本发明涉及生物医学领域，尤其涉及促进骨髓干细胞分化为肝细胞的细胞外基质的制备方法。
背景技术：
每年世界上约有八十万到一百二十万人死于肝病，约占总死亡人次的1.3%-2%。中国作为肝病高发高传染率的重灾区，提供经济有效的手段治疗肝病是一项迫在眉睫的任务。肝病按照病理进程以及肝功能的变化可分为前期中期的肝纤维化和末期的肝硬化以及终末期导致的肝失代偿，以乙肝为例，前期中期甚至末期抗病毒药物能通过抑制病毒复制或有效缓解肝病。然而由于肝自身再生能力强，肝病前期中期表型不明显，一旦查出为末期以后居多。
肝脏移植将健康肝脏通过外科手术移植入肝衰竭的病人体内，一直以来是临床治疗终末期肝病的主要甚至唯一的有效手段。然而有限的健康肝脏供给，昂贵的手术费用，限制了肝脏移植的应用。并且肝脏移植并不能彻底治愈患者，终身严重的免疫排斥，以及病人免疫抑制后的各种并发症等等因素使术后病人延长平均5年最长至10到35年的寿命。
目前在研有望替代肝脏移植的疗法为肝细胞移植。利用自体干细胞或者免疫原性弱的间充质干细胞分化成为肝细胞的话，可以解决移植后免疫排斥的问题。肝细胞移植的主要限制性环节在于体外获取成熟的具有肝功能的细胞。间充质干细胞是成年人体内各个组织器官中都存在的干细胞，如脂肪间充质干细胞，骨髓间充质干细胞等。由于没有伦理争议，来源广泛，容易获取，且免疫原性极低，是体外分化肝细胞的最优选择。如今促进间充质干细胞分化成熟肝细胞的方法多为添加一种或者各种高浓度的细胞因子，如最常用的肝细胞生长因子（HGF）。由于细胞因子价格昂贵，且这种方法分化肝细胞效率不高，分化而来的细胞代谢能力较正常肝细胞弱，直接限制了肝细胞移植疗法的发展应用。
随着对细胞分化研究的深入，人们发现肝组织来源的细胞外基质可以在很大程度上促进肝分化。细胞外基质上的胶原等可以作为信号响应并激活附着在细胞外基质上的细胞膜上的受体，从而激活细胞内的信号通路维持细胞稳态促进细胞在需要的时候生长分化。组织脱细胞后的并进行冻干处理的细胞外基质去除了免疫原性，主要留下胶原纤维附着有细胞因子复合体，并不需要额外添加细胞因子。因此使用脱细胞之后基本无免疫原性的细胞外基质，可以代替直接添加细胞因子的方法来促进间充质干细胞分化为肝细胞。
中国专利CN201510937399.0公开了一种可提高肝细胞体外分化表型及功能的培养方法。使用了肝细胞，肝源性间质细胞和细胞外基质接种到多孔蚕丝蛋白支架上并模拟肝细胞体外培养微环境进行培养。此发明显著提高了分化得来的肝细胞功能，可以用于评价药物对肝代谢酶的影响以及肝毒性检测。然而肝细胞具有健全的表面抗原表达，肝源性间充质细胞的分离较其他来源的间充质干细胞又更加繁琐且数量较少，加之要获得人来源的肝组织细胞需要进行大创伤手术，因此，这种提高肝细胞体外分化表型及功能的方法不适用于肝细胞移植治疗人的肝病，而更适宜作体外研究用途。中国专利CN201310203436.6发明了一种骨髓间充质干细胞自分泌细胞外基质并诱导其成为肝细胞的方法。使用由骨髓间充质干细胞所分泌的并且去除了骨髓间充质干细胞的基质，诱导效率高，分化效果好，诱导得到的肝细胞糖原合成能力和尿素合成能力强。然而骨髓间充质干细胞自分泌得到的细胞外基质的量较直接用模式动物组织脱细胞法制备的细胞外基质的量要少几个数量级，且过程较为繁琐耗时长费细胞，需先经骨髓间充质干细胞培养分泌细胞外基质，再分离细胞外基质，接着再次接种骨髓间充质干细胞诱导其分化成为肝细胞。因此，费用较使用细胞因子诱导肝细胞分化更为昂贵，不利于大规模生产应用。
