一种合成2,5-呋喃二甲酸的土生拉乌尔菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种合成2,5-呋喃二甲酸的土生拉乌尔菌及其应用，属于微生物【技术领域】。本发明公开的Raoultella terrigena BF60菌株于2014年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 2014391。所述Raoultella terrigena是从生产5-羟甲基糠醛的工厂附近的土壤中筛选得到的。应用该菌进行全细胞转化生产2,5-呋喃二甲酸的产量可达7.95g/L，为进一步利用土生拉乌尔菌生产2,5-呋喃二甲酸奠定了基础。本发明提供的土生拉乌尔菌生产2,5-呋喃二甲酸的方法简单，具有很好的应用前景。
CCTCC No:M2014391
20140826
【专利说明】-种合成2, 5-映喃二甲酸的土生拉乌尔菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种合成2, 5-呋喃二甲酸的土生拉乌尔菌及其应用，属于微生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 2,5-呋喃二甲酸（2,5_卩11四11(^〇3也(《711。3(^(1，卩00六）是重要的化工原料和有 机合成中间体，可用来制备各种脂类呋喃或烷基取代衍生物，并且被美国能源部列为最具 有应用前景的12种平台化合物之一。此外，2, 5-呋喃二甲酸可以取代对苯二甲酸用来制造 聚酯类的塑胶材料，具有广阔的应用前景。
[0003] 目前，制备2, 5-呋喃二甲酸的方法有化学合成法和生物转化法，化学合成法一般 采用贵金属作为催化剂，需要高温、高压和有机溶剂等条件，成本较高且环境污染严重。生 物合成法一般采用以5-羟甲基糠醛为底物，转化生成2, 5-呋喃二甲酸。与化学合成法相 t匕，生物转化法条件更温和、低毒和环保。但是由于5-羟甲基糠醛对细胞有毒害作用，只有 极少数的微生物可以利用5-羟甲基糠醛生产2, 5-呋喃二甲酸，因此虽然生物转化法有较 多优点，但是目前关于采用生物转化法来生产2, 5-呋喃二甲酸的报道却较少。现有报道了 来自海洋真菌Caldariomyces fumago所产的氯过氧化物酶可以以5-轻甲基糠醒为底物生 成60-75%的2, 5-呋喃二甲酸。也有研究者在恶臭假单胞菌Pseudomonas putidaS12中异 源表达了来自贪铜菌属的Cupriavidus basilensis HMF14的5-轻甲基糠醒氧化酶，可以 利用5-羟甲基糠醛生成2, 5-呋喃二甲酸。目前，利用土生拉乌尔菌来生产2, 5-呋喃二甲 酸还未见报道。
[0004] 2, 5-呋喃二甲酸可以通过5-羟甲基糠醛氧化得到，而5-羟甲基糠醛可以由葡萄 糖或果糖脱水生成。该合成途径的研究可以将丰富的生物质资源应用于材料领域，减少人 类对石油资源的依赖，减少环境污染，具有十分广阔的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种合成2, 5-呋喃二甲酸的土生拉乌尔菌（Raoultella terrigena， R.terrigena)BF60。所述R.terrigena BF60菌株于2014年8月26日保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No :M2014391。
[0006] 所述菌株具有5-羟甲基糠醛抗性，抗性浓度范围为0-35mM。
[0007] 所述菌株在5-羟甲基糠醛为35mM的培养基中仍能生长，是已报道的现有同属菌 株中5-羟甲基糠醛抗性最高的菌株。
[0008] 所述R. terrigena BF60菌株筛选来自生产5-羟甲基糠醛的工厂附近的土样。
[0009] 本发明还提供一种所述R. terrigena BF60菌株的筛选方法，是取生产5-轻甲基 糠醛的工厂附近的土样，在含有5-羟甲基糠醛的培养基中进行富集、筛选、发酵培养，检测 发酵液中2, 5-呋喃二甲酸的产量，得到一株2, 5-呋喃二甲酸产量较高的菌株。
[0010] 所述R. terrigena BF60菌株的筛选方法中的培养基为：
