本发明属于环境微生物
技术领域：
，具体涉及一株拉乌尔菌(Raoultellasp.)以及其在芘-Cr(VI)复合污染共脱毒中的应用。
背景技术：
：重金属和多环芳烃(PAHs)是环境中典型的两类污染物。环境中PAHs的来源非常广泛，包括化学工业、交通运输和日常生活等方面的诸如煤、石油、木材及有机高分子化合物不完全燃烧等等。它们以城市生活污水、工业废弃物、大气沉降和地面径流的形式和途径进入环境。在众多PAHs污染物中，芘(Pyrene)是四环的PAHs，是有机合成的原材料，常用于染料、合成树脂、分散性染料和工程塑料等，可制杀虫剂、增塑剂等，主要存在于煤焦油沥青的蒸馏物中，一旦进入环境后即较稳定存在，其浓度和其它PAHs浓度有很好的相关性，在污染土壤、水体中的检出浓度一般较高。重金属污染的来源十分广泛，以矿石伴生为主，另外还来源于以重金属为生产原料的工业废水、废气和固体废物。其中铬(Cr)作为一种重要的重金属元素，和其它化合物一起被广泛应用于制革、电镀、颜料、制药、轻工纺织、冶炼和造纸等多种关系到国计民生的行业中，这就不可避免地产生含铬工业废水和大量的铬渣污染环境。重金属和多环芳烃(PAHs)具有环境持久性、生物积累性、长距离迁移能力和高生物毒性的特性。PAHs和重金属作为常见的二类污染物，普遍存在于土壤、水体环境中，且在环境中往往同时被发现，两者共存时可能发生交互作用，潜在毒害性增强。因此PAHs和重金属复合污染备受学者们的关注，目前对PAHs-重金属复合污染的研究主要集中在环境生态和毒理领域，探索两者共存条件下污染物的迁移规律和转化行为，但复合污染条件下生物修复过程及作用机制的研究仍较少涉及。对单一污染有效的修复方法未必适用于复合污染，因此寻求成本低廉、高效、环境友好的多环芳烃-重金属复合污染修复技术显得尤为重要。目前PAHs和重金属复合污染的修复技术一般分为生物修复、物理修复和化学修复三种方法。物理修复和化学修复处理复合污染具有操作简易、见效快的优点，但存在能耗大、成本高且容易造成二次污染等缺陷；而生物修复因其低成本、无二次污染等优点而被广泛地研究和应用。因此，本领域迫切需要开发出用于PAHs和重金属复合污染脱毒的生物修复技术。技术实现要素：本发明的目的就是提供一种用于芘-Cr(VI)复合污染共脱毒的菌株或制剂。在本发明的第一方面，提供了一种拉乌尔菌，所述拉乌尔菌为拉乌尔菌(Raoultellasp.)。在另一优选例中，所述的拉乌尔菌为用于芘-Cr(VI)复合污染共脱毒的拉乌尔菌。在另一优选例中，所述的拉乌尔菌为Raoultellasp.KX255631，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)保藏，保藏号为CGMCCNo.15302。在另一优选例中，所述拉乌尔菌来自土壤、水域、发酵池，和/或生物反应器。在另一优选例中，所述拉乌尔菌是一种芘-Cr(VI)复合污染共脱毒菌。在本发明的第二方面，提供了一种组合物或制剂，所述组合物或制剂包括：(i)安全有效量的本发明第一方面所述的拉乌尔菌；和(ii)环境净化处理中可接受的载体。在另一优选例中，所述载体为不负面影响保持拉乌尔菌(Raoultellasp.)活力且有利于所述组合物或制剂施用的物质。在另一优选例中，所述载体选自下组：无菌水。在另一优选例中，所述的组合物或制剂为液态制剂、固态制剂、半固态制剂。在另一优选例中，所述的液态制剂为悬浮液制品。在另一优选例中，所述组分(i)在组合物或制剂中的含量为每克或每毫升组合物或制剂含有1×109CFU至9×109CFU，较佳地4×109CFU至5×109CFU。在另一优选例中，所述组合物还含有有助于保持拉乌尔菌(Raoultellasp.)活力的物质(如保护剂)。在另一优选例中，所述有助于保持拉乌尔菌(Raoultellasp.)活力的物质(如保护剂)选自下组：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹叶抗氧化物、D-异抗坏血酸及其钠盐、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、磷脂、维生素C(抗坏血酸)、维生素E、或其组合。在另一优选例中，所述有助于保持拉乌尔菌(Raoultellasp.)活力的物质(如保护剂)的重量比(wt％)为0.1-2％，较佳地，0.5-1.5％，更佳地，0.5-1.0％，以所述组合物的总重计。在另一优选例中，以组合物1g计，所述有助于保持拉乌尔菌(Raoultellasp.)活力的物质(如保护剂)的含量为1mg-20mg，较佳地，5mg-15mg，更佳地，5mg-10mg。在另一优选例中，所述环境包括：土壤、水域。在另一优选例中，所述土壤所处的土地包括：耕地、园地、林地、草地，其它农用地、建设用地。在另一优选例中，所述土壤包括：砂质土、粘质土或壤土。在另一优选例中，所述土壤包括：砖红壤、燥红土、赤红壤、红壤和黄壤；黄棕壤、棕壤、暗棕壤、漂灰土；褐土、黑垆土、灰褐土；灰黑土、黑土、白浆土、黑钙土；棕钙土、灰钙土；灰漠土、灰棕漠土、棕漠土、龟裂土；潮土、灌淤土、绿洲土；草甸土、沼泽土；水稻土；盐土、碱土；紫色土、黄绵土、风沙土、黑毡土、草毡土、巴嘎土、莎嘎土、高山漠土。在另一优选例中，所述水域包括：江河、湖泊、运河、渠道、水库、水塘等。在本发明的第三方面，提供了一种农用制剂，所述农用制剂包括：(i)安全有效量的本发明第一方面所述的拉乌尔菌；和(ii)农业上可接受的载体。