肝脏是人体内最大的内脏器官，位于人体腹上区右侧横膈膜之下，胆囊前端右边肾脏前方。肝上面被韧带分为左右两叶，下面有横沟是肝门静脉，肝动脉，肝管，神经和淋巴管出入的地方。肝组织有无数肝小叶组成基本单元，同时接受来自肝动脉的血液和门静脉中来自消化道的血液。肝作为代谢极为活跃的腺体，承担着糖原分解合成存储，分泌血浆蛋白，分泌尿素，胆汁，吸收和降解血液循环中的废物和毒素等至关重要的作用。肝中细胞包括大多数肝脏实质细胞，肝非实质细胞，如响应炎症信号的肝巨噬细胞即星状细胞，保持肝血窦物质交换通透性的肝血窦内皮细胞，必要是促进肝各类细胞再生的肝间充质干细胞等等。
人体含有大约12mg的锰，大多数在骨骼，肝脏和肾脏中。锰离子是人体发育代谢和抗氧化系统必需的成分，需要锰离子作为酶反应的辅助因子（辅酶）的酶有氧化还原酶家族，转移酶家族，水解酶家族，拓扑酶家族，连接酶家族等等。锰元素也作为化合物形式（即硫酸锰）存在于真核生物线粒体中，作为需氧生物在氢离子传递链上产生过氧化物时解毒的必要成分。我们的研究证明了适量的Mn离子可以帮助附着在细胞外基质上的骨髓间充质干细胞扩增和分化所需酶的效率并降低代谢过程中过氧化物对于细胞的伤害，从而促进肝细胞的分化并维持良好的细胞微环境。
综上所述，由于现有的肝细胞分化方法步骤繁琐代价昂贵，且不能在临床应用的角度去解决怎样获得无免疫排斥的成熟可用的肝细胞的问题，因此，开发一款步骤简洁用料经济，并且利于临床使用的治疗肝病的肝细胞的方法是十分必要的。
技术实现要素：
本发明实施例提供了促进骨髓干细胞分化为肝细胞的细胞外基质的制备方法，使制备的细胞外基质具有调节骨髓间充质干细胞微环境，诱导骨髓间充质干细胞向成熟肝细胞分化的优点。可用于在科研中研究肝病机理筛选药物以及在临床肝细胞移植治疗肝病前准备肝细胞。
为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：
本发明实施例提供一种促进骨髓干细胞分化为肝细胞的细胞外基质的制备方法，所述促进骨髓干细胞分化为肝细胞的细胞外基质的制备方法包括：
步骤一：准备猪肝细胞外基质；
步骤二：患者自体骨髓间充质干细胞的分离和培养；
步骤三：体外3D培养的骨髓间充质干细胞分化为肝细胞；
步骤四：肝细胞的功能评价。
进一步地，所述步骤一，具体包括：
获取完整新鲜的猪肝脏，将肝动脉和肝胆管结扎，只留下腔静脉开着作为出口，将导管插入门静脉后，立即使用蠕动泵(型号如Millipore, Billerica, MA,USA）以100mL/min的速率将20L 含有5000IU/L肝素的无菌PBS溶液灌注猪肝来移除肝内血液；
按照顺序在4℃逐步用150L预冷的0.01% 十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，150L 预冷的0.1% SDS溶液，50L 预冷的1% SDS溶液和50L 1%预冷的Triton X-100灌注猪肝来使其脱细胞，最后，使用100L蒸馏水灌注清洗脱完细胞的肝脏，以此来移除残留的表面活性剂和细胞残留；
将脱细胞后的猪肝进行低压冻干处理后使用旋转刀片研磨机磨成颗粒状，将得到的粉末以50mg/L的浓度在无菌PBS溶液中重悬，并用匀浆仪混匀形成猪肝细胞外基质乳状液，使用60 Co gamma辐射（15kGy）对猪肝细胞外基质乳状液进行灭菌处理，灭菌后储存在4℃以备后用。
进一步地，所述步骤二，具体包括：
按照正颌手术或种植手术的的方法取患者无病害的颌骨骨碎片碎屑，置于α-MEM培养液中4℃保存，用无菌PBS溶液清洗三次，常温下800rpm离心5min得到细胞沉淀和骨碎片；用含有10%胎牛血清的α-MEM培养液将细胞沉淀和骨碎片混合物轻轻吹打混匀，接种到六孔培养板中。在37℃，5% CO2和饱和湿度条件下培养3-7天，直到有细胞从组织边缘爬出。细胞密度达80%时，0.25%胰酶传代消化，逐步扩增到2.5x105。
