本发明属于生物技术领域，具体涉及一种麦胚清蛋白诱导肝癌细胞分泌外泌体的方法。
背景技术：
外泌体无论在正常细胞还是异常细胞中都能分泌。由于外泌体是囊泡结构，又有母细胞分泌而来。因此有两点信息非常重要，一个是携带了母细胞的信息，一个是保护了内部成分在细胞外免受降解。研究表明，外泌体无论对于正常生命过程或者是疾病发生发展都有着重要的作用。外泌体的大小：外泌体的直径约40-150 nm；随着对外泌体研究的深入，已经证明，不同细胞来源的外泌体能有效激活或抑制免疫应答、促进炎症反应、参与自体免疫性疾病和感染性疾病的调控作用。用各种天然和化学化合物处理亲本细胞可以调节miRNA选择性的分选成外泌体的过程。
胚芽具有应激相关蛋白（胁迫/疾病/防御）21.6%，信号传导蛋白（Signal Transduction）占10.4%，能明显提高小鼠的脾指数、腹腔巨噬细胞的吞噬百分率、吞噬指数和B淋巴细胞的转化功能。麦胚盐提物中分离出了α、γ型蛋白，其中γ型蛋白与免疫球蛋白结构类似。麦胚清蛋白较强的免疫刺激和抑制癌转移效应，可成功地用作免疫刺激和转移抑制药用组合物中的活性物质，尤其是对肝癌细胞的转移有明显地抑制作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种麦胚清蛋白诱导肝癌细胞分泌外泌体的方法，采用富含营养因子的麦胚清蛋白诱导肝癌细胞分泌大量外泌体，提高外泌体的分泌量。
一种一种麦胚清蛋白诱导肝癌细胞分泌外泌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：使用无外泌体的胎牛血清培养HepG2 细胞，待细胞长到50%～65%时，向其中加入WGA（终浓度0.1 mM～0.5 mM）继续培养24小时；对照组不加WGA。
步骤2：24小时后，收集上清液于15 ml无菌离心管中进行离心处理（3000 g，15分钟）；离心结束后小心将上清移至另一15 ml无菌离心管中，同时根据说明书加入相应量的Exo Quick-TC提取液，使得上清：Exo Quick-TC=5:1，然后轻轻上下颠倒充分混匀；放入4 ℃冰箱中，静置过夜，时间至少控制在12小时以上。
步骤3：将步骤2的混合液进行离心（1500 g，30分钟），小心倒掉上清，注意不能冲掉底部沉淀；再次离心（1500 g，5分钟）；用移液枪尽量吸去上清，所得的最终沉淀即为外泌体；加入160 μl PBS重悬外泌体，并充分混匀；分装后，-80 ℃保存备用。
步骤4：纳米颗粒跟踪分析技术是一种比较新颖的表征纳米颗粒的方法，它可直接并实时观测纳米颗粒。NTA 通过光学显微镜收集纳米颗粒的散射光信号，拍摄一段纳米颗粒在溶液中做布朗运动的影像，对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学浓度。
步骤5：Western blot方法检测外泌体的标志物，从-80 ℃冰箱中取出外泌体，冰上自然解冻，加入相应量的蛋白裂解液（RIPA+ 1 mM PMSF），冰上裂解10分钟。提取蛋白后，使用Western blot方法检测外泌体标志蛋白CD63的表达。
附图说明
图1是技术路线图；
图2是实施例1的WGA诱导组和对照组标志蛋白CD63表达；
图3是实施例2的WGA诱导组和对照组标志蛋白CD63表达；
图4是实施例3的WGA诱导组和对照组标志蛋白CD63表达；
图5是实施例4的WGA诱导组和对照组标志蛋白CD63表达；
图6是实施例1的外泌体的浓度和粒径分布；
图7是实施例2的外泌体的浓度和粒径分布；
图8是实施例3的外泌体的浓度和粒径分布；
图9是实施例4的外泌体的浓度和粒径分布。
具体实施方式
实施例1
一种麦胚清蛋白诱导肝癌细胞分泌外泌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：使用无外泌体的胎牛血清培养HepG2细胞，待细胞长到50%时，向其中加入WGA（终浓度0.5 mM）继续培养24小时；对照组不加WGA。
步骤2：24小时后，收集上清液于15 ml无菌离心管中进行离心处理（3000 g，15分钟）；离心结束后小心将上清移至另一15 ml无菌离心管中，同时根据说明书加入相应量的Exo Quick-TC提取液，使得上清：Exo Quick-TC=5:1，然后轻轻上下颠倒充分混匀；放入4 ℃冰箱中，静置过夜，时间至少控制在12小时以上。
步骤3：将步骤2的混合液进行离心（1500 g，30分钟），小心倒掉上清，注意不能冲掉底部沉淀；再次离心（1500 g，5分钟）；用移液枪尽量吸去上清，所得的最终沉淀即为外泌体；加入160 μl PBS重悬外泌体，并充分混匀；分装后，-80 ℃保存备用。
步骤4：通过纳米颗粒跟踪分析技术直接并实时观测纳米颗粒，对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学浓度（见附图2）。
步骤5：Western blot方法检测外泌体的标志物，从-80 ℃冰箱中取出外泌体，冰上自然解冻，加入相应量的蛋白裂解液（RIPA+1 mM PMSF），冰上裂解10 分钟。提取蛋白后，使用 Western blot方法检测外泌体标志蛋白CD63的表达（见附图3）。