在另一优选例中，组分(i)在农用制剂中的含量为每克或每毫升制剂含有1×109CFU至9×109CFU，较佳地4×109CFU至5×109CFU。在另一优选例中，所述的农用活性成分选自下组：杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物激活剂、增效剂、植物生长调节剂、杀螨剂。在另一优选例中，所述农用制剂还包括表面活性剂(如阳离子型、阴离子型、两性、或非离子型表面活性剂)。在另一优选例中，所述农用制剂的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。在另一优选例中，所述农用制剂还包括额外的抗旱剂(如抗旱种衣剂、抗旱保水剂、或抗旱喷洒剂)或其他农用活性成分。在本发明的第四方面，提供了一种本发明第一方面所述拉乌尔菌的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于芘-Cr(VI)复合污染共脱毒。在另一优选例中，所述脱毒的适宜温度为15-45℃，较好地20-35℃，更好地25-30℃。在另一优选例中，所述芘的浓度≤100ml/L，所述Cr(VI)的浓度≤40ml/L。在另一优选例中，所述脱毒环境的pH为6.0至9.0，较好地7.0至8.0，更好地为7.5。在本发明的第五方面，提供了一种本发明第二方面所述组合物或制剂的制法，包括步骤：(i)将本发明第一方面所述拉乌尔菌与环境净化处理中可接受的载体基质混合，从而形成本发明第二方面所述的组合物或制剂。在另一优选例中，在步骤(i)之前，将所述拉乌尔菌进行扩增培养，并将其从培养物中分离。在另一优选例中，在步骤(i)之前，还包括将上一步骤获得的所述培养产物或所述拉乌尔菌菌体与有助于保持拉乌尔菌活力的物质(如保护剂)混合的步骤。在另一优选例中，所述有助于保持拉乌尔菌活力的物质(如保护剂)选自下组：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹叶抗氧化物、D-异抗坏血酸及其钠盐、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、磷脂、维生素C(抗坏血酸)、维生素E、或其组合。在另一优选例中，所述有助于保持拉乌尔菌(Raoultellasp.)活力的物质(如保护剂)的重量比(wt％)为0.1-2％，较佳地，0.5-1.5％，更佳地，0.5-1.0％，以所述组合物的总重计。在另一优选例中，以组合物1g计，所述有助于保持拉乌尔菌(Raoultellasp.)活力的物质(如保护剂)的含量为1mg-20mg，较佳地，5mg-15mg，更佳地，5mg-10mg。在本发明的第六方面，提供了一种本发明第三方面所述农用制剂的制法，包括步骤：(i)将本发明第一方面所述拉乌尔菌与农业中可接受的载体基质混合，从而形成本发明第三方面所述的农用制剂。在另一优选例中，所述制法还包括与有助于保持拉乌尔菌活力的物质(如保护剂)混合的步骤。在另一优选例中，所述有助于保持拉乌尔菌活力的物质(如保护剂)选自下组：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹叶抗氧化物、D-异抗坏血酸及其钠盐、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、磷脂、维生素C(抗坏血酸)、维生素E、或其组合。在另一优选例中，所述有助于保持拉乌尔菌(Raoultellasp.)活力的物质(如保护剂)的重量比(wt％)为0.1-2％，较佳地，0.5-1.5％，更佳地，0.5-1.0％，以所述组合物的总重计。在另一优选例中，以组合物1g计，所述有助于保持拉乌尔菌(Raoultellasp.)活力的物质(如保护剂)的含量为1mg-20mg，较佳地，5mg-15mg，更佳地，5mg-10mg。在本发明的第七方面，提供了一种环境中芘-Cr(VI)复合污染共脱毒的方法，所述方法包括向待处理的环境施用有效量的本发明第一方面所述的拉乌尔菌或本发明第二方面所述的组合物或制剂或本发明第三方面所述的农用制剂。在另一优选例中，所述的施用选自下组：喷洒、浇灌、滴灌、喷雾、注射或本领域的普通技术人员已知的其他方法。在另一优选例中，所述的施用可一次性施用、重复施用或连续施用。在另一优选例中，所述的施用剂量为每克或每毫升制剂含有1×109CFU至9×109CFU，较佳地4×109CFU至5×109CFU。在另一优选例中，所述环境包括：土壤、水域。在另一优选例中，所述土壤所处的土地包括：耕地、园地、林地、草地，其它农用地、建设用地。在另一优选例中，所述土壤包括：砂质土、粘质土或壤土。在另一优选例中，所述土壤包括：砖红壤、燥红土、赤红壤、红壤和黄壤；黄棕壤、棕壤、暗棕壤、漂灰土；褐土、黑垆土、灰褐土；灰黑土、黑土、白浆土、黑钙土；棕钙土、灰钙土；灰漠土、灰棕漠土、棕漠土、龟裂土；潮土、灌淤土、绿洲土；草甸土、沼泽土；水稻土；盐土、碱土；紫色土、黄绵土、风沙土、黑毡土、草毡土、巴嘎土、莎嘎土、高山漠土。在另一优选例中，所述水域包括：江河、湖泊、运河、渠道、水库、水塘等。在另一优选例中，所述脱毒的适宜温度为15-45℃，较好地20-35℃，更好地25-30℃。在另一优选例中，所述脱毒环境的pH为6.0至9.0，较好地7.0至8.0，更好地为7.5。