进一步地，所述步骤三，具体包括：
将2.5x105患者骨髓间充质干细胞消化离心，重悬在200μL前面准备好的猪肝细胞外基质乳状液和一型胶原等密度混合液中，接种在24孔平板中，加入50μM Mn2+，在37℃，5% CO2和饱和湿度条件下培养30min使胶质凝固，加500μL含有10%胎牛血清的α-MEM到每个孔，每两天换一次培养液，培养2周后抽样进行石蜡固定检测糖原（PAS染色），血清白蛋白（免疫荧光）等肝功能指标。
进一步地，所述步骤四，具体包括：
取步骤三培养的人骨髓间充质干细胞和猪源肝细胞外基质混合物经过液氮彻底研磨，根据TRIZOL说明书提取RNA进行反转录和荧光定量PCR验证肝细胞标志基因的RNA表达，另外根据蛋白裂解说明书取步骤三培养的人骨髓间充质干细胞和猪源肝细胞外基质混合物，用无菌PBS溶液清洗三次后，加入蛋白裂解液用作Western blot检测，验证分化的肝细胞标志蛋白表达。
在动物实验中进行了验证：采用的是四氯化碳诱导的肝纤维化动物模型，是公认的筛选治疗肝病导致的纤维化药物的活体实验模型。文章发表在Journal of Tissue Engineering Regeneration Medicine(Doi:10.1002/term.2161.).其具体操作步骤为：每周两次持续4周对重约250±20g的SD大鼠腹腔注射1mL/kg体重，以60%的浓度溶解在菜籽油中的四氯化碳溶液，来诱导大鼠肝纤维化。最后一次四氯化碳注射完毕24h后，将纤维化的大鼠分成对照组, 骨髓间充质干细胞组，锰离子激活的骨髓间充质干细胞组。对照组为只注射0.5mL无菌PBS溶液的大鼠，骨髓间充质干细胞组为用0.5mL无菌PBS溶液为溶液,通过门静脉注射了3×106骨髓间充质干细胞的大鼠，锰离子激活的骨髓间充质干细胞组为50 μM锰离子处理3×106骨髓间充质干细胞16h后溶解在0.5mL无菌PBS溶液中通过门静脉注射的大鼠。每组含有至少10只大鼠。治疗四周后进行血清学，组织病理学，RNA以及蛋白的检测。
在细胞实验中进行了验证：客观的检测了不同的一型胶原和细胞外基质乳状液混合比对诱导骨髓间充质干细胞分化成肝细胞的影响，为最优化的细胞处理工艺的选择提供理论依据。其具体操作步骤为：将对照组、骨髓间充质干细胞组细胞收集后，用无菌PBS溶液清洗三次，每孔加入1ml Trizol裂解液，静置5min后收样于无酶1.5ml EP管中。按照Trizol试剂盒细胞样品RNA提取步骤，进行RNA的抽提。抽提完成后，进行RNA浓度及A260/A280的测定。按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit逆转录试剂盒的说明书进行RNA逆转，并以cDNA为模板用RT-PCR检测目的基因表达。
本发明所提供细胞外基质的制备方法，其优势在于：
1、此方法可以用从患者自身颌骨获取骨髓间充质干细胞，再用脱细胞处理后冻干的猪来源细胞外基质，加入适量锰离子混合培养诱导分化成熟人肝细胞，彻底解决细胞移植免疫排斥的问题。
2、此方法从小型猪上取材细胞外基质方便经济，后期诱导培养不需要添加细胞因子，进一步降低了成本，便于推广应用，既可以用于分化作为科研筛选肝病药物的细胞，也可以作为临床肝细胞移植治疗肝病的肝细胞来源。
附图说明
图1为本发明体外猪源肝细胞基质成肝细胞检测结果；
图2为本发明中锰离子激活的骨髓间充质干细胞从门静脉注射治疗由四氯化碳诱导的大鼠急性肝衰竭效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。
实施例1
步骤一：准备猪肝细胞外基质
