、shrna和strna。在某些实施方案中，可用于实践本发明的sirna分子包括，例如，在下述文献中描述的那些：公开为u.s.2004/0014956的美国专利申请号10/357,529，公开为u.s.2004/0054155的美国专利申请号10/357,826，公开为u.s.2006/0009409的美国专利申请号11/049,636，公开为u.s.2009/0023216的美国专利申请号11/776,313，和2008年4月3日提交的美国专利申请号12/062,380；公开为wo2003/064626的pct公开申请pct/us03/03223，和公开为wo03/064625的pct公开申请pct/us03/03208，所述u.s.和pct申请通过引用并入本文。可用于实践本发明的其它sirna分子包括，例如，在pct专利申请pct/us2008/076675(于2009年3月26日公开为wo2009/039173)中描述的那些，该申请通过引用并入本文。
本文使用的术语“肽”、“多肽”或“蛋白”表示，通过肽键连接到一起的至少3个氨基酸的串。术语“蛋白”和“肽”可以互换使用，尽管通常理解，“多肽”或“蛋白”大于肽。“肽”可以表示单个肽或肽的集合。
本文使用的术语“多核苷酸”或“寡核苷酸”表示核苷酸的聚合物。通常，多核苷酸包含至少3个核苷酸。所述聚合物可以包括天然的核苷(即，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、c5-丙炔基胞苷、c5-丙炔基尿苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、o(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)、化学修饰的碱基,生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)、插入的碱基、经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)或经修饰的磷酸基(例如，硫代磷酸酯和5'-n-氨基亚磷酸酯键)。
术语“脂质”表示疏水的或两亲的有机化合物，包括脂肪、油和三甘油酯。
ii.本发明的实施方案
含胺的转染化合物
本发明描述了可用作转染试剂的不同的含胺化合物及其合成方法。更具体地，根据本发明的一些实施方案，提供了具有一般结构i的化合物或其药学上可接受的盐：
其中x1和x2中的每一个是独立地选自下述的部分：o、s、n-a和c-a，其中a选自氢和c1-c20烃链；y和z中的每一个是独立地选自下述的部分：ch-oh、c＝o、c＝s、s＝o和so2；r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7中的每一个是独立地选自下述的部分：氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基，x是独立地具有1-10(包括端值)的值的整数，n是独立地具有1-3(包括端值)的值的整数，m是独立地具有0-20(包括端值)的值的整数，p是独立地具有0或1的值的整数，其中如果m＝p＝0，那么r2是氢，其它条件是，如果n或m中的至少一个具有2的值，那么r3和在结构i中的氮形成选自下述的部分：
其中g、e和f中的每一个是独立地具有1-6(包括端值)的值的整数，“hcc”代表烃链，且每个*表示在结构i中的氮原子。
在某些实施方案中，r3是多胺。在其它实施方案中，r3是缩酮。在某些实施方案中，在一般结构i中的r1和r2中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。
在某些实施方案中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，r3是下述部分中的任一个：
其中每个“hcc”代表烃链，且每个*显示r3与在结构i中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个h可以被替换以实现与在结构i中的氮原子的连接。
根据一些实施方案，一般结构i的化合物可以具有：r4、r5、r6和r7中的每一个是氢，y和z中的每个是c＝o，r1和r2中的每一个是相同的，且x1和x2中的每一个也是相同的。这样的化合物由一般结构ii(它是一般结构i的化合物的亚类)表示：
其中当n＝p＝0时，r2是h。
在一般结构ii的化合物中，至少一个x1是nh，或至少一个x1是o。此外，在某些实施方案中，在一般结构ii的化合物中，每个r1独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，例如8至约18个碳原子，和0至4个双键，例如0至2个双键。此外，在某些实施方案中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，r3是下述部分中的任一个：
其中每个“hcc”代表烃链，且每个*显示r3与在结构ii中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个h可以被替换以实现与在结构ii中的氮原子的连接。
在某些实施方案中，如果在一般结构ii中的n或m中的至少一个具有2的值，那么r3是下述部分中的任一个：
其中g、e和f中的每一个是独立地具有1-6(包括端值)的值的整数，每个“hcc”代表烃链，且每个*显示r3与在结构ii中的氮原子的连接点。
根据本发明的实施方案，提供了一些具体的化合物，它们是属于一般结构i或一般结构ii或二者的物质。这样的具体化合物的非限制性例子是：下述脂质1-87中的任一种，或化合物1-87中的每一种的任何异构体，或化合物1-87中的每一种的异构体的任何组合：
上面显示的化合物1-87中的一些被用于制备某些脂质组合物。这些组合物在下面的实施例9中予以详细描述，且显示在实施例9的表1中。在表1的第1列中的化合物的编号与上面显示的化合物的编号相对应。
根据本发明的其它实施方案，可以如下合成上述的本发明的化合物：使氨基组分与不饱和组分反应，例如，通过将氨基组分的伯氨基添加至不饱和组分的双键，其中所述双键与亲电子基团(例如，羰基)共轭。一般而言，所述合成方法包括：使1个当量的氨基组分与1个或多个当量的不饱和组分反应。所述氨基组分包含伯胺nh2-r3、二胺、多胺或它们的组合。所述不饱和组分包含：具有结构r1-x1-y-(cr4r5)n-br的至少一种第一中间体，和具有结构r2-x2-z-(cr6r7)m-br的第二中间体，其中在所述结构的(cr4r5)n和(cr6r7)m部分中，每个r4是相同的或不同的，每个r5是相同的或不同的，每个r6是相同的或不同的，且每个r7是相同的或不同的，其中所述第一中间体和所述第二中间体是相同的或不同的。在某些实施方案中，所述不饱和组分的第一和/或第二中间体可以是丙烯酸酯或丙烯酰胺。
在某些实施方案中，胺nh2-r3、二胺或多胺的所有氨基都与不饱和组分充分反应以形成叔胺。在其它实施方案中，并非所有的氨基都这样反应以形成叔胺，从而在脂质分子中产生伯胺或仲胺。
本发明的化合物的合成可以用或不用溶剂进行，且所述合成可以在室温至约100℃范围内的温度(例如，在约95℃)进行。可以任选地通过加入酸、碱或金属来催化反应。本领域普通技术人员可以选择用于进行合成的最佳条件，以选择适当的催化剂，如果必要的话，选择氨基组分和不饱和组分之间的摩尔比。例如，当氨基组分是伯胺nh2-r3时，不饱和组分和伯胺nh2-r3之间的摩尔比可以是在约1:1至约6:1之间。可以任选地纯化制备的脂质。使用烷基卤(例如，碘代甲烷)或其它烷化剂，也可以烷基化所述脂质。
在一个示例性的非限制性的实施方案中，下述反应路线图可以例证所述合成方法：
在上面提供的构成不饱和组分的第一和第二中间体的结构中，x1和x2中的每一个是独立地选自下述的部分：o、s、n-a和c-a，其中a选自氢和c1-c20烃链；y和z中的每一个是独立地选自下述的部分：ch-oh、c＝o、c＝s、s＝o和so2；r1、r2、r4、r5、r6和r7中的每一个是独立地选自下述的部分：氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基，且n和m中的每一个是独立地具有1-3(包括端值)的值的整数。
在某些实施方案中，如果在上面提供的不饱和组分的第一和第二中间体的结构中的n或m中的至少一个具有2的值，且将伯胺nh2-r3用作氨基组分，那么在上面提供的伯胺结构中的r3是下述部分中的任一种：
其中g、e和f中的每一个是独立地具有1-6(包括端值)的值的整数，每个“hcc”代表烃链，且每个*显示r3与伯胺nh2-r3中的氨基的连接点。
在某些实施方案中，在上面提供的不饱和组分的第一和第二中间体的结构中的r1和r2中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。
在某些实施方案中，如果在上面提供的不饱和组分的第一和第二中间体的结构中，n和m中的每一个独立地具有1或3的值，且将伯胺nh2-r3用作氨基组分，那么在上面提供的伯胺结构中的r3可以是下述部分中的任一种：
其中每个“hcc”代表烃链，且每个*显示r3与伯胺nh2-r3中的氨基的可能连接点，其中在任意*位置上的每个h可以被替换以实现与伯胺nh2-r3中的氮原子的连接。
上述的本发明的化合物可以用于将生物活性剂或治疗剂递送给受试者、递送给动物、或递送给体外或体内细胞或组织。在某些示例性的但非限制性的实施方案中，所述化合物特别适用于递送带负电荷的生物活性剂。例如，本发明的含胺的转染化合物可以用于将dna、rna、其它多核苷酸、其它阴离子或聚阴离子递送给受试者或细胞。