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。本发明的优点包括：1、本发明提供了一株国内首次报道的具有芘-Cr(Ⅵ)共脱毒能力的Raoultellasp.KX255631，为利用微生物技术处理环境中的芘-Cr(Ⅵ)复合污染增添了新的优良的微生物种质资源。2、本发明提供的芘-Cr(Ⅵ)共脱毒菌Raoultellasp.KX255631去除芘-Cr(Ⅵ)的适宜pH和温度一致，最适宜的pH和温度分别为7.0至8.0和25至30℃，且在pH6.5和温度20℃下，对芘降解率和Cr(Ⅵ)还原率仍均超过70％，表明Raoultellasp.KX255631去除芘-Cr(Ⅵ)有很广的环境适应力。3、本发明提供的芘-Cr(Ⅵ)共脱毒菌Raoultellasp.KX255631能耐受较高的芘-Cr(Ⅵ)复合污染(Cr(Ⅵ)≤40mg/L、芘≤100mg/L)。4、本发明提供的芘-Cr(Ⅵ)共脱毒菌Raoultellasp.KX255631能去除人工加入土壤的芘-Cr(Ⅵ)复合污染物，表明其具有很大的实际应用潜力。附图说明图1是Raoultellasp.KX255631的形态。图中(1)为在LB培养基上的菌落形态，(2)为革兰氏染色图。图2为Raoultellasp.KX255631基因组DNA和PCR产物16srDNA基因琼脂糖电泳图。图中泳道1和2为基因组DNA，3和4为16SrDNA基因，M为DNAMarker。图3是采用MEGA7.0软件，邻位连接法显示菌株KX255631与相关种的16SrDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于70％数值。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外地发现，一种特定的菌株拉乌尔菌(Raoultellasp.)KX255631具有显著的芘-Cr(VI)复合污染共脱毒作用。实验证明，该菌株可耐受环境中芘≦100mg/L、Cr(VI)≦40mg/L的高浓度的芘-Cr(VI)复合污染，且对芘降解率和Cr(VI)还原率均超过90％；其去除环境中芘-Cr(VI)的适宜pH为6.5～8.0、适宜温度为20～30℃，有较广的pH和温度适应范围。在此基础上完成了本发明。术语如本文所用，术语“本发明菌株”、“本发明拉乌尔菌KX255631”、“拉乌尔菌KX255631”、“Raoultellasp.KX255631”可互换使用，指保藏号为CGMCCNo.15302的菌株及其传代菌株或衍生菌株。如本文所用，“芘-Cr(VI)复合污染共脱毒”是指同时去除环境中存在的对生无体有毒的物质芘和Cr(VI)。拉乌尔菌及其应用在本发明中，提供了一种经筛选的、可显著实现芘-Cr(VI)复合污染共脱毒的菌株。本发明的菌株属于拉乌尔菌，命名为KX255631。具体地，所述菌株为采用常规分离方法从采自浙江省温州市瓯江口龙湾码头附近的油罐周边的土壤样品中分离获得，经16SrDNA序列测定并将测序结果通过GenBankBlast进行比对分析，属于拉乌尔菌属(Raoultella)，与Raoultellaplanticola的同源性超过99％，编为Raoultellasp.KX255631。本发明所述拉乌尔菌菌落为圆形，表面凸起、呈乳白色，粘稠，不透明，有光泽，光滑，边缘整齐；菌体杆状，革兰氏阴性。图1为菌株KX255631的形态，其中图1(1)为在LB培养基培养后的菌落形态，图1(2)为革兰氏染色图。以菌株KX255631的基因组DNA为模板扩增16SrDNA，图2为菌株KX255631基因组DNA和PCR产物16srDNA基因的琼脂糖电泳图，16srDNA基因的测序委托北京诺禾致源公司完成，测序结果通过GenBankBlast进行比对分析。菌株KX255631的16SrDNA由1437bp碱基组成，如SEQIDNO.3所示；通过GenBankBlast进行比对分析，与GenBank中的Raoultella属的16SrDNA序列具有很高同源性，与Raoultellaplanticola的同源性超过99％，编号为Raoultellasp.KX255631。采用MEGA7.0软件，Neighbor-Joining法显示菌株KX255631与相关种的16SrDNA系统发育树见图3。芘-Cr(VI)复合污染重金属和多环芳烃(PAHs)是环境中典型的两类污染物。环境中PAHs的来源非常广泛，包括化学工业、交通运输和日常生活等方面的诸如煤、石油、木材及有机高分子化合物不完全燃烧等等。它们以城市生活污水、工业废弃物、大气沉降和地面径流的形式和途径进入环境。在众多PAHs污染物中，芘(Pyrene)是四环的PAHs，是有机合成的原材料，常用于染料、合成树脂、分散性染料和工程塑料等，可制杀虫剂、增塑剂等，主要存在于煤焦油沥青的蒸馏物中，一旦进入环境后即较稳定存在，其浓度和其它PAHs浓度有很好的相关性，在污染土壤、水体中的检出浓度一般较高，因此很多研究者选择芘作为代表物来研究PAHs的生物降解特性。重金属污染的来源十分广泛，以矿石伴生为主，另外还来源于以重金属为生产原料的工业废水、废气和固体废物。其中铬(Cr)作为一种重要的重金属元素，和其它化合物一起被广泛应用于制革、电镀、颜料、制药、轻工纺织、冶炼和造纸等多种关系到国计民生的行业中，这就不可避免地产生含铬工业废水和大量的铬渣污染环境。