将体重为60kg到80kg的成年小型猪麻醉，获取完整新鲜的肝脏。将肝动脉和肝胆管结扎，只留下腔静脉开着作为出口。将导管插入门静脉后，立即使用蠕动泵(型号如Millipore, Billerica, MA,USA）以100mL/min的速率将20L 含有5000IU/L肝素的无菌PBS溶液灌注猪肝来移除肝内血液。
按照顺序依次在4℃逐步用150L预冷的0.01% 十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，150L 预冷的0.1% SDS溶液，50L 预冷的1%SDS溶液和50L 1%预冷的Triton X-100灌注猪肝来使其脱细胞。最后，使用100L蒸馏水灌注清洗脱完细胞的肝脏，以此来移除残留的表面活性剂和细胞残留。如需要进行质量检测，在脱细胞步骤完成后，可以在4℃将小块脱细胞后的肝叶样本用4%多聚甲醛过夜固定并进行组化检测脱细胞效果和细胞因子分析等。
为了生产胶状猪肝细胞外基质，将脱细胞后的猪肝进行低压冻干处理后使用旋转刀片研磨机磨成颗粒状。将得到的粉末以50mg/L的浓度在无菌PBS溶液中重悬，并用匀浆仪混匀形成猪肝细胞外基质乳状液。使用60 Co gamma辐射（15kGy）对猪肝细胞外基质乳状液进行灭菌处理。灭菌后储存在4℃以备后用。以下步骤中除非特殊说明，否则猪肝细胞外基质乳状液都是和一型胶原等份混合以形成用于3D培养的胶状支架。
步骤二：患者自体骨髓间充质干细胞的分离和培养
按照正颌手术或种植手术的的方法取患者无病害的颌骨骨碎片碎屑，置于α-MEM培养液中4℃保存，用无菌PBS溶液清洗三次，常温下800rpm离心5min得到细胞沉淀和骨碎片。用含有10%胎牛血清的α-MEM培养液将细胞沉淀和骨碎片混合物轻轻吹打混匀，接种到六孔培养板中。在37℃，5% CO2和饱和湿度条件下培养3-7天，直到有细胞从组织边缘爬出。细胞密度达80%时，0.25%胰酶传代消化，逐步扩增到2.5x105 (需要大约3-5次传代)。
步骤三：体外3D培养的骨髓间充质干细胞分化为肝细胞
将2.5x105患者骨髓间充质干细胞消化离心，重悬在200μL前面准备好的猪肝细胞外基质乳状液和一型胶原等密度混合液中，接种在24孔平板中，加入50 μM Mn2+，在37℃，5% CO2和饱和湿度条件下培养30min使胶质凝固。加500μL含有10%胎牛血清的α-MEM到每个孔，每两天换一次培养液。培养2周后即可抽样进行石蜡固定检测糖原（PAS染色），血清白蛋白（免疫荧光）等肝功能指标。
步骤四：肝细胞的功能评价
为了检测分化的肝细胞，取步骤三培养的人骨髓间充质干细胞和猪源肝细胞外基质混合物经过液氮彻底研磨，根据TRIZOL说明书提取RNA进行反转录和荧光定量PCR验证肝细胞标志基因的RNA表达。另外根据蛋白裂解说明书取步骤三培养的人骨髓间充质干细胞和猪源肝细胞外基质混合物，用无菌PBS溶液清洗三次后，加入蛋白裂解液用作Western blot检测，验证分化的肝细胞标志蛋白表达。
在动物实验中进行了验证：采用的是四氯化碳诱导的肝纤维化动物模型，是公认的筛选治疗肝病导致的纤维化药物的活体实验模型。文章发表在Journal of Tissue Engineering Regeneration Medicine(Doi:10.1002/term.2161.).其具体操作步骤为：每周两次持续4周对重约250±20g的SD大鼠腹腔注射1mL/kg体重，以60%的浓度溶解在菜籽油中的四氯化碳溶液，来诱导大鼠肝纤维化。最后一次四氯化碳注射完毕24h后，将纤维化的大鼠分成对照组, 骨髓间充质干细胞组，锰离子激活的骨髓间充质干细胞组。对照组为只注射0.5mL无菌PBS溶液的大鼠，骨髓间充质干细胞组为用0.5mL无菌PBS溶液为溶液,通过门静脉注射了3×106骨髓间充质干细胞的大鼠，锰离子激活的骨髓间充质干细胞组为50 μM锰离子处理3×106骨髓间充质干细胞16h后溶解在0.5mL无菌PBS溶液中通过门静脉注射的大鼠。每组含有至少10只大鼠。治疗四周后进行血清学，组织病理学，RNA以及蛋白的检测。