[0011] 富集培养基或发酵培养基（g/L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠 10g，5-羟甲基 糠醛3. 15g ;筛选培养基（g/L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠 10g，5-羟甲基糠醛4.4g， 琼脂20g ;
[0012] 本发明还提供一种应用所述1?461^8611&8?60来生产2,5-呋喃二甲酸的方法， 是以5-羟甲基糠醛为底物采用全细胞转化法生产。
[0013] 所述方法是将底物5-羟甲基糠醛加入R. terrigena BF60菌悬液中，采用全细胞 转化法，实现2, 5-呋喃二甲酸的积累。
[0014] 所述方法，全细胞转化的条件是：在OD6tltl为80-120的R. terrigena BF60菌悬液 中添加5-羟甲基糠醛至终浓度为75-150mM，在25-37°C、150-220rpm下转化50-150h。
[0015] 所述R. terrigena直接在含有5-轻甲基糠醒底物的培养基中，能耐受35mM的 5_羟甲基糠醛，而在全细胞转化过程中，细胞浓度较高，可以将底物浓度75-150mM的5-羟 甲基糠醛转化生成2, 5-呋喃二甲酸。
[0016] 所述方法中，制备菌悬液的土生拉乌尔菌体的培养方法为：将R. terrigena BF60 于25-37°C、150-220rpm条件下的菌体培养基中培养24-30h，离心得菌体。
[0017] 所述方法中，菌体培养基（g/L)为酵母粉0· 1-1、K2HPO4 · 3H2010-25、 NaH2PO4 · 2H205-1 5、（NH4) 2S04卜5、MgCI · 6H200· I-O· 6、EDTAO· 0 I-O· 05、 ZnSO4 · 7H200. 001-0. 005, CaCl2 · 2H200. 001-0. 005, FeSO4 · 7H200. 005-0. 02, Na2MoO4 · 2H200. 001-0. 005、CuSO4 · 5H200. 0005-0. 002、CoCl2 · 6H200. 0005-0. 002、 MnCl2 · 2H200. 001-0. 005、甘油 5-15。
[0018] 所述方法中菌悬液的制备，是将R. terrigena BF60菌体用pH6-9的缓冲液洗涤后 重悬菌体。
[0019] 所述方法，具体包括：将R. terrigena BF60于25-37 °C、150-220rpm条件下的菌 体培养基中培养24-30h，离心得菌体，用pH6-9的缓冲液重悬菌体，使菌体最终浓度为0D_ 为80-120,然后加入5-羟甲基糠醛，使5-羟甲基糠醛的终浓度为75-150mM，于25-37°C、 150-220rpm 条件下转化 50-150h。
[0020] 所述缓冲液是以下任意一种：磷酸盐缓冲液、tris-HCl缓冲液,Britton-Robinson 缓冲液。
[0021] 所述缓冲液重悬菌体，在本发明的一种实施方式中，是先洗涤3次再重悬。
[0022] 所述缓冲液，在本发明的一种实施方式中是pH为7的磷酸盐缓冲液。
[0023] 所述菌悬液的0D_，在本发明的一种实施方式中为90-110。
[0024] 所述5-羟甲基糠醛的终浓度，在本发明的一种实施方式中为80-110mM。
[0025] 所述全细胞转化时的温度，在本发明的一种实施方式中为28_32°C。
[0026] 所述全细胞转化时的转速，在本发明的一种实施方式中为200_220rpm。
[0027] 所述全细胞转化时间，在本发明的一种实施方式中为90_120h。
[0028] 本发明提供的R. terrigena BF60可实现2, 5-呋喃二甲酸的积累，其产量可达到 7. 95g/L，为进一步利用土生拉乌尔菌生产2, 5-呋喃二甲酸奠定了基础。本发明提供的土 生拉乌尔菌生产2, 5-呋喃二甲酸的方法简单，具有很好的应用前景。
[0029] 生物材料
[0030] 土生拉乌尔菌Raoultella terrigena BF60已于2014年8月26日保藏于中国典 型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No :M2014391，保藏地址为中国武汉武汉大学。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图IR. terrigena BF60的光学显微镜照片（物镜100X，目镜10X)