芘-Cr(VI)复合污染具有环境持久性、生物积累性、长距离迁移能力和高生物毒性的特性。农用制剂可将本发明的活性物质(拉乌尔菌)以常规的方法制备成农用制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、用活性物质浸渍的天然的和合成的材料、在多聚物中的微胶囊、用于种子的包衣剂。这些制剂可用已知的方法生产，例如，将活性化合物与扩充剂混合，这些扩充剂就是液体的或液化气的或固体的稀释剂或载体，并可任意选用表面活性剂即乳化剂和/或分散剂和/或泡沫形成剂。例如在用水作扩充剂时，有机溶剂也可用作助剂。用液体溶剂作稀释剂或载体时，基本上是合适的，如：芳香烃类，例如二甲苯，甲苯或烷基萘；氯化的芳香或氯化的脂肪烃类，例如氯苯，氯乙烯或二氯甲烷；脂肪烃类，例如环己烷或石蜡，例如矿物油馏分；醇类，例如乙醇或乙二醇以及它们的醚和脂类；酮类，例如丙酮，甲乙酮，甲基异丁基酮或环已酮；或不常用的极性溶剂，例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜，以及水。就液化气的稀释剂或载体时，指的是在常温常压下将成为气体的液体，例如气溶胶推进剂，如卤化的烃类以及丁烷，丙烷，氮气和二氧化碳。固体载体可用研磨的天然矿物质，例如高岭土，粘土，滑石，石英，活性白土，蒙脱土，或硅藻土，和研磨合成的矿物质，例如高度分散的硅酸，氧化铝和硅酸盐。供颗粒用的固体载体是碾碎的和分级的天然锆石，例如方解石，大理石，浮石，海泡石和白云石，以及无机和有机粗粉合成的颗粒，和有机材料例如锯木屑，椰子壳，玉米棒子和烟草梗的颗粒等。非离子的和阴离子的乳化列可用作乳化剂和/或泡沫形成剂。例如聚氧乙烯-脂肪酸酯类，聚氧乙烯-脂肪醇醚类，例如烷芳基聚乙二醇醚类，烷基磺酸酯类，烷基硫酸酯类，芳基磺酸酯类以及白蛋白水解产物。分散剂包括，例如木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。在制剂中可以用粘合剂，例如羧甲基纤维素和以粉末，颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物，例如阿拉伯胶，聚乙烯基醇和聚乙烯醋酸酯。可以用着色剂例如无机染料，如氧化铁，氧化钻和普鲁士蓝；有机染料，如有机染料，如偶氮染料或金属钛菁染料；和用痕量营养剂，如铁，猛，硼，铜，钴，铝和锌的盐等。在本发明中，所述“农用制剂”通常是农用植物生长调节剂，其含有拉乌尔菌的活性成分；以及农业上可接受的载体。如本文所用，所述“农业上可接受的载体”是用于将本发明的拉乌尔菌传送给植物的农药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的农业上可接受的载体选自下组：水、缓冲液、DMSO、表面活性剂如Tween-20、或其组合。任何本领域技术人员已知的农业上可接受的载体均可用于本发明中。本发明的农用制剂可与其他促生剂制成一种混合物存在于它们的商品制剂中或从这些制剂制备的使用剂型中，这些其他的促生剂包括(并不限于)：促生种衣剂、促生保水剂、或促生喷洒剂等。此外，本发明的农用制剂也可与增效剂制成一种混合物存在于它们的商品制剂中或从这些制剂制备的使用剂型中，这些增效剂是提高活性菌作用的化合物，由于活性菌本身有活性，也可不必加增效剂。本发明所述的农用制剂的剂型可以是多种多样的，只要能够使活性成分有效地到达植物体内的剂型都是可以的，从易于制备和施用的立场看，优选的农用制剂包括喷雾剂、溶液制剂或包衣剂。在一优选方式中，本发明的农用制剂还含有有助于保持拉乌尔菌(Raoultellasp.)活力的物质(如保护剂)，选自下组：半胱氨酸、谷胱甘肽、丁基羟基茴香醚、二丁基甲基甲苯、生育酚、竹叶抗氧化物、D-异抗坏血酸及其钠盐、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、磷脂、维生素C(抗坏血酸)、维生素E、或其组合。本发明所述的农用制剂通常含有1×103个CFU/g至9×107个CFU/g，较佳地4×104个CFU/g至5×105个CFU/g的本发明菌株。商品制剂或使用剂型中的本发明菌株的浓度可在广阔的范围内变动。此外，在本发明的农用制剂中还可以含有其他农用化合物(包括有机肥)或农用菌株。其中，代表性的农用化合物包括(但并不限于)N、P、K等元素的化肥化合物、杀虫剂、除草剂等，代表性的菌株包括其他有助于提高植物生长性能和/或抗逆性的菌株，例如固氮菌。菌株保藏本发明的Raoultellasp.KX255631，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCCNO.15302，保藏起始日期为2018年01月25日。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明提供一株具有芘-Cr(Ⅵ)复合污染共脱毒能力的拉乌尔菌，其特点为该菌株为采用初筛、复筛等过程从采自浙江省温州市瓯江口龙湾码头附近的油罐周边的土壤样品中分离获得，经16SrDNA序列测定并将测序结果通过GenBankBlast进行比对分析，属于Raoultella属，与Raoultellaplanticola的同源性超过99％，编为Raoultellasp.KX255631。实施例1：芘-Cr(VI)共脱毒菌的分离和鉴定(1)初筛从浙江省温州市瓯江口龙湾码头附近的油罐周边土壤和煤堆周边土壤采集样品，土壤样品采集深度为0～10厘米，每个点采样量大于100g。