促进骨髓干细胞分化为肝细胞的细胞外基质的制备方法与流程

文档序号:15469425发布日期:2018-09-18 19:56阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种促进骨髓干细胞分化为肝细胞的细胞外基质的制备方法,其特征在于,所述方法包括:

步骤一:准备猪肝细胞外基质;

步骤二:患者自体骨髓间充质干细胞的分离和培养;

步骤三:体外3D培养的骨髓间充质干细胞分化为肝细胞;

步骤四:肝细胞的功能评价。

2.根据权利要求1所述的促进骨髓干细胞分化为肝细胞的细胞外基质的制备方法,其特征在于,所述步骤一,具体包括:

获取完整新鲜的猪肝脏,将肝动脉和肝胆管结扎,只留下腔静脉开着作为出口,将导管插入门静脉后,立即使用蠕动泵以100mL/min的速率将20L 含有5000IU/L肝素的无菌磷酸缓冲盐PBS溶液灌注猪肝来移除肝内血液;

按照顺序在4℃逐步用150L预冷的0.01% 十二烷基硫酸钠(SDS)溶液,150L 预冷的0.1% SDS溶液,50L 预冷的1% SDS溶液和50L 1%预冷的Triton X-100灌注猪肝来使其脱细胞,最后,使用100L蒸馏水灌注清洗脱完细胞的肝脏,以此来移除残留的表面活性剂和细胞残留;

将脱细胞后的猪肝进行低压冻干处理后使用旋转刀片研磨机磨成颗粒状,将得到的粉末以50mg/L的浓度在无菌PBS溶液中重悬,并用匀浆仪混匀形成猪肝细胞外基质乳状液,使用60 Co gamma辐射(15kGy)对猪肝细胞外基质乳状液进行灭菌处理,灭菌后储存在4℃以备后用。

3.根据权利要求1所述的促进骨髓干细胞分化为肝细胞的细胞外基质的制备方法,其特征在于,所述步骤二,具体包括:

按照正颌手术或种植手术的的方法取患者无病害的颌骨骨碎片碎屑,置于α-MEM培养液中4℃保存,用无菌PBS溶液清洗三次,常温下800rpm离心5min得到细胞沉淀和骨碎片;用含有10%胎牛血清的α-MEM培养液将细胞沉淀和骨碎片混合物轻轻吹打混匀,接种到六孔培养板中;在37℃,5% CO2和饱和湿度条件下培养3-7天,直到有细胞从组织边缘爬出;细胞密度达80%时,0.25%胰酶传代消化,逐步扩增到2.5x105

4.根据权利要求1所述的促进骨髓干细胞分化为肝细胞的细胞外基质的制备方法,其特征在于,所述步骤三,具体包括:

将2.5x105患者骨髓间充质干细胞消化离心,重悬在200μL前面准备好的猪肝细胞外基质乳状液和一型胶原等密度混合液中,接种在24孔平板中,加入50μM Mn2+,在37℃,5% CO2和饱和湿度条件下培养30min使胶质凝固,加500μL含有10%胎牛血清的α-MEM到每个孔,每两天换一次培养液,培养2周后抽样进行石蜡固定检测糖原(PAS染色),血清白蛋白(免疫荧光)等肝功能指标。

5.根据权利要求1所述的促进骨髓干细胞分化为肝细胞的细胞外基质的制备方法,其特征在于,所述步骤四,具体包括:

取步骤三培养的人骨髓间充质干细胞和猪源肝细胞外基质混合物经过液氮彻底研磨,根据TRIZOL说明书提取RNA进行反转录和荧光定量PCR验证肝细胞标志基因的RNA表达,另外根据蛋白裂解说明书取步骤三培养的人骨髓间充质干细胞和猪源肝细胞外基质混合物,用无菌PBS溶液清洗三次后,加入蛋白裂解液用作Western blot检测,验证分化的肝细胞标志蛋白表达。

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