在某些实施方案中，本发明的脂质与试剂相组合以形成转染复合物，诸如微粒、脂质体或胶束。要通过这些递送媒介物递送的生物活性剂(例如，多核苷酸、蛋白、肽或小分子)可以呈固体或液体或溶解形式。本发明的脂质可以与其它脂质、聚合物、表面活性剂、胆固醇、碳水化合物、蛋白等相组合以形成颗粒。这些颗粒可以与药学赋形剂相组合以形成药物组合物。
通过任意已知的技术，诸如通过结晶、色谱法、沉淀(例如在乙醚、己烷或其它有机溶剂中重复沉淀)或蒸馏，可以进一步纯化如上所述合成的脂质。也可以将脂质分离为盐，所述盐可以在所述脂质与有机酸或无机酸反应时形成。在某些实施方案中，如果所述脂质包含叔胺部分，它可以用任意烷化剂(例如，烷基卤，诸如碘代甲烷)烷基化，以形成脂质的季铵盐。与季胺结合的阴离子可以是任何药学上可接受的有机或无机阴离子。
在某些实施方案中，所述合成方法会产生具有丙烯酸尾巴的异构体的混合物，所述丙烯酸酯尾巴的数目和位置可以变化。这样的混合物可以根据需要经过或不经过进一步纯化地使用。当胺未被彻底烷基化时，得到的产物可以进一步与其它亲电体(诸如丙烯酸酯或丙烯酰胺)进一步反应，任选地随后进一步纯化。
在某些实施方案中，可以平行地制备不同脂质的文库。为此目的，可以将不同的胺和/或不饱和组分加入一组瓶中的每个瓶内，或加入多孔板的每个孔中。在足以允许形成脂质的温度和时间长度，温育所述反应混合物阵列。然后可以使用已知的技术分离和纯化脂质，随后使用高通量技术筛选，以鉴别具有希望的特征(例如，可溶性、结合多核苷酸的能力、结合肝素的能力、结合小分子的能力、形成微粒的能力、增加转染效率的能力等)的脂质。
转染复合物
本文公开的实施方案的另一个目的是，提供新颖的转染复合物，其被配制用于将生物活性化合物递送至体外细胞或组织，或递送至动物体内的细胞或组织。在本文中预见到的生物活性剂向细胞或组织的递送，可以用于提供治疗病症的治疗模态，或者可以可替换地在进行科学研究过程中提供(例如，作为研究工具)。
在某些实施方案中，本文提供的转染复合物可以包括一种或多种含胺的转染剂，所述转染剂被配制为脂质聚集体，使得可以将生物活性剂递送至细胞或组织以实现希望的生物应答。在某些实施方案中，转染复合物可以任选地包括一种或多种辅助脂质。在一个实施方案中，转染复合物可以任选地包括一种或多种聚乙二醇化脂质。在一个实施方案中，转染复合物可以任选地包括一种或多种靶向部分或转染促进剂。
在一个实施方案中，转染复合物可以包括具有一般结构i的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐：
其中x1和x2中的每一个是独立地选自下述的部分：o、s、n-a和c-a，其中a选自氢和c1-c20烃链；y和z中的每一个是独立地选自下述的部分：ch-oh、c＝o、c＝s、s＝o和so2；r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7中的每一个是独立地选自下述的部分：氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基，x是独立地具有1-10(包括端值)的值的整数，n是独立地具有1-3(包括端值)的值的整数，m是独立地具有0-20(包括端值)的值的整数，p是独立地具有0或1的值的整数，其中如果m＝p＝0，那么r2是氢，其它条件是，如果n或m中的至少一个具有2的值，那么r3和在结构i中的氮形成选自下述的部分：
其中g、e和f中的每一个是独立地具有1-6(包括端值)的值的整数，“hcc”代表烃链，且每个*表示在结构i中的氮原子。
在某些实施方案中，r3是多胺。在其它实施方案中，r3是缩酮。在某些实施方案中，在一般结构i中的r1和r2中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。
在某些实施方案中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，r3是下述部分中的任一个：
其中每个“hcc”代表烃链，且每个*显示r3与在结构i中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个h可以被替换以实现与在结构i中的氮原子的连接。
根据一些实施方案，含有具有一般结构i的含胺转染化合物的转染复合物可以具有：r4、r5、r6和r7中的每一个是氢，y和z中的每个是c＝o，r1和r2中的每一个是相同的，且x1和x2中的每一个也是相同的。这样的化合物由一般结构ii(它是一般结构i的化合物的亚类)表示：
其中当n＝p＝0时，r2是h。
在一般结构ii的化合物中，至少一个x1是nh，或至少一个x1是o。此外，在某些实施方案中，在一般结构ii的化合物中，每个r1独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，其具有3至约20个碳原子，例如8至约18个碳原子，和0至4个双键，例如0至2个双键。此外，在某些实施方案中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，r3是下述部分中的任一个：
其中每个“hcc”代表烃链，且每个*显示r3与在结构ii中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个h可以被替换以实现与在结构ii中的氮原子的连接。
在某些实施方案中，如果在一般结构ii中的n或m中的至少一个具有2的值，那么r3是下述部分中的任一个：
其中g、e和f中的每一个是独立地具有1-6(包括端值)的值的整数，每个“hcc”代表烃链，且每个*显示r3与在结构ii中的氮原子的连接点。
根据本发明的实施方案，转染复合物可以包括一种或多种含胺的转染化合物，后者是属于一般结构i或一般结构ii或二者的物质。这样的具体化合物的非限制性例子是：上面指出的脂质1-87中的任一种，或化合物1-87中的每一种的任何异构体，或化合物1-87中的每一种的异构体的任何组合。
在某些实施方案中，所述含胺的转染化合物的摩尔百分比是所述脂质聚集体的约15％至约50％；在其它实施方案中，所述阳离子脂质的摩尔百分比是转染复合物的约20％至约40％；在某些实施方案中，所述含胺的转染化合物的摩尔百分比是所述脂质聚集体的约25％至约35％；或者，在某些实施方案中，所述含胺的转染化合物的摩尔百分比是所述脂质聚集体的约33％。在某些实施方案中，所述含胺的转染化合物的摩尔百分比是所述脂质聚集体的约15％至约35％；在其它实施方案中，所述含胺的转染化合物的摩尔百分比是所述脂质聚集体的约20％至约30％；或在某些实施方案中，所述含胺的转染化合物的摩尔百分比是所述脂质聚集体的大约25％。
在某些实施方案中，转染复合物可以任选地包括一种或多种辅助脂质。适用于配制本文所述的转染复合物的辅助脂质的示例性的、但非限制性的例子包括胆固醇、胆固醇衍生物、甾醇类(包括植物甾醇、动物甾醇和藿烷类)、或者已知会实现或促进外源性生物活性分子向细胞或组织内部的引入的中性或阳离子脂质中的任一种。在某些实施方案中，可以在本文所述的转染复合物的配制中使用超过一种辅助脂质。预见到用于制备本文公开的转染复合物的示例性的、但非限制性的中性或阳离子脂质可以包括选自下述的一种或多种脂质：bmop(n-(2-溴乙基)-n,n-二甲基-2,3-二(9-十八烯基氧基)-丙铵溴化物)、ddpes(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺)、dspc、ctab:dope(鲸蜡基三甲基溴化铵(catb)和dope的制剂)、popc(1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、dope(二油酰磷脂酰乙醇胺)、dmg、dmap(4-二甲基氨基吡啶)、dmpe(二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺)、domg、dma、dopc(二油酰磷脂酰胆碱)、dmpc(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)、dpepc(二棕榈酰乙基磷脂酰胆碱)、dodac(二油酰基二甲基氯化铵)、dosper(1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基精胺基)-丙基酰胺)、dotma(n-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵)、ddab(双十二烷基甲基溴化铵)、dotap(n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基-铵甲基硫酸盐)、dotap·cl、dc-chol(3,β-n,(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇)、dospa(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-n,n-二甲基-铵三氟乙酸盐)、dc-6-14(o,o'-双十四碳酰基-n-(α三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物)、dcpe(二己酰磷脂酰乙醇胺)、dlrie(二月桂基氧基丙基-3-二甲基羟基乙基溴化铵)