每份样品均称取10g置装有90ml无菌水的三角烧瓶内，振荡摇匀后取5ml接种于装有50ml无机盐培养基的三角瓶内，在30℃、150r/min下富集培养。无机盐培养基基本组成：(NH4)2SO41g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCL20.2g、NaH2PO40.5g、K2HPO40.5g、NaCL0.2g、Fe2(SO4)3·7H2O0.01g、蒸馏水1000ml，pH7.5；基本培养基中加入Cr(Ⅵ)(K2Cr2O7)10mg/L、芘(正己烷溶液)50mg/L。待长出菌体后(培养一周左右)转接新的无机盐培养基在同样条件下培养，且Cr(Ⅵ)和芘浓度依次递增，终浓度分别为60mg/L和300mg/L。取50μL富集培养液涂布于无机盐固体培养基(基本组成加重铬酸钾溶液至Cr(VI)(K2Cr2O7)30mg/L、琼脂18g/L，倒平板凝固后取30μL芘-正己烷溶液涂布于培养基表面)在30℃下培养，长出的菌落即为以芘为唯一碳源的耐Cr(VI)菌。挑取平板上颜色、形态不同的菌落划线接种于无机盐固体培养基上(配方同前)在相同条件下培养进行纯化，直至经镜检为纯培养物为止。然后转接LB斜面培养后在4℃下保藏。从采自油罐周边土壤样品中获得15株纯培养物，从采自煤堆周边土壤样品中获得10株纯培养物。(2)复筛将初筛获得的25株纯培养物分别接种于装有50ml无机盐培养基的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min下振荡培养7天。无机盐培养基的基本组成同初筛，其中一组基本培养基中加Cr(Ⅵ)30mg/L、芘50mg/L，另一组基本培养基中加Cr(Ⅵ)30mg/L、芘50mg/L、葡萄糖5g/L，分别测定培养起止无机盐培养基中的Cr(Ⅵ)和芘浓度，计算Cr(Ⅵ)还原率和芘降解率。Cr(Ⅵ)采用二苯碳酰二肼分光光度法测定(张景明，中国环境监测，2005，21(2):41-43)，芘采用高效液相色谱法测定(邓军，等，化工学报，2010，61(3):747-753)。Cr(Ⅵ)还原率/％＝(培养前培养基Cr(Ⅵ)浓度-培养后培养基Cr(Ⅵ)浓度)/培养前培养基Cr(Ⅵ)浓度×100％，芘降解率/％＝(培养前培养基芘浓度-培养后培养基芘浓度)/培养前培养基芘浓度×100％。经复筛，从25株初筛获得的纯培养物中获得1株优良的芘-Cr(Ⅵ)共脱毒菌，它从采自浙江省温州市瓯江口龙湾码头附近的油罐周边的1#土壤样品中分离获得，编为KX255631，其16srDNA序列如SEQIDNO:3所示。其对基本培养基中加Cr(Ⅵ)30m/L、芘50mg/L的Cr(Ⅵ)还原率和芘降解率分别为21.97±2.09％和56.78±3.21％，对基本培养基中加Cr(Ⅵ)30mg/L、芘50mg/L、葡萄糖5g/L的Cr(Ⅵ)还原率和芘降解率分别为100±9.64％和87.51±6.07％。(3)稳定性试验将复筛获得的菌株KX255631在LB斜面上连续转接10代，将每代培养的菌株分别接种于装有50ml无机盐培养基的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min下振荡培养7天。无机盐培养基的基本组成同初筛，其中一组基本培养基中加Cr(Ⅵ)30mg/L、芘50mg/L，另一组基本培养基中加Cr(Ⅵ)30mg/L、芘50mg/L、葡萄糖5g/L，分别测定培养起止无机盐培养基中的Cr(Ⅵ)和芘浓度，计算Cr(Ⅵ)还原率和芘降解率。第10代的菌株KX255631培养物对基本培养基中加Cr(Ⅵ)30mg/L、芘50mg/L的Cr(Ⅵ)还原率和芘降解率分别为20.21±1.85％和55.26±4.31％，对基本培养基中加Cr(Ⅵ)30mgL、芘50mg/L、葡萄糖5g/L的Cr(Ⅵ)还原率和芘降解率分别为98.57±9.07％和85.39±7.14％，表明菌株KX255631是稳定的。(4)鉴定图1为菌株KX255631的形态，其中图1(1)为在LB培养基培养后的菌落形态，图1(2)为革兰氏染色图。菌株KX255631菌落为圆形，表面凸起、呈乳白色，粘稠，不透明，有光泽，光滑，边缘整齐；菌体杆状，革兰氏阴性。以菌株KX255631的基因组DNA为模板扩增16SrDNA，引物序列为：正向引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′(SEQIDNO:1)，反向引物5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′(SEQIDNO:2)，图2为菌株KX255631基因组DNA和PCR产物16srDNA基因的琼脂糖电泳图，16srDNA基因的测序委托北京诺禾致源公司完成，测序结果通过GenBankBlast进行比对分析。菌株KX255631的16SrDNA由1437bp碱基组成，如SEQIDNO.1所示；通过GenBankBlast进行比对分析，与GenBank中的Raoultella属的16SrDNA序列具有很高同源性，与Raoultellaplanticola的同源性超过99％，编号为Raoultellasp.KX255631。采用MEGA7.0软件，Neighbor-Joining法显示菌株KX255631与相关种的16SrDNA系统发育树见图3。