[0032] 图2R. terrigena BF60的透射电子显微镜照片
[0033] 图3标准品㈧和发酵液（B)中2, 5-呋喃二甲酸的液相色谱图
[0034] 图4标准品（A)和发酵液B)中2, 5-呋喃二甲酸的二级质谱图
【具体实施方式】
[0035] 2, 5-呋喃二甲酸的高效液相色谱（HPLC)测定方法：
[0036] 仪器为Agilent 1260,检测器为VWD ;检测波长为230nm ;色谱柱为Aminex HPX-87H(300X7. 8mm);流动相为 5mM H2SO4 ;流速为 0. 5mL/min ;柱温为 40°C ;进样量为 10 μ L0
[0037] 2, 5-呋喃二甲酸的液质联用仪检测方法：
[0038] 仪器：WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS ;
[0039] 液相色谱条件：色谱仪为WATERS ACQUITY UPLC;检测器为WATERS ACQUITY PDA ;分析柱为CSH(2. I X 50mm，1. 7 μ m);流动相为A :100%乙腈；B :0. 1 %甲酸；梯度洗脱 (lmin :0% A ;4min :10% A ;7min :100% A ;8min :100% A ;8. Imin :0% A ;10min :0% A);柱 温为45°C ;流速为0. 3mL/min ;进样量为1 μ L。
[0040] 质谱条件：离子方式：ESI-;毛细管电压：3. OKV ;锥孔电压：30V;离子源温度： l〇〇°C ;脱溶剂气温度：400°C ;脱溶剂气流量：500L/h ;锥孔气流量：50L/h ;碰撞能量：6eV ; 质量范围：50-1000m/z ;检测电压：1900V。
[0041] 实施例1高产2, 5-呋喃二甲酸菌株的筛选
[0042] 将Ig取自一生产5-羟甲基糠醛的工厂附近的土样加入到装有20mL富集培养基 的250mL三角瓶中，在30°C，220rpm下培养24h。培养液经短时离心后，取上清液涂布于筛 选培养基中培养48h。挑取菌落形态较大的菌株转移到种子培养基中培养24h后，取500yL 培养液移入含有500 μ L40%甘油的保藏管中，置于-80°C冰箱保存。
[0043] 富集培养基或发酵培养基（g/L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，5_羟甲基 糠醛3. 15g。
[0044] 筛选培养基（g/L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，5_羟甲基糠醛4.4g，琼 脂 20g ;
[0045] 挑取_80°C保藏的菌株在固体种子培养基上划线，于30°C培养24h后，挑取单菌落 接种于装有50mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，30°C在转速为220rpm的摇床中培养72h 后，将发酵液于12000rpm下离心lOmin，用去离子水稀释一定倍数后，经0. 22μπι滤膜过滤 后采用高效液相色谱仪和液质联用仪对发酵液进行2, 5-呋喃二甲酸的定性分析，最终检 测到一株2, 5-呋喃二甲酸产量较高的菌株，将其编号为BF60。
[0046] 种子培养基（g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,氯化钠10。如需固体培养基，再添加 2%琼脂。
[0047] 发酵培养基（g/L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，5_羟甲基糠醛3.15g。
[0048] 液相色谱图和质谱图分别见图3和图4。从图3中的高效液相色谱图可以看出发酵 液中出现和2, 5-呋喃二甲酸标准品具有同样保留时间（分别为19. 136min和19. 138min) 的色谱峰，并且往发酵液中外源添加2, 5-呋喃二甲酸标准品后，该保留时间下的色谱峰峰 面积会相应增大，因此确定该化合物是2, 5-呋喃二甲酸。为了进一步验证该化合物，采用 二级质谱对质核比（m/z) 155的离子进行轰击，得二级质谱图4,从图4中可以看出发酵液 和2, 5-呋喃二甲酸标准品中均有质核比（m/z)为111、67的离子碎片，因此可以确定该化 合物是2, 5-呋喃二甲酸。
[0049] 实施例2产2, 5-呋喃二甲酸菌株的分子生物学鉴定