、dodap(1,2-二油酰基-3-二甲铵-丙烷)、乙基-pc、dospa(2,3-二油酰基氧基-n-[2-(精胺甲酰氨基乙基]-n,n-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐)、dogs(双十八烷基酰氨基甘氨酰羧基精胺)、dmrie(n-[1-(2,3-二肉豆蔻基氧基)丙基]-n,n-二甲基-n-(2-羟乙基)溴化铵)、doepc(二油酰基乙基-磷酸胆碱)、dohme(n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n-[1-(2-羟乙基)]-n,n-二甲基碘化铵)、gap-dlrie:dope(n-(3-氨基丙基)-n,n-二甲基-2,3-二(十二烷氧基)-1-丙铵溴化物/二油烯基磷脂酰乙醇胺)、dppc(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、dopg(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(3-赖氨酰基(1-甘油))·cl)、n-月桂酰基肌氨酸、(r)-(+)-柠檬烯、卵磷脂(和它们的衍生物)；磷脂酰乙醇胺(和它们的衍生物)；磷脂酰乙醇胺类、二油酰磷脂酰乙醇胺)、dphpe(二植烷酰磷脂酰乙醇胺)、dppe(二棕榈酰磷脂酰乙醇胺)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、o-chol(3β[1-鸟氨酰胺氨甲酰基]胆固醇)、pope(棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；磷脂酰胆碱；磷脂酰胆碱类、dppc(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、popc(棕榈酰油酰磷脂酰胆碱)和二硬脂酰磷脂酰胆碱；磷脂酰甘油；基于哌嗪的阳离子脂质、磷脂酰甘油类，诸如dopg(二油酰磷脂酰甘油)、dppg(二棕榈酰磷脂酰甘油)和二硬脂酰磷脂酰甘油；磷脂酰丝氨酸(和它们的衍生物)；磷脂酰丝氨酸类，诸如二油酰基-或二棕榈酰磷脂酰丝氨酸；二季铵盐类诸如n,n'-二油烯基-n,n,n',n'-四甲基-1,2-乙二胺(tmedece)、n,n'-二油烯基-n,n,n',n'-四甲基-1,3-丙二胺(propece)、n,n'-二油烯基-n,n,n',n'-四甲基-1,6-己二胺(hexece)和它们的对应的n,n'-二鲸蜡基饱和类似物(tmedace、propace和hexace)、二磷脂酰甘油类；脂肪酸酯类；单阳离子转染脂质诸如1-脱氧-1-[双十六烷基(甲基)铵基]-d-木糖醇；1-脱氧-1-[甲基(双十四烷基)铵基]-d阿拉伯糖醇；1-脱氧-1-[双十六烷基(甲基)铵基]-d-阿拉伯糖醇；1-脱氧-1-[甲基(双十八烷基)铵基]-d阿拉伯糖醇、甘油酯类；鞘脂类；强心脂类(cardolipin)；脑苷脂类；和神经酰胺类；以及它们的混合物。中性脂质也包括胆固醇和其它3βoh-甾醇类以及它们的衍生物，磷脂酰胆碱或商购可得的阳离子脂质混合物，例如，
所述辅助或中性脂质的摩尔百分比是在所述脂质聚集体的约60％至约85％之间；在某些实施方案中，所述辅助或中性脂质的摩尔百分比是在所述脂质聚集体的约70％至约80％之间；或者，在某些实施方案中，所述辅助或中性脂质的摩尔百分比是在所述脂质聚集体的约70％至约75％之间。
在某些实施方案中，转染复合物可以包括一种或多种聚乙二醇化脂质。适用于制备和形成本文公开的转染复合物的聚乙二醇化脂质可以是这样的任意脂质或脂质混合物：其与本文所述的转染复合物的形成相容，且与所述转染复合物向动物、或向人体内、或向体外组织或细胞的施用相容。在本发明中使用的聚乙二醇化脂质包括具有下述分子量的peg聚合物：约250道尔顿至约12,000，或者，在某些实施方案中，约350道尔顿至约6,000道尔顿，或者，在某些实施方案中，约500道尔顿至约1,000道尔顿，或者，在某些实施方案中，约1,000道尔顿至约2,000道尔顿，或者，在某些实施方案中，约2,000道尔顿至5,000道尔顿。更具体地，合适的聚乙二醇化脂质包括基于磷脂酰乙醇胺(pe)的聚乙二醇化脂质，例如，1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-mw]，其中mw表示聚乙二醇部分的平均mw。这样的二肉豆蔻酰基-peg-pe脂质被统称为14:0peg(mw)pe。聚乙二醇部分的平均mw可以是例如25、350、550、750、1000、2000、3000、5000、6000、8000或12000。基于磷脂酰乙醇胺的聚乙二醇化脂质的脂肪酸链可以包括，例如，1,2-二油酰基(诸如就18:1peg(mw)pe而言)、1,2-二棕榈酰基(诸如就16:0peg(mw)pe而言)或1,2-二硬脂酰基(诸如就18:0peg(mw)pe而言)。其它基于磷脂酰乙醇胺(pe)的聚乙二醇化脂质包括，例如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[mod(聚乙二醇)-mw]，其也被称作dspe-modpeg(mw)，其中mod表示官能部分，诸如胺、生物素、羧酸、叶酸酯、马来酰亚胺、pdp或羧基荧光素部分。mw可以为例如2000或5000。用于本文所述的实施方案的聚乙二醇化脂质也包括基于神经酰胺的聚乙二醇化脂质，例如，n-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)mw]}，其被称作为c8peg(mw)神经酰胺，其中mw是例如750、2000或5000。可替换地，所述脂肪酸部分可以具有n-棕榈酰(c16)基(诸如就c16peg(mw)神经酰胺而言)。
在某些实施方案中，所述聚乙二醇化脂质的摩尔百分比是在所述转染复合物的约0.5％至15％之间；在某些实施方案中，所述聚乙二醇化脂质的摩尔百分比是在所述转染复合物的约1％至约10％之间；或在某些实施方案中，所述聚乙二醇化脂质的摩尔百分比是所述转染复合物的大约1％或5％。
在某些实施方案中，所述转染复合物的含胺的转染化合物:辅助脂质:聚乙二醇化脂质的摩尔百分比是在下述范围内：15:84:1至15:75:10、20:79:1至20:70:10、25:74:1至25:65:10、30:69:1至30:60:10、40:59:1至40:50:10、或50:49:1至50:40:10。在某些实施方案中，所述转染复合物的含胺的转染化合物:辅助脂质:聚乙二醇化脂质的摩尔百分比是在下述范围内：10-90:7-35:5-70、15-85:5-35:8-50、30-85:5-35:8-50、35-70；10-30:15-45、40-65:15-25:20-40、50-60:18-22:25-35、50-55:19-21:27-30、或51-53:20-20.5:28-29。当然，熟练的从业人员容易明白，可以采用替代性的比例，并且优化这样的制剂的比例属于这样的人员的技能水平，无需过度实验。
本发明的其它非限制性实施方案提供了将生物活性剂(例如，聚阴离子、多核苷酸或多肽)递送进一个或多个细胞中或递送进组织中的方法，其中所述方法包括：形成脂质聚集体，诸如脂质体，其包含一种或多种上述的含胺的转染化合物，所述转染化合物任选地与一种或多种辅助脂质和/或一种或多种聚乙二醇化脂质组合，并使所述脂质聚集体与生物活性剂接触，以形成中性的或带正电荷的生物活性剂-脂质聚集体复合物，并将所述复合物与体外细胞或组织一起温育，或者将得到的转染复合物施用给动物或人，任选地作为治疗组合物。预见到用于这样的施用的有用的生物活性剂包括蛋白、肽和核酸，诸如dna或rna。
在某些实施方案中，所述转染复合物可以包括一种或多种要递送至细胞或递送至体外或体内靶组织的生物活性剂。合适的生物活性剂可以包括这样的任意分子：所述分子能够与本文所述的含胺的转染试剂形成转染复合物，且当被递送至一个或多个细胞内部或被递送至体内或体外组织时会引起生物应答。预见到用于本文所述的实施方案中的生物活性剂可以是阳离子的、中性的或阴离子的试剂。通过非限制性例子，适用于配制转染复合物的示例性生物活性剂可以包括、但不限于：核酸(包括、但不限于单链或双链直链或环状dna分子(包括cdna分子)、单链或双链rna分子、小干扰rna(sirna)分子、小发夹rna(shrna)分子、微rna(mirna)分子、寡核苷酸、反义寡核苷酸、有义寡核苷酸)、多肽、抗体、寡肽、治疗性的肽或蛋白分子、肽核酸(pna)、阳离子的、阴离子的或中性的有机分子或药物，以及它们的药学上可接受的盐。
在本发明的某些非限制性的示例性实施方案中，提供了转染复合物和方法，其使用本发明的化合物将核酸分子递送进体外或体内细胞或组织中，包括将rna干扰分子(rnai)或小干扰rna分子(sirna、shrna或mirna)递送进细胞中用于抑制基因表达。
在某些非限制性的示例性实施方案中，还提供了转染复合物和方法，其使用本发明的化合物将mrna分子递送进体内或体外细胞或组织中，以促进特定蛋白或多种蛋白的表达。
在本发明的其它非限制性的示例性实施方案中，还提供了转染复合物和方法，其使用本发明的化合物将dna分子(包括cdna分子)递送进体内或体外细胞或组织中，以促进特定蛋白或多种蛋白的表达，或者以合成特定的rna分子，包括、但不限于mrna分子或rnai或mirna或shrna分子。