Raoultellasp.KX255631已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏中心登记入册编号为CGMCCNO.15302，保藏起始日期为2018年01月25日。实施例2：Raoultellasp.KX255631对芘-Cr(Ⅵ)共脱毒的条件菌株Raoultellasp.KX255631(1.5ml冷冻管融化后菌液)接种于装有50mlLB培养基的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min下培养24h进行菌种活化；然后按百分之五的体积分数转接于装有100mlLB培养基的500ml锥形瓶中，在30℃、150r/min下培养24h，8000r/min下离心10min后用无菌水洗涤菌体两次，然后用无菌水调配成OD600＝0.999-1.000的菌悬液；按百分之十的体积分数接入装有50ml无机盐培养基的250ml锥形瓶中，在一定温度和转速下振荡培养一周，分别测定培养起止无机盐培养基(基本组成同实施例一(1))中的Cr(Ⅵ)和芘浓度，计算Cr(Ⅵ)还原率和芘降解率(Cr(Ⅵ)还原率和芘降解率测定同实施例一(2))。(1)芘浓度对Raoultellasp.KX255631还原Cr(VI)能力的影响无机盐培养基内加Cr(VI)40mg/L、葡萄糖5g/L、芘浓度分别为0、50、100、150、200和250mg/L，接入菌悬液后在30℃、150r/min下培养，结果如表1。由表1看出，当芘浓度≤100mg/L时，促进Raoultellasp.KX255631对Cr(VI)的还原，芘浓度＞100mg/L后逐渐抑制Raoultellasp.KX255631对Cr(VI)的还原。表1芘浓度对Raoultellasp.KX255631生长和还原Cr(VI)能力的影响(Cr(VI)40mg/L)(2)Cr(VI)浓度对Raoultellasp.KX255631降解芘能力的影响无机盐培养基内加芘50mg/L、葡萄糖5g/L、Cr(VI)浓度分别为10、20、40、60、80、100和120mg/L，接入菌悬液后在30℃、150r/min下培养，结果如表2。由表2可知，当Cr(VI)浓度≦40mg/L时，其对菌体生长和芘降解没有显著影响；而Cr(VI)浓度＞40mg/L时，随Cr(VI)浓度逐渐增加菌体生长被逐渐抑制，芘降解也随之逐渐降低，至Cr(VI)浓度为120mg/L时菌体生长几乎被完全抑制。表2Cr(VI)浓度对Raoultellasp.KX255631生长和降解芘能力的影响(芘浓度50mg/L)(3)pH对Raoultellasp.KX255631降解芘和还原Cr(VI)能力的影响无机盐培养基内加芘50mg/L、葡萄糖5g/L、Cr(VI)40mg/L，培养基pH用1mol/LHCL和1mol/LNaOH分别调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，接入菌悬液后在30℃、150r/min下培养，结果如表3。由表3看出，Raoultellasp.KX255631降解芘和还原Cr(VI)的适宜pH为7.0～8.0，即中性偏碱。表3pH对Raoultellasp.KX255631生长以及Cr(VI)还原和芘降解能力的影响(4)温度对Raoultellasp.KX255631降解芘和还原Cr(VI)能力的影响无机盐培养基内加芘50mg/L、葡萄糖5g/L、Cr(VI)40mg/L，培养基pH7.5，接入菌悬液后分别在15、20、25、30、35、40和45℃下培养，转速均为150r/min，结果如表4。由表4看出，Raoultellasp.KX255631降解芘和还原Cr(VI)的适宜温度为25～30℃。表4温度对Raoultellasp.KX255631生长以及Cr(VI)还原和芘降解能力的影响实施例3：Raoultellasp.KX255631修复土壤芘-Cr(VI)复合污染试验采用高等植物毒理试验方法研究Raoultellasp.KX255631对人为芘-Cr(VI)复合污染的土壤的芘-Cr(VI)共脱毒效果。具体方法为：从无芘和Cr(VI)污染的温州大学苗圃采集0～20cm深度的土壤，去除石子和植物残体并过50目筛后自然风干混匀，测定土壤的理化性质(表5)；将自然风干的土壤在121℃下灭菌20min后，称取50g于灭菌培养皿内，共27皿，分为三组：A组加无菌去离子水，B组加芘50mg/Kg土壤、Cr(VI))40mg/Kg土壤和无菌去离子水，C组加芘50mg/Kg土壤、Cr(VI))40mg/Kg土壤、Raoultellasp.KX255631菌悬液和无菌去离子水，其中B组和C组共18皿的芘和Cr(VI)的添加方法为先加入芘-正己烷溶剂，待正己烷挥发完后再加入含Cr(VI)的无菌水混匀；每份土样加水总量均以60％的土壤最大持水量计；其中每组的6皿用于小白菜和萝卜种子的试验，另三皿用于测定起始土壤中的Cr(VI)、芘含量。菌株Raoultellasp.KX255631(1.5ml冷冻管融化后菌液)接种于装有50mlLB培养基的250ml锥形瓶中，在25℃、150r/min下培养24h进行菌种活化；然后按百分之五的体积分数转接于装有100mlLB培养基的500ml锥形瓶中，在25℃、150r/min下培养24h，8000r/min下离心10min后用无菌水洗涤菌体两次，然后用无菌水调配成OD600＝0.999-1.000的菌悬液，按百分之十的体积重量比加入C组的6皿中混匀。