实施例2
一种麦胚清蛋白诱导肝癌细胞分泌外泌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：使用无外泌体的胎牛血清培养HepG2细胞，待细胞长到55%时，向其中加入WGA（终浓度0.4 mM）继续培养24小时；对照组不加WGA。
步骤2：24小时后，收集上清液于15 ml无菌离心管中进行离心处理（3000 g，15分钟）；离心结束后小心将上清移至另一15 ml无菌离心管中，同时根据说明书加入相应量的Exo Quick-TC提取液，使得上清：Exo Quick-TC=5:1，然后轻轻上下颠倒充分混匀；放入4 ℃冰箱中，静置过夜，时间至少控制在12小时以上。
步骤3：将步骤2的混合液进行离心（1500 g，30分钟），小心倒掉上清，注意不能冲掉底部沉淀；再次离心（1500 g，5分钟）；用移液枪尽量吸去上清，所得的最终沉淀即为外泌体；加入160 μl PBS重悬外泌体，并充分混匀；分装后，-80 ℃保存备用。
步骤4：通过纳米颗粒跟踪分析技术直接并实时观测纳米颗粒，对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学浓度（见附图4）。
步骤5：Western blot 方法检测外泌体的标志物，从-80 ℃冰箱中取出外泌体，冰上自然解冻，加入相应量的蛋白裂解液（RIPA+1 mM PMSF），冰上裂解10 分钟。提取蛋白后，使用 Western blot 方法检测外泌体标志蛋白CD63的表达（见附图5）。
实施例3
一种麦胚清蛋白诱导肝癌细胞分泌外泌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：使用无外泌体的胎牛血清培养HepG2细胞，待细胞长到60%时，向其中加入WGA（终浓度0.3 mM）继续培养24小时；对照组不加WGA。
步骤2：24小时后，收集上清液于15 ml无菌离心管中进行离心处理（3000 g，15分钟）；离心结束后小心将上清移至另一15 ml无菌离心管中，同时根据说明书加入相应量的Exo Quick-TC提取液，使得上清：Exo Quick-TC=5:1，然后轻轻上下颠倒充分混匀；放入4 ℃冰箱中，静置过夜，时间至少控制在12小时以上。
步骤3：将步骤2的混合液进行离心（1500 g，30分钟），小心倒掉上清，注意不能冲掉底部沉淀；再次离心（1500 g，5分钟）；用移液枪尽量吸去上清，所得的最终沉淀即为外泌体；加入160 μl PBS重悬外泌体，并充分混匀；分装后，-80 ℃保存备用。
步骤4：通过纳米颗粒跟踪分析技术直接并实时观测纳米颗粒，对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学浓度（见附图6）。
步骤5：Western blot方法检测外泌体的标志物，从-80 ℃冰箱中取出外泌体，冰上自然解冻，加入相应量的蛋白裂解液（RIPA+1 mM PMSF），冰上裂解10 分钟。提取蛋白后，使用 Western blot方法检测外泌体标志蛋白CD63的表达（见附图7）。
实施例4
一种麦胚清蛋白诱导肝癌细胞分泌外泌体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：使用无外泌体的胎牛血清培养HepG2细胞，待细胞长到65%时，向其中加入WGA（终浓度0.2 mM）继续培养24小时；对照组不加WGA。
步骤2：24小时后，收集上清液于15 ml无菌离心管中进行离心处理（3000 g，15分钟）；离心结束后小心将上清移至另一15 ml无菌离心管中，同时根据说明书加入相应量的Exo Quick-TC提取液，使得上清：Exo Quick-TC=5:1，然后轻轻上下颠倒充分混匀；放入4 ℃冰箱中，静置过夜，时间至少控制在12小时以上。
步骤3：将步骤2的混合液进行离心（1500 g，30分钟），小心倒掉上清，注意不能冲掉底部沉淀；再次离心（1500 g，5分钟）；用移液枪尽量吸去上清，所得的最终沉淀即为外泌体；加入160 μl PBS重悬外泌体，并充分混匀；分装后，-80 ℃保存备用。
步骤4：通过纳米颗粒跟踪分析技术直接并实时观测纳米颗粒，对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出纳米颗粒的流体力学浓度（见附图8）。
步骤5：Western blot方法检测外泌体的标志物从-80 ℃冰箱中取出外泌体，冰上自然解冻，加入相应量的蛋白裂解液（RIPA+1 mM PMSF），冰上裂解10 分钟。提取蛋白后，使用 Western blot方法检测外泌体标志蛋白CD63的表达（见附图9）。
从附图6、附图7、附图8、附图9比较可以看出，附图9的WGA组明显高于对照组，说明WGA诱导肝癌细胞，可以提高外泌体的浓度。经计算得出WGA诱导组浓度高于对照组10%左右，即（13-11.8）/11.8=10.17% 。