在某些实施方案中，本文所述的转染复合物可以任选地包括一种或多种融合肽或细胞穿透肽。融合肽或细胞穿透肽是能够促进含脂质复合物与细胞膜(质膜或胞内体膜)的融合的任何肽分子。多种融合肽或细胞穿透肽是本领域已知的，并且在从业人员的技能水平内，无需过多实验即可鉴别出合适的融合肽或细胞穿透肽及其在本发明中的使用条件。
在某些实施方案中，本文所述的转染复合物可以任选地包括一种或多种转染辅助剂或靶向部分。靶向部分可以是肽、经修饰的肽、抗体、经修饰的抗体、受体分子、经修饰的受体分子、单链或双链核酸分子、经修饰的单链或双链核酸分子、肽或核酸适体、经修饰的肽或核酸适体、有机分子、多糖、或这样的任意其它分子：所述分子能够将转染复合物靶向特定组织或细胞类型以给其靶向递送生物活性剂，正如本领域普通技术人员会容易地明白的。在某些实施方案中，肽、抗体、核酸、适体等的修饰可以包括，将所述肽、抗体、核酸、适体等与peg部分缀合。可替换地，肽、抗体、核酸、适体等的修饰可以包括，将所述肽、抗体、核酸、适体等与peg-脂质部分缀合。多种靶向部分是本领域技术人员广泛已知的，且都被预见到与本文所述的实施方案一起使用，但不限于此。
在某些实施方案中，本文提供的转染复合物可以稳定最多1年，且可以要么与要转染的细胞或组织接触，要么在形成后立即或不久施用给动物或人，或者可以任选地在与细胞或组织接触或施用给动物或人之前保存一段时间。所述转染复合物是稳定的，且可以在室温或在大于冰点直到约室温的温度保存下述时间段：至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少10小时、至少15小时、至少20小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少5天、至少7天、至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年。应当理解，本文所述的制剂可以包括一种或多种稳定剂、防腐剂、缓冲剂等，其辅助生物活性制剂的长期稳定和贮存，正如生物学和药学领域的熟练的从业人员会容易地理解的，且无需过度实验即可实现。还应当理解，贮存期可以是这些时间段中的任一种，例如31分钟至1小时，或1小时至24小时。
任选地，在与一个或多个细胞接触之前，将生物活性剂-脂质聚集体复合物保存一段时间。所述聚阴离子-脂质聚集体复合物是稳定的，且可以保存至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少10小时、至少15小时、至少20小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少5天、至少7天、至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年的时间段，或保存在这些时间段中的任一种之间的时间段。
本发明特别适用于向细胞或向体外或体内组织递送rnai组分，包括sirna、短发夹rna(shrna)、微rna(mirna)和小型暂时调节的rna(strna)，其任选地经过化学修饰。
采用本发明的转染复合物或其混合物的递送方法可以应用于体外、离体和体内的细胞，特别是用于转染真核细胞或组织，包括动物细胞、人细胞、非人动物细胞、昆虫细胞、植物细胞(包括藻类)、禽细胞、鱼细胞、哺乳动物细胞等。
在某些实施方案中，使要递送进细胞中的生物活性剂与本发明的脂质聚集体接触，以形成包含生物活性剂-脂质聚集体复合物的转染复合物。然后将一个或多个靶细胞或靶组织与所述复合物一起温育，或者，就体内应用而言，通过适当的途径(例如，静脉内的、肌肉内的、皮下的、透皮的、透粘膜的途径等)，将所述复合物施用给生物体，使得所述复合物与靶细胞或组织接触。将转染复合物在体外施用给细胞或组织、或在体内施用给组织或动物的方法是本领域众所周知的，并且在本文中预见到这样的方法的应用，但不限于将本文所述的脂质转染复合物施用给细胞、组织或动物。改进用于与本文所述的组合物一起使用的这些方法，是在具有本领域普通技能水平的从业人员的能力范围内，而不会脱离本文所述的本发明的精神和范围。所述化合物也可以与多种有用的分子和物质(也被称作转染辅助剂或靶向部分，诸如蛋白、肽、生长因子、抗体、核酸、适体或它们的修饰形式)缀合、或者与其混合、或者与其结合使用(例如，将所述转染辅助剂或靶向部分与peg或peg-脂质缀合)等，以增强细胞靶向、摄入、内化、核靶向和表达，它们都同样在熟练的从业人员的技能水平内。
另一个实施方案提供了一种在体内用核酸转染细胞或组织的方法，其中所述方法包括：形成脂质聚集体，诸如脂质体，其包含一种或多种含胺的转染化合物、一种或多种聚乙二醇化脂质和任选的一种或多种辅助脂质，使所述脂质聚集体与核酸接触以形成中性的或带正电荷的脂质聚集体-核酸复合物，和将所述脂质聚集体-核酸复合物施用给体外细胞或组织或施用给生物体，使得所述复合物接触所述靶细胞或组织。如下面进一步所述的，脂质聚集体-核酸复合物的施用可以如下实现：口服地、静脉内地、或通过皮下或肌肉内注射、或局部施用于组织。
任选地，在与一个或多个细胞接触进行转染之前，将生物活性剂-脂质聚集体复合物保存一段时间。所述聚阴离子-脂质聚集体复合物是稳定的，且可以保存至少30分钟、至少45分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少10小时、至少15小时、至少20小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少5天、至少7天、至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年的时间段，或保存在这些时间段中的任一种之间的时间段。
在另一个实施方案中，在多孔板的孔中提供本发明的转染复合物(大约5μl至2000μl)。选择要递送进靶细胞中的生物活性分子，并加入孔中以形成聚阴离子-脂质聚集体复合物，随后使所述复合物与体外或体内靶细胞接触。所述脂质聚集体可以在每个孔中具有相同的组成和浓度，或者所述脂质聚集体的组成和/或浓度可以随孔不同而变化(例如，脂质聚集体中的聚乙二醇化的量可以在孔之间变化，以确定用于递送和转染的范围)。在生物活性剂是核酸诸如rnai的情况下，可以将所述核酸加入孔中，并任选地在与靶细胞接触之前进行保存。
本发明的方法任选地包括下述步骤：使一种或多种含胺的转染化合物与一种或多种辅助脂质和一种或多种聚乙二醇化脂质接触，然后或者同时使生物活性剂与所述一种或多种含胺的转染化合物接触，以形成包囊所述生物活性剂的脂质聚集体。所述方法也任选地包括：在与生物活性剂接触之前，使所述脂质聚集体形成脂质体。在其它实施方案中，通过微流体化、挤出或本领域已知的其它方式，形成所述脂质体。在某些实施方案中，所述生物活性剂可以包括抑制或促进靶基因的表达的核酸分子，诸如dna或rna。在某些实施方案中，所述生物活性剂与要实现其抑制的基因的转录物结合。在某些实施方案中，所述生物活性剂是核酸，诸如dna、mrna、rnai、sirna、shrna、mirna或strna，且任选地经过化学修饰。
在另一个实施方案中，本发明也提供了药物，所述药物通过将包含一种或多种含胺的转染化合物的脂质体与下述物质相组合来制备：任选的一种或多种辅助脂质、任选的一种或多种聚乙二醇化脂质、和任选的一种或多种靶向部分或转染辅助剂(如上所述)或其盐、生物活性剂例如核酸，其中所述生物活性剂向细胞或组织中的引入会调节其中的一个或多个靶基因的表达，由此实现至少一种生物应答和/或至少一种治疗益处。任选地，所述药物另外包含额外的赋形剂或药用载体，正如具有药学和/或医学领域的普通技能水平的从业人员会容易地明白的。在某些实施方案中，所述生物活性剂可以是核酸，例如，dna或rna。在某些实施方案中，所述核酸是mrna、rnai、sirna、shrna、mirna或strna，且任选地经过化学修饰。在某些实施方案中，提供了用于治疗疾病、病症或障碍的药物或药物制剂，所述疾病、病症或障碍与细胞或组织中的一个或多个基因的表达有关。药理学上可接受的药物的制剂是本领域已知的。所述药物的施用会将有效量的聚阴离子(例如rna或dna)递送给与疾病、病症或障碍有关的细胞或组织，以提供疾病、病症或障碍的改善。通过非限制性例子，这样的药物可以如下施用：口服地、静脉内地、或通过皮下或肌肉内注射、或局部施用于组织，如下面进一步描述的。
本发明也提供了试剂盒，其用于制备本文所述发明的一种或多种转染复合物。这样的试剂盒可以包括，例如，本发明的一种或多种脂质体组合物。这样的试剂盒通常包括载体，诸如盒子、纸板箱、试管等，在其中的封闭空间中具有一个或多个容器，诸如瓶、试管、安瓿、瓶子等，其中容器含有：一种或多种含胺的转染化合物、任选的一种或多种辅助脂质、任选的一种或多种根据上述实施方案的聚乙二醇化的或阳离子的脂质(或其可接受的盐)、或本发明的脂质体组合物。被本发明的该方面包括的试剂盒可以另外包含一种或多种额外的组分(例如，试剂和化合物)，所述组分是实现本发明的组合物的一种或多种特定应用所必需的或有益的。在某些实施方案中，所述试剂盒可以任选地含有一个或多个多孔板，所述多孔板适合用于容纳本发明的脂质聚集体或转染复合物。在其它实施例中，所述试剂盒也可以含有一种或多种可用于实现所希望的细胞转染的组分。在其它实施例中，所述也可以含有一种或多种可用于实现特定疾病或身体障碍的诊断、治疗或预防的组分(例如，一种或多种额外的治疗化合物或组合物、一种或多种诊断试剂)。一般而言，试剂盒也可以含有一种或多种缓冲剂、阳性或阴性对照样品、载体或赋形剂等、一种或多种本发明的其它组合物、一个或多个指令组等。