分别挑选颗粒饱满大小相近的小白菜种子和胡萝卜种子，先用10％的双氧水溶液浸泡15min消毒，再用无菌去离子水冲洗干净；然后置于A、B、C三组土壤试样的表面，种子间距尽量保持一致，其中小白菜种子每皿15粒、胡萝卜种子每皿10粒，每组小白菜种子和胡萝卜种子均3皿；然后置25℃恒温箱内培养，每天加适量无菌水以补充蒸发的水分。依《农作物种子检验规程—发芽试验(GB/T3543.4-1995)》，每天记录种子的萌发数量，7天后计算发芽率、发芽指数和发芽速度指数(表6)；10天后终止试验，从每皿中随机挑选10株幼苗测量茎长、茎鲜重、根长(从胚轴与根之间的过度点开始)和根鲜重,求其平均值(表7)；计算其活力指数、茎长抑制率和根长抑制率(表8)；同时测定试验结束时土壤中的Cr(VI)、芘含量(表9)。其中，发芽率/％＝全部发芽种子粒数/供试种子总粒数×100％，发芽指数＝ΣGt/Dt(Gt为t时间内的发芽数，Dt为相应的发芽天数)，种子发芽速度指数＝发芽率×发芽指数，活力指数＝发芽指数×苗长度，茎长抑制率/％＝(对照样品的茎长-各处理样品茎长)/对照样品茎长×100％，根长抑制率/％＝(对照样品的根长-各处理样品根长)/对照样品根长×100％。土壤含水量采用干重法测定：称取过20目筛的风干土样2.00g于已知质量的铝盒中，在105℃下烘至恒重(约8小时)，取出置干燥器中冷却20min后立即称重。土壤pH值用pH计测定：称取过20目筛的风干泥样10.00g于50ml烧杯中，加入25ml无二氧化碳水，搅动1～2min，静置30min后用pH计测定。土壤总氮含量采用凯氏定氮法测定：称取过60目筛的风干泥样1.00g，加1.80g催化剂(K2SO4:CuSO4·5H2O＝10:1)与5ml浓硫酸消解2h后定氮、用标定的盐酸滴定铵。土壤总磷的测定采用钼锑抗分光光度法：称取过100目筛的烘干泥样1.00g于50ml干燥的凯氏瓶中，加入浓硫酸8ml、高氯酸10滴消解，冷却后定容至100ml，用干燥漏斗和无磷滤纸将定容后溶液滤至干燥的100ml锥形瓶中。取5ml于50ml容量瓶中，加30ml蒸馏水、2滴二硝基酚指示剂混匀，用1mol/L氢氧化钠调至溶液刚好呈微黄色后，加入锑钼抗显色剂5ml，用蒸馏水定容至50ml静置30min后于700nm下测定吸光度，从标准曲线求得磷含量。土壤有机质测定采用高温外热重铬酸钾氧化容量法：称取0.20g左右的风干泥样于干燥的硬质试管中，加入0.1g硫酸银、5ml浓度为0.8mol/L的重铬酸钾溶液、5ml浓硫酸，管口盖上弯颈小漏斗；在预热到220℃的油浴锅内加热，当弯颈小漏斗下端第一滴冷凝液滴下开始计时，消煮5min后冷却，用水冲洗弯颈小漏斗内壁及下端外壁，洗涤液收集于锥形瓶中，加入3滴邻菲罗啉指示剂，用硫酸亚铁滴定剩余重铬酸钾至溶液颜色为棕色，根据公式计算有机质的含量(鲁如坤.土壤学报，1999，36(2):287-288)。土壤总Cr(VI)的测定方法:称取2.50g土壤样品于250mL蒸馏瓶中，加入50mL消解液(20.00gNaOH和30.00gNa2CO3溶于1L蒸馏水中)、0.4gMgCL2和0.5mL磷酸缓冲液；先在室温下将样品搅拌5min，然后升至90oC～95oC持续搅拌1h；待溶液冷却至室温，过0.22μm微孔滤膜去除土样，滤液用浓硝酸调pH至7.5后再次过滤膜，然后将滤液定容至100mL，用二苯碳酰二肼分光光度法测定溶液中Cr(VI)(徐非，等.环境监测管理与技术，2008，20(5):42-43)。土壤芘含量测定方法：准确称量过20目筛的风干土样2.00g于50ml离心管中，加入2g无水硫酸钠、10mL丙酮和二氯甲烷(1:1,v/v)的混合液，在35kHz、300W下超声提取30min，3000r/min下离心20min后，将上清液转移至鸡心瓶中，重复提取两次，合并提取液；提取液在40oC水浴中旋转蒸发浓缩后，用2ml环己烷溶解，过硅胶柱(4g活化过的硅胶均匀装入层析柱，并用正己烷润洗)净化，5mL正己烷和二氯甲烷混合液(1:1,v/v)为淋洗液；经净化后的提取液再次旋转蒸发至干燥，用1.5ml二氯甲烷溶解至2ml样品瓶，待二氯甲烷完全挥发后，用1mL甲醇定容，用高效液相色谱法测定；测定条件：色谱柱为4.6mm×150mm烷基C18反相柱、流动相为甲醇:水混合液(9:10,v/v)、流速l.0mL/min、柱温30℃、进样量1μL、荧光检测波长324nm。(张新颖.上海大学硕士论文，2012)由表9看出，无论用于小白菜还是胡萝卜种子发芽的A组土壤均未检测到Cr(VI)和芘；用于小白菜和胡萝卜种子发芽的B组土壤，Cr(VI)分别下降41.70％和45.37％，芘分别下降46.67％和49.80％，表明土壤本身对Cr(VI)和芘具有一定的去除能力；用于小白菜和胡萝卜种子发芽的C组土壤，Cr(VI)分别下降89.70％和89.94％，芘分别下降83.47％和93.92％，与B组比较，Cr(VI)下降率分别提高48.00％和40.14％，芘下降率分别提高36.80％和44.12％，表明人工加入C组土壤的芘-Cr(VI)共脱毒菌Raoultellasp.KX255631能适应土壤环境生长而去除土壤中的Cr(VI)和芘。