在细胞实验中进行了验证：客观的检测了不同的一型胶原和细胞外基质乳状液混合比对诱导骨髓间充质干细胞分化成肝细胞的影响，为最优化的细胞处理工艺的选择提供理论依据。其具体操作步骤为：将对照组、骨髓间充质干细胞组细胞收集后，用无菌PBS溶液清洗三次，每孔加入1ml Trizol裂解液，静置5min后收样于无酶1.5ml EP管中。按照Trizol试剂盒细胞样品RNA提取步骤，进行RNA的抽提。抽提完成后，进行RNA浓度及A260/A280的测定。按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis kit逆转录试剂盒的说明书进行RNA逆转，并以cDNA为模板用RT-PCR检测目的基因表达。
如图1所示，为本发明体外猪源肝细胞基质成肝细胞检测结果；
图1A：有或没有猪源肝细胞基质的三维凝胶状支架结构整体图。图1B：通过MTT细胞增值检测说明小鼠成纤维细胞系L929在从L-ECM中获得的浸提液中培养，其增值能力增强。图1C,D：对有（图1C）或没有（图1D）猪源细胞外基质的三维培养的骨髓间充质干细胞进行PAS染色查看糖原合成情况。黑色箭头指向糖原储存点。图中可见三维培养了14天后，对于有细胞外基质添加的细胞，糖原贮存可以被检测到。而对于无细胞外基质添加的细胞，糖原贮存无法被检测到。图1E，F：免疫荧光法检测在有（E）添加细胞外基质，或者只有胶原没有细胞外基质（F）进行三维培养的细胞中分化的肝细胞分泌的血清白蛋白。图中的血清白蛋白被白色箭头标记出来。本研究表明，添加细胞外基质对于促进骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化起着决定性的作用，且分化而得的肝细胞具有糖原储存和分泌血清白蛋白的作用。
如图2所示，为本发明中锰离子激活的骨髓间充质干细胞从门静脉注射治疗由四氯化碳诱导的大鼠急性肝衰竭效果图；腹腔注射60%四氯化碳1mL/kg大鼠体重后24小时，由门静脉注射经或不经锰离子激活的骨髓间充质干细胞。7天后将大鼠（n=10）取材检测。图2A,2B,2C,2D从上到下分别是无菌PBS溶液组，正常骨髓间充质干细胞组，以及由锰离子激活了的骨髓间充质干细胞组。图2A：使用大鼠急性肝衰竭模型注射上述三种溶液后7天的肝整体图。图中标尺表示5mm的长度。图2B，2C：肝石蜡固定后H&E染色和（2B）：Masson’s trichrome染色（2C）。表明跟只注射了无菌PBS溶液的对照组对比，注射了骨髓间充质干细胞或者由锰离子激活的骨髓间充质干细胞的肝组织中坏死部位都有减少且胶原沉积程度降低。标尺代表200μm。图2D：急性肝衰竭的大鼠中分别注射无菌PBS溶液, 骨髓间充质干细胞，由锰离子激活的骨髓间充质干细胞的肝组织进行TUNEL检测细胞凋亡情况。我们的研究表明大量的凋亡可以在注射了无菌PBS溶液的对照组中观察到，其次是骨髓间充质干细胞组，而在由锰离子激活的骨髓间充质干细胞中，几乎检测不到凋亡的细胞。图中标尺代表200μm。本研究表明，在四氯化碳诱导的肝纤维化动物实验中，锰离子可以通过减少细胞凋亡，降低坏死和胶原沉积有效提高骨髓间充质干细胞对于肝纤维化和急性肝衰竭的疗效。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。