提供了在转染复合物(即，脂质聚集体-生物活性剂复合物)中包囊生物活性剂(诸如核酸、dna和rna等)的方法，作为一些实施方案。这样的方法可以包括，在一种或多种下述条件下，形成脂质聚集体，其包含一种或多种含胺的转染化合物(诸如在结构i和ii中和在式1-87中表示的那些)、一种或多种辅助脂质、一种或多种聚乙二醇化脂质、和任选的一种或多种转染辅助剂或靶向部分：
a1)在醇/水溶液中混合一种或多种含胺的转染化合物、至少一种辅助脂质(任选地超过一种辅助脂质)和一种或多种聚乙二醇化脂质或其盐，其中醇浓度<50％；
a2)在使得一种或多种含胺的转染化合物以15％-50％存在的摩尔百分比，混合一种或多种含胺的转染化合物、至少一种辅助脂质(任选地超过一种辅助脂质)和一种或多种聚乙二醇化脂质或其盐；
a3)在使得聚乙二醇化脂质以<50％存在的摩尔百分比，混合一种或多种含胺的转染化合物、至少一种辅助脂质(任选地超过一种辅助脂质)和一种或多种聚乙二醇化脂质或其盐；和
a4)混合一种或多种含胺的转染化合物、至少一种辅助脂质(任选地超过一种辅助脂质)和一种或多种聚乙二醇化脂质或其盐，其中所述聚乙二醇化脂质具有约2000-12000的聚乙二醇分子量以及c6-c20烷基或c10-c20烯基的脂肪酸链长度；和在醇/水溶液中使所述脂质聚集体与生物活性剂复合以形成转染复合物，其中醇浓度<50％，优选地小于40％。在某些实施方案中，所述方法包括例如：a1)和a2)、a2)和a3)、a1)和a3)、a2)和a4)、a3)和a4)、a1)和a4)、或a1)-a)4。在某些实施方案中，所述醇是c1-c4醇。在某些实施方案中，所述醇是乙醇。在某些实施方案中，所述醇是药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇(二乙二醇单乙基醚tm)、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400或它们的混合物。在某些实施方案中，用于混合的醇不同于用于复合的醇。
本文所述的实施方案的转染复合物可以经由下述体内施用途径来施用：例如，静脉内、真皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、心室内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、子宫内、直肠内、局部、瘤内、鞘内、肌肉内、皮下、结膜下、囊泡内、粘膜、心包内、脐带内、眼内、口服、局部、局部、经由吸入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接局部灌注浸泡靶细胞、经由导管、经由灌洗、以乳剂的方式或通过其它方法或本领域普通技术人员已知的前述途径的任意组合(remington’spharmaceuticalsciences,第18版,mackpublishingco.1990)。
用于离体或体内应用的剂量是0.01μg至1g/kg体重、0.1μg至0.1g/kg体重、1μg至0.01g/kg体重、10μg至0.01g/kg体重、0.1mg至10mg/kg体重，或在0.1mg/kg体重、0.25mg/kg体重、0.5mg/kg体重、1.0mg/kg体重、1.5mg/kg体重、2mg/kg体重和10mg/kg体重之间的范围内，且包括上述的任意值。施用可以是每天、每周、每个月或每年1次或多次。施用可以是推注形式。通常，本文所述实施方案的脂复合物的有效量是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致在靶细胞表面处100pm至1μm、或1nm至100nm、或2nm至约25nm或至约10nm的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随许多因而而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送是局部的还是全身的等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
在用于体内施用的某些实施方案中，以0.5–1mg/ml的终浓度制备转染复合物。脂质聚集体与核酸之比是在约0.7:1至1.3:1(v:w)之间，取决于靶向的器官。本领域普通技术人员在考虑本文的教导以后，能够试验脂质聚集体与核酸的不同比例用于体内施用。例如，就在5％葡萄糖中的1mg/ml脂复合物而言，施用可以是：例如，静脉内的，由此靶向肺、肾、肝、肿瘤、或脾(使用50–200μl)，腹膜内的，由此靶向肿瘤或炎症(使用100μl)，鼻内的，由此靶向肺(使用50μl)，瘤内的或眶后的(局部的)，由此靶向眼、肿瘤、膝关节或耳(使用10–100μl)，大脑内的(局部的)，由此靶向脑(使用0.5–5μl)，鞘内的，由此靶向脊髓(使用10μl)，或流体动力学的，由此靶向肝、肾或病毒(使用0.8–2.5ml)。
用于筛选组织特异性的递送的方法
本文描述的其它实施方案提供了为体内组织靶向(tissue-biased)递送筛选大量转染化合物的方法。这样的方法可以包括：制备多种含有化合物的转染复合物，所述化合物可容易地促进与试验转染化合物相组合的标志物的检测，将所述多种转染复合物中的每一种递送给试验动物，和检测所述标志物。
在某些实施方案中，用于筛选转染复合物的组织靶向(tissue-biased)递送的方法可以包括：制备多种转染复合物，每种转染复合物具有与至少一种促进向组织的递送的检测的核酸相组合的至少一种试验转染化合物。所述核酸可以是rna分子或dna分子，其编码可被直接检测的蛋白(例如，绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白、萤光素酶等)，或者编码这样的蛋白：所述蛋白影响可以直接检测的蛋白的表达。
在一个实施方案中，用于筛选转染复合物的组织靶向(tissue-biased)递送的方法可以包括：制备多种独特的转染复合物，每种转染复合物具有与编码绿色荧光蛋白的mrna或cdna相组合的至少一种试验转染化合物。每种独特的转染复合物可以静脉内地、皮下地递送给试验动物(诸如小鼠)或递送给其组织。在预定量的时间以后，可以从小鼠收获组织，并通过肉眼检查、组织学检查或通过分子检测(pcr、蛋白质印迹法等)，可以检测不同组织中的gfp的表达，以确定含有特定转染化合物的转染复合物递送至哪个或那些组织。
在一个实施方案中，用于筛选转染复合物的组织靶向(tissue-biased)递送的方法可以包括：制备多种独特的转染复合物，每种转染复合物具有与编码萤光素酶的mrna或cdna相组合的至少一种试验转染化合物。每种独特的转染复合物可以静脉内地、皮下地递送给试验动物(诸如小鼠)或递送给其组织。在预定量的时间以后，可以从小鼠收获组织，并通过肉眼检查、组织学检查或通过分子检测(pcr、蛋白质印迹法等)，可以检测不同组织中的萤光素酶的表达，或者使用
在一个实施方案中，用于筛选转染复合物的组织靶向(tissue-biased)递送的方法可以包括：制备多种独特的转染复合物，每种转染复合物具有与编码特定转录因子的mrna或cdna相组合的至少一种试验转染化合物。每种独特的转染复合物可以静脉内地、皮下地递送给转基因动物或递送给其组织，所述转基因动物表达在特定转录因子控制下的报道基因(例如，萤光素酶)。在预定量的时间以后，可以从转基因动物收获组织，并通过肉眼检查、组织学检查或通过分子检测(pcr、蛋白质印迹法等)，可以检测不同组织中的报道基因的表达。如果报道基因是萤光素酶，使用
在一个非限制性实施方案中，用于筛选转染复合物的组织靶向(tissue-biased)递送的方法可以包括：制备多种独特的转染复合物，每种独特的转染复合物含有与编码cre重组酶的mrna或dna分子相组合的至少一种独特的试验转染化合物。所述多种独特的转染复合物也可以任选地包括如上所述的且掺入其中的一种或多种转染促进剂、一种或多种辅助脂质、一种或多种聚乙二醇化脂质或一种或多种靶向部分。每种独特的转染复合物可以静脉内地(例如通过尾静脉注射)、皮下地或经由组织内注射递送给转基因小鼠，所述转基因小鼠在有cre重组酶存在下表达报道基因。在一个示例性的实施方案中，将每种独特的转染复合物递送给携带loxp-stop-loxp-萤光素酶基因的转基因小鼠，例如，129s6(b6)-gt(rosa)26转基因小鼠品系中的任一种，其中将荧火虫萤光素酶基因插入gt(rosa)26sor基因座中。在该转基因系中，萤光素酶基因被位于萤光素酶转基因和它的启动子之间的loxp-侧接的stop序列阻断。在有cre重组酶存在下(即，在向其递送含有cre-mrna或dna的转染复合物的组织中)，stop序列被切离，并表达萤光素酶。
为了确定cre萤光素酶在哪个组织中表达(和从而确定每种独特的试验转染化合物优先递送至哪个组织)，根据技术人员已知的广泛使用的评估基因表达的技术(诸如pcr、rna印迹法、蛋白质印迹法等，或直接测量萤光素酶活性)中的任一种，可以完成萤光素酶转基因的表达。在某些优选的实施方案中，例如使用
iii.实施例
通过考虑下述实施例，将进一步澄清本发明，所述实施例意图纯粹是本发明的示例，无意以任何方式限制本发明的范围。
实施例1.2-溴-n-十二烷基乙酰胺的合成
根据下述一般反应路线图，合成标题中间体：
在带有压力平衡加料漏斗的圆底烧瓶中，向200ml二氯甲烷中加入1.5g(7.431mmol,1.05当量)溴乙酰溴，并在氮下搅拌所述混合物。使用冰浴，将所述烧瓶冷却至约0℃。将1.31g(7.077mmol)十二烷基胺和0.716g(983μl,7.077mmol)三乙胺溶解在100ml二氯甲烷中。将该溶液转移至加料漏斗，并历时大约1小时缓慢地加入溴乙酰溴溶液。将所述反应混合物在约0℃搅拌另外约1小时，通过使冰融化，缓慢地温热至室温。