结合表6、表7、表8的毒理实验结果看出，B组均低于A和C组，这与土壤中Cr(VI)和芘的测定结果基本相关。表5土壤理化性质含水量/％pH总氮/％总磷/％有机质/％13.436.18-6.860.20±0.016.63±0.263.00±0.01表6种子发芽率、发芽指数和发芽速度指数表7幼苗茎长、茎鲜重、根长和根鲜重表8种子活力指数、茎长抑制率和根长抑制率表9土壤中Cr(VI)和芘的含量在本发明中，在实施例2和3中加入保护剂(如谷胱甘肽)，也能得到芘-Cr(VI)复合污染共脱毒的效果，其与实施例中所列效果无明显差异。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>温州大学<120>一株拉乌尔菌及在芘-Cr(VI)复合污染共脱毒中的应用<130>P2018-0573<160>3<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列(artificialsequence)<400>1agagtttgatcctggctcagaacgaacgct30<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tacggctaccttgttacgacttcacccc28<210>3<211>1437<212>DNA<213>拉乌尔菌(Raoultellasp.)<400>3ttggcggcaggctaaccatgcagtcgagcggtagcacagagagcttgctctcgggtgacg60agcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactgga120aacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcatg180ccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatggctcacctaggcgac240gatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagact300cctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgc360cgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcgaggaggaaggcgttaa420ggttaataaccttggcgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgcca480gcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcac540gcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatttga600aactggcaagcttgagtcttgtagagggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgc660gtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctca720ggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagatacctggtagtccacgctgtaaacgat780gtcgacttggaggttgttcccttgaggagtggcttccggagctaacgcgttaagtcgacc840gcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagc900ggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatcca960gagaacttagcagagatgctttggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggct1020gtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcc1080tttgttgccagcggtccggtcgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaa1140ggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaat1200ggcatatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtag1260tccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatca1320gaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagt1380gggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgctaccactttttatta1437当前第1页1 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