将得到的反应混合物转移至分液漏斗，并用100ml饱和的碳酸氢钠溶液萃取。用50ml二氯甲烷洗涤水层，并用100ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤合并的有机层。最后，用100ml二氯甲烷洗涤水层。合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤以除去硫酸钠，并通过旋转蒸发器浓缩混合物，得到约2.022g(93.3％收率)纯产物。计算的分子量：305.14，观察的分子量：306.25。
实施例2.十四烷基-2-溴乙酸酯的合成
根据下述一般反应路线图，合成标题中间体：
将3g(1.3ml,14.862mmol,1.05当量)溴乙酰溴溶解在50ml二氯甲烷中。使用冰浴，将烧瓶冷却至约0℃。将3.03g(14.154mmol)十四醇溶解在50ml二氯甲烷中，并经由移液器缓慢地加入上述的混合物中，随后加入约5滴浓硫酸，并在约0℃搅拌约30分钟，然后在室温搅拌过夜。
加入约150ml饱和的碳酸氢钠溶液，并快速地搅拌约30分钟。然后将所述混合物转移至分液漏斗，并收集有机层。用约100ml二氯甲烷洗涤水层。合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，得到4.095g(89.7％收率)产物。
没有观察到质量峰。为了确认结构，如下建立试验反应：将4.6mg(0.043mmol)苄胺、17mg(23μl,0.130mmol,3当量)n,n-二异丙基乙胺和22mg(0.065mmol,1.5当量)十四烷基-2-溴乙酸酯溶解在1mldmf中，并在约160℃/200w的微波中放置10分钟。通过lcms分析得到的反应混合物。计算的分子量：361.56，观察的分子量：362.42。
实施例3.十五烷基-4-溴丁酸酯的合成
根据下述一般反应路线图，合成标题中间体：
将4-溴丁基氯(1当量)溶解在二氯甲烷(50ml)中，并使用冰浴将反应烧瓶冷却至约0℃。向上述混合物中，使用压力平衡加料漏斗历时约30min缓慢地加入1-十五醇(1当量)在二氯甲烷(50ml)中的溶液。向得到的上述混合物中，加入催化量(5滴)的浓硫酸。将所述反应混合物在约0℃搅拌约30分钟，然后在室温搅拌4小时。将所述反应混合物转移至分液漏斗，并用饱和的碳酸氢钠(x3)、水(x2)、盐水(x1)洗涤有机层。将有机层经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，得到期望的产物：作为无色油的十五烷基-4-溴丁酸酯(88％收率)。
没有观察到质量峰。通过试验反应确认预期的产物的结构：将苄胺(1当量)、n-甲基吗啉(1当量)、十五烷基-4-溴丁酸酯(0.9当量)加入含有dmf(1ml)的干燥的厚壁派热克斯耐热玻璃管(pyrextube)中。将所述反应混合物暴露于微波辐照(200w)，在约170℃保持约10min。辐照后，通过所述仪器中的内置系统，使所述反应混合物冷却，直到温度已经降至低于约30℃。通过lcms分析得到的反应混合物。计算的分子量：403.64，观察的分子量：404.50。
实施例4.2-[3-甲基氨基丙基-(2-氧代-2-十四基-乙基)氨基]乙酸十四烷基酯的合成
根据下述一般反应路线图合成标题化合物：
将20mg(0.227mmol)n-甲基丙-1,3-二胺、160mg(0.477mmol,2.1当量)如上面实施例2所述合成的十四烷基-2-溴乙酸酯和176mg(237μl,1.361mmol,6当量)n,n-二异丙基乙胺溶解在1ml二甲基甲酰胺中，并加热至约60℃过夜。通过制备型hplc纯化得到的混合物。收集含有标题化合物的级分，并通过lcms进行表征。计算的分子量：596.55，观察的分子量：597.76。
实施例5.合成：
2-[2-[2-[2-[双[2-(十二烷基氨基)-2-氧代-乙基]氨基]乙基-[2-(十二烷基氨基)-2-氧代-乙基]氨基]乙基氨基]乙基-[2-(十二烷基氨基)-2-氧代-乙基]氨基]-n-十二烷基-乙酰胺，和
2-[2-[2-[2-[双[2-(十二烷基氨基)-2-氧代-乙基]氨基]乙基氨基]乙基氨基]乙基-[2-(十二烷基氨基)-2-氧代-乙基]氨基]-n-十二烷基-乙酰胺
根据下述一般反应路线图，合成两种标题化合物的混合物，显示为4-尾标题化合物(a)和5-尾标题化合物(b)：
将14.6mg(0.1mmol)n,n'-二(2-氨基乙基)乙烷-1,2-二胺、159mg(0.52mmol,5.2当量)如在上面实施例1中所述得到的2-溴-n-十二烷基乙酰胺和129mg(174μl,1mmol,10当量)n,n-二异丙基乙胺溶解在1mldmf中，并加热至约60℃过夜。通过制备型hplc纯化得到的混合物。
收集2-[2-[2-[2-[双[2-(十二烷基氨基)-2-氧代-乙基]氨基]乙基氨基]乙基氨基]乙基-[2-(十二烷基氨基)-2-氧代-乙基]氨基]-n-十二烷基-乙酰胺(上面显示的4-尾化合物)和2-[2-[2-[2-[双[2-(十二烷基氨基)-2-氧代-乙基]氨基]乙基-[2-(十二烷基氨基)-2-氧代-乙基]氨基]乙基氨基]乙基-[2-(十二烷基氨基)-2-氧代-乙基]氨基]-n-十二烷基-乙酰胺(上面显示的5-尾化合物)，并通过lcms进行表征。
就4-尾化合物而言：计算的分子量是1046.99，观察到的分子量是1048.28。就5-尾化合物而言：计算的分子量是1272.20，观察到的分子量是1273.50。
实施例6.十五烷基-4-溴丁酸酯的合成
根据下述一般反应路线图，合成标题中间体：
将4-溴丁基氯(1当量)溶解在二氯甲烷(50ml)中，并使用冰浴将反应烧瓶冷却至约0℃。向上述混合物中，使用压力平衡加料漏斗历时约30min缓慢地加入1-十五醇(1当量)在二氯甲烷(50ml)中的溶液。向得到的上述混合物中，加入催化量(5滴)的浓硫酸。将所述反应混合物在约0℃搅拌约30分钟，然后在室温搅拌4小时。将所述反应混合物转移至分液漏斗，并用饱和的碳酸氢钠(x3)、水(x2)、盐水(x1)洗涤有机层。有机层经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，得到期望的产物：作为无色油的十五烷基-4-溴丁酸酯(88％收率)。
没有观察到质量峰。通过试验反应确认预期的产物的结构：将苄胺(1当量)、n-甲基吗啉(1当量)、十五烷基-4-溴丁酸酯(0.9当量)加入含有二甲基甲酰胺(1ml)的干燥的厚壁派热克斯耐热玻璃管(pyrextube)中。将所述反应混合物暴露于微波辐照(200w)，在170℃保持10min。辐照后，通过所述仪器中的内置系统，使所述反应混合物冷却，直到温度已经降至低于约30℃。通过lcms分析得到的反应混合物。计算的分子量：403.64，观察的分子量：404.50。
实施例7.4-溴-n-十二烷基丁酰胺的合成
根据下述一般反应路线图，合成标题中间体：
在约0℃，向配有压力平衡加料漏斗的、含有二氯甲烷(200ml)的圆底烧瓶中加入4-溴丁酰氯(1.05当量)，并在氮下搅拌。单独地将十二烷基胺(1当量)和三乙胺(1当量)溶解在二氯甲烷(100ml)中，并将所述混合物转移至加料漏斗。将该混合物历时约60分钟非常缓慢地加入圆底烧瓶中。加入结束以后，将所述反应混合物在约0℃搅拌另外15分钟，并转移至分液漏斗。用饱和的碳酸氢钠(x3)、水(x2)和盐水(x1)洗涤有机层。有机层经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩，得到期望的产物：作为白色固体的4-溴-n-十二烷基丁酰胺(88.7％收率)。计算的分子量：333.17，观察的分子量：334.31。
实施例8.合成：
4,4'-(3-(甲基(4-氧代-4-(十五烷基氧基)丁基)氨基)丙基氮烷二基)二丁酸二十五烷基酯，和
4-(甲基(3-(4-氧代-4-(十五烷基氧基)丁基氨基)丙基)氨基)丁酸十五烷基酯
根据下述一般反应路线图，合成两种标题化合物的混合物：
给含有小磁力搅拌棒的干燥的微波反应合成容器装入n1-甲基丙-1,3-二胺(42mg、0.48mmole)、十五烷基-4-溴丁酸酯(2.1当量)、n,n-二异丙基乙基胺(2.1当量)和二甲基甲酰胺(1.0ml)。密封该容器，并将所述反应混合物在cem微波合成仪中加热至90℃。在约20分钟以后，停止反应，并使容器冷却至约40℃。反应粗制物的分析型lcms迹线表明期望的产物的形成。通过制备型lcms纯化粗制物。
小心地选择和合并含有期望的产物的所有级分。在减压下将每个级分的溶剂干燥减至原始体积的一半，随后加入1m的hcl在甲醇中的溶液(1.0ml)。最后，在真空下除去所有溶剂，得到在上面的反应路线图中所示的标题化合物(a)和(b)的盐酸盐，为白色固体。
就化合物(a)而言：计算的分子量是976.91，观察到的分子量是977.91。就化合物(b)而言：计算的分子量是680.64，观察到的分子量是681.64。
实施例9.用于体内递送的脂质组合物的制备
将本发明的一些脂质配制成脂质组合物，其也包含胆固醇、聚(乙二醇)(peg)脂质、缓冲剂和乙醇。不含动物源的胆固醇购自sigma-aldrich(stlouis,mo)，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)(c16peg2000pe)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)(c14peg2000pe)购自avantilipids(alabaster,al)。rnai是具有25-碱基对双链rna寡核苷酸(含有稳定化化学修饰)的stealthtmrnai。stealthtmrnai可商购得自invitrogen(carlsbad,ca)。
将干粉脂质再悬浮于乙醇中，并分别以52:20:28的重量比混合阳离子脂质:胆固醇:peg脂质。以1:4的比例，在200mm醋酸钠ph5.2溶液中非常迅速地混合脂质乙醇混合物。将最终的制剂(即，本发明的脂质+peg脂质+胆固醇的总和)在0.22μm滤器上无菌过滤，且在50mm醋酸钠和25％乙醇中具有15.625mg/ml的浓度和50-80nm的大小(前脂质体)。在表1中描述了制备的制剂。
表1.脂质制剂
(*)编号表示上面显示的本发明的具体化合物的编号
通过混合等体积的前脂质体和stealthtmrnai溶液(其在水和25％乙醇中稀释至1.5mg/ml)，制备脂复合物(sirna前脂质体复合物)。混合后，将所述复合物在约50℃温育约30分钟。温育后，使用
使用4-6周龄的小鼠。将具有反义序列5’-auuugcacagaucagcugcucauuc-3’的针对因子vii(fvii)小鼠基因的rnai和阴性对照mediumgc含量-rnai与如前所述的前脂质体形成复合物，并在体内试验。通过低压尾静脉注射，以10mg/kg和2mg/kg(sirna剂量)的剂量，给每只20g小鼠注射200μl脂复合物(其含有在pbs中的fvii或ctrlrnai)。在尾静脉注射以后36小时，分别收集肝组织和血清用于mrna和蛋白抑制分析。
将冷冻的肝组织研磨成粉，并使用
如下测定因子vii血清蛋白水平。通过肌肉内注射氯胺酮/赛拉嗪/乙酰丙嗪(分别75/5/1mg/kg)麻醉动物，通过眶后抽血收集血液，并处理血清，以根据生产商的方案使用产色测定(biophenfvii,aniaracorporation)测量因子vii蛋白水平。
图1提供的图总结了通过产色测定测得的不同的脂复合物制剂在肝脏中的因子vii蛋白残余活性的相对百分比。参考x轴，数字表示如表1所示的试验的阳离子脂质化合物。数据证实，这样的制剂确实在体内具有活性。当在肝脏中注射ctrl阴性对照时，没有观察到抑制。
图2提供的图总结了使用2个taqman测定通过qrt-pcr测得的mrna因子vii的相对百分比。在图2所示的每对条中，左侧的条表示taqman29测定，右侧的条表示taqman33测定。沿着x轴的编号表示如表1所示的试验的阳离子脂质化合物。数据证实，这样的制剂确实在体内具有活性。当在肝脏中注射ctrl阴性对照时，没有观察到抑制。
实施例10.脂质组合物的制备
基本上如上面在实施例9中所述，进行下述实验组，具有下述例外。不执行在sirna/脂复合物形成以后进行的透析步骤。另外，ivf2.0、57no和84no样品的干粉重量比是37.8:10.4:51.8，且57opt、72opt和84opt样品的干粉重量比是60:7:33。如表2所述制备制剂。
表2.脂质制剂
(*)编号表示上面显示的本发明的具体化合物的编号
图3提供的图总结了通过如上所述的qrt-pcr测得的因子viimrna的相对百分比。将结果标准化，并表示为随施用的剂量(mg/kg体重)而变化的剩余fvii表达百分比(y轴)。
实施例11.用于体外递送的脂质组合物的制备
将本发明的一些脂质配制成脂质组合物，其也包含胆固醇或dope、缓冲剂和乙醇。不含动物源的胆固醇购自sigma-aldrich(stlouis,mo)，dope购自avantilipids(alabaster,al)。用不含核酸酶的水再悬浮分别具有反义序列aaacuauaaucguacaucuga和uuacgucgucgcgucguuatt的
就化合物83和67而言，将干粉脂质以1mg/ml的终浓度再悬浮于乙醇中，并用作单独的脂质(化合物83)，或者以1:0.5的比例与胆固醇组合(化合物67)。如在表3中所述制备试验的制剂。
表3.脂质制剂
(＊)编号表示上面显示的本发明的具体化合物的编号
原代大鼠皮质神经元细胞购自gibco(目录号a10840)，并维持在补充了2％无血清的
在转染前2天，以10k细胞/孔，将神经元细胞铺板在聚-d-赖氨酸包被的96-孔平板中。在转染前1天，以25k细胞/孔，将hela细胞铺板在96-孔平板中。在1.5ml试管中，以30nm的终浓度，用20μl不含核酸酶的水稀释sirna(3pmol)。制备主混合物以覆盖所有要为每种sirna转染的孔。通过将0.15、0.3和/或0.6μl/孔或0.3μllipofectaminetmrnaimax(作为对照)抽吸进
图4描绘的图总结了通过qpcr测定测得的化合物83脂复合物制剂在hela细胞、大鼠原代皮质神经元和大鼠原代海马神经元中的csnk2a1剩余活性(相对于阴性对照标准化)的相对百分比。参考x轴，数字表示在表3中总结的阳离子脂质制剂在每个孔中的终体积。
图5提供的图总结了通过qpcr测定测得的化合物67脂复合物制剂在hela、原代皮质神经元和原代海马神经元中的csnk2a1剩余活性(相对于阴性对照标准化)的相对百分比。参考x轴，数字表示在表3中显示的阳离子脂质在每个试验孔中的终体积。数据证实，这样的制剂确实在体外具有活性。
上述结果证实，上述的制剂可有效地将sirna分子引入动物体内的不同器官中以及体外培养的动物和人细胞中。
实施例12.mrna的递送和体内表达
转染脂质的制备
根据本文所述的方法，在lifetechnologies,carlsbad,ca合成阳离子脂质87(上面显示)；不含动物源的胆固醇购自sigma-aldrich(stlouis)，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](铵盐)(c16peg))购自avantilipidsalabaster。在100％乙醇中在40℃稀释cb547、胆固醇和c16peg。然后使用配有27g针头的注射器，以20ml/分钟的流速，在200mm醋酸钠(ph5.2)中混合脂质混合物。然后在4℃保存制剂。
cremrna的制备
用于下述实验组的cre所用的cdna序列如下：
ttggaccctcgtacagaagctaatacgactcactatatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgcaacttttctatacaaagttgctatgggcccaaagaagaagagaaaggtttcgaatttactgaccgtacaccaaaatttgcctgcattaccggtcgatgcaacgagtgatgaggttcgcaagaacctgatggacatgttcagggatcgccaggcgttttctgagcatacctggaaaatgcttctgtccgtttgccggtcgtgggcggcatggtgcaagttgaataaccggaaatggtttcccgcagaacctgaagatgttcgcgattatcttctatatcttcaggcgcgcggtctggcagtaaaaactatccagcaacatttgggccagctaaacatgcttcatcgtcggtccgggctgccacgaccaagtgacagcaatgctgtttcactgg
ttatgcggcggatccgaaaagaaaacgttgatgccggtgaacgtgcaaaacaggctctagcgttcgaacgcactgatttcgaccaggttcgttcactcatggaaaatagcgatcgctgccaggatatacgtaatctggcatttctggggattgcttataa
caccctgttacgtatagccgaaattgccaggatcagggttaaagatatct
cacgtactgacggtgggagaatgttaatccatattggcagaacgaaaacgctggttagcaccgcaggtgtagagaaggcacttagcctgggggtaactaaactggtcgagcgatggatttccgtctctggtgtagctgatgatccgaataactacctgttttgccgggtcagaaaaaatggtgttgccgcgccatctgccaccagccagc
tatcaactcgcgccctggaagggatttttgaagcaactcatcgattgatttacggcgctaaggatgactctggtcagagatacctggcctggtctggacacagtgcccgtgtcggagccgcgcgagatatggcccgcgctggagtttcaataccggagatcatgcaagctggtggctggaccaatgtaaatattgtcatgaactatatccgtaacctggatagtgaaacaggggcaatggtgcgcctgctggaagatggcgattagacatagcagcaattggcaagctgcttatatagaacttgcggcgattggca
tgccgctttaaaattttattttattttcttttcttttccgaatcggatacatagcagcaattggcaagctgcttatatagaacttgcggcgattggcatgccgctttaaaattttattttattttcttttcttttccgaatcggatacatagcagcaattggcaagctgcttatatagaacttgcggcgattggcatgccgctttaaaattttattttattttcttttcttttccgaatcggatacatagcagcaattggcaagctgcttatatagaacttgcggcgattggcatgccgctttaaaattttattttattttcttttcttttccgaatcggatacatagcagcaattggcaagctgcttatatagaacttgcggcgattggcatgccgctttaaaattttattttattttcttttcttttccgaatcggatacatagcagcaattggcaagctgcttatatagaacttgcggcgattggcatgccgctttaaaattttattttattttcttttcttttccgaatcggat
合成了含有所述cdna序列的dna质粒(
根据生产商的方案，用asei限制性酶(newenglandbiosciences,目录号r0526)消化纯化的质粒dna。根据生产商的方案，使用purelinktmpcr纯化试剂盒(lifetechnologies,目录号k310001)，纯化线性化的dna，并用净化水洗脱。通过uv吸光度测定dna浓度。根据生产商的方案，使用promegaribomaxtm大规模rna生产系统-t7(目录号p1300)来合成mrna。在每个反应中，5-10μg线性化的dna产生200-250μgmrna。合成后，使用苯酚:氯仿萃取纯化mrna，随后进行乙醇沉淀。将mrna产物再悬浮于净化水中，并测定浓度。使用scriptcaptmm7g加帽系统(目录号c-scce0625)和scriptcaptm2’-o-甲基转移酶试剂盒(目录号c-scmt0625)(二者得自cellscripttm)，给mrna加帽。使用
含有脂质87和cremrna的转染复合物的制备
在含有25％乙醇的水中，将在前述步骤中合成的mrna的浓度调至0.3mg/ml。通过混合等体积的前脂质体和mrna溶液，制备脂复合物(mrna前脂质体复合物)。混合后，将所述复合物在50℃温育30分钟，然后使用
invivofectamine-547mrna复合物的静脉内注射
在动物研究中使用的所有操作都得到动物实验管理小组(iacuc)的批准，且符合适用的当地州和联邦法规。小鼠购自jacksonlaboratories(b6.129s4-gt(rosa)26sortm3(cag-luc)tyj/j)。该小鼠携带cmv驱动的萤光素酶报道基因，其具有在cmv启动子控制下的loxp-侧接的终止密码子。在有cre重组酶存在下，loxp位点重组以切离终止密码子，由此实现萤光素酶报道蛋白的翻译。
就lacz实验而言，购买4-6周龄的携带lacz基因的小鼠(b6.129s4-gt(rosa)26sortm1sor/j)。使用标准方法，通过qrt-pcr测定lacz的表达。以1.5mg/kg和0.5mg/kg(mrna剂量)的剂量，通过低压尾静脉注射，给每只小鼠注射2种200μl如上所述制备的脂复合物，其含有在pbs中的mrnacre。就发光成像而言，小鼠接受腹膜内施用的150mg荧火虫萤光素酶(biosynthag,staad,瑞士)/kg体重。在用异氟烷气体(abbottlaboratories,northchicago,il)麻醉以后，将小鼠放入xenogenivis成像站(xenogencorp.,alameda,ca)中，并使用livingimagesoftware(xenogencorporation)获取图像。
图6a显示了在1.5mg/kg(左)、0.5mg/kg(中)或pbs(右)，用含有cremrna和脂质87的转染复合物处理的小鼠的全身图像。使用xenogenivis测量萤光素酶表达，并定量信号。
图6b显示了从图6a所示的2只处理过的小鼠各自切出的完整固定的肺、心脏、脾和肝(如指示的)器官。在xenogenivis上测量萤光素酶表达。在肝和脾中检测到萤光素酶表达。在注射了pbs的小鼠中没有检测到萤光素酶表达(图1)。
图7a–f的图解表示显示了通过qrt-pcr测得的lacz基因表达的分析。通过cts测得，与对照相比，用含有cremrna和脂质87的转染复合物处理的小鼠表现出lacz基因在脾(对比脾对照hmbs表达图7a和脾lacz表达图7b)、肝(对比肝对照hmbs表达图7c和肝lacz表达图7d)中的远远更强的表达。使用hmbs，将cdna输入标准化。在肾中没有观察到lacz的表达的增加(图7e和图7f)。
尽管在上面详细地描述和例证了仅仅几个实施方案，本领域普通技术人员会清楚地理解，许多修改在描述的实施方案中是可能的，而不会脱离其教导。所有这样的修改意图被包括在下述权利要求书中。
序列表
<170>patentin版本3.5
<210>1
<211>29
<212>prt
<213>智人
<400>1
hisserglnglythrphethrserasptyrserlystyrleuaspser
151015
argargalaglnaspphevalglntrpleumetasnthr
2025
<210>2
<211>29
<212>prt
<213>人工序列
<110>生命科技公司
<120>含胺的转染试剂及其制备和使用方法
<130>lt00313
<140>13/297,231
<141>2011-11-15
<150>61/543,242
<151>2011-10-04
<150>61/438,903
<151>2011-02-02
<150>61/437,503
<151>2011-01-28
<150>61/413,905
<151>2010-11-15
<160>4
<170>patentin版本3.5
<210>1
<211>25
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸
<400>1
auuugcacagaucagcugcucauuc25
<210>2
<211>21
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸
<400>2
aaacuauaaucguacaucuga21
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:合成的寡核苷酸
<220>
<223>合并的dna/rna分子的描述:合成的寡核苷酸
<400>3
uuacgucgucgcgucguuatt21
<210>4
<211>1750
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:合成的多核苷酸
<400>4
ttggaccctcgtacagaagctaatacgactcactatatgggcggtaggcgtgtacggtgg60
gaggtctatataagcagagctcgcaacttttctatacaaagttgctatgggcccaaagaa120
gaagagaaaggtttcgaatttactgaccgtacaccaaaatttgcctgcattaccggtcga180
tgcaacgagtgatgaggttcgcaagaacctgatggacatgttcagggatcgccaggcgtt240
ttctgagcatacctggaaaatgcttctgtccgtttgccggtcgtgggcggcatggtgcaa300
gttgaataaccggaaatggtttcccgcagaacctgaagatgttcgcgattatcttctata360
tcttcaggcgcgcggtctggcagtaaaaactatccagcaacatttgggccagctaaacat420
gcttcatcgtcggtccgggctgccacgaccaagtgacagcaatgctgtttcactggttat480
gcggcggatccgaaaagaaaacgttgatgccggtgaacgtgcaaaacaggctctagcgtt540
cgaacgcactgatttcgaccaggttcgttcactcatggaaaatagcgatcgctgccagga600
tatacgtaatctggcatttctggggattgcttataacaccctgttacgtatagccgaaat660
tgccaggatcagggttaaagatatctcacgtactgacggtgggagaatgttaatccatat720
tggcagaacgaaaacgctggttagcaccgcaggtgtagagaaggcacttagcctgggggt780
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cggcgattggcatgccgctttaaaattttattttattttcttttcttttccgaatcggat1260
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gcttatatagaacttgcggcgattggcatgccgctttaaaattttattttattttctttt1440
cttttccgaatcggatacatagcagcaattggcaagctgcttatatagaacttgcggcga1500
ttggcatgccgctttaaaattttattttattttcttttcttttccgaatcggatacatag1560
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