[0050] 应用细菌通用引物（27F/1492R)从筛选得到的菌株的基因组中扩增其16sDNA 序列，进行测序，比对。该菌株的16sRNA序列如SEQ ID NO. 1所示。将该序列在NCBI中 进行Blast比对，发现，该菌株的目的序列与土生拉乌尔菌（R. terrigena NBRC14941)的 相似度为98%，因此，确定该菌株为土生拉乌尔菌（又称土生克雷伯氏菌（Klebsiella terrigena))。该菌株已于2014年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC No :M2014391，保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0051] 实施例3Raoultella terrigena BF60的形态特征及生理生化特征
[0052] R. terrigena BF60在不含5-羟甲基糠醛的筛选培养基上30°C下培养24h，菌 落为淡黄色半球形，表面湿润闪光，边缘整齐，半透明，兼性厌氧生长，革兰氏染色为阴性， 1000X显微镜（附图1)和透射电子显微镜（附图2)下观察细胞呈杆状，有荚膜，单个或成 对形式存在。参照第八版《伯杰细菌鉴定手册》和相关文献进行了相应的生理生化性能分 析实验，结果如表1所示。
[0053] 表1目标菌株分类鉴定结果
[0054]
【权利要求】
1. 一株土生拉乌尔菌（Raoultella terrigena)BF60,于2014年8月26日保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC No :M2014391。
2. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株以5-羟甲基糠醛为底物生成 2, 5-呋喃二甲酸。
3. -种应用权利要求1所述的土生拉乌尔菌生产2, 5-呋喃二甲酸的方法，其特征在 于，所述方法是以5-羟甲基糠醛为底物采用全细胞转化法生产。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化法是：在0D_为80-120 的R. terrigena BF60菌悬液中添加底物5-羟甲基糠醛至终浓度为75-150mM，在25-37°C、 150-220rpm 下转化 50-150h。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌悬液的R. terrigena BF60菌体 的培养方法是将R. terrigena BF60于25-37°C，150-220rpm条件下的菌体培养基中培养 24-30h。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述菌体培养基每升中含有：酵母粉 0? l-lg、K2HP04.3H20 10-25g、NaH2P04.2H20 5-15g、（NH4)2S04 l-5g、MgCl .6H20 0? 1-0. 6g、 EDTAO. 01-0. 05g、ZnS04 ? 7H20 0. 001-0. 005g、CaCl2 ? 2H20 0. 001-0. 005g、FeS04 ? 7H20 0. 005-0. 02g、Na2Mo04 ? 2H20 0. 00卜0. 005g、CuS04 ? 5H20 0. 0005-0. 002g、CoC12 ? 6H20 0? 0005-0. 002g、MnCl2 ? 2H20 0? 001-0. 005g、甘油 5-15g。
7. 根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述方法具体为：将R. terrigena BF60于25-37°C、150-220rpm下的菌体培养基中培养24-30h，离心得菌体，用pH为6-9的 缓冲液重悬菌体，使菌体最终浓度为〇D_为80-120,然后加入5-羟甲基糠醛，使5-羟甲基 糠醛的终浓度为75-150mM，于25-37°C、150-220rpm条件下转化50-150h。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述缓冲液是以下任意一种：磷酸盐缓冲 液、tris-HCl 缓冲液，Britton-Robinson 缓冲液。
9. 权利要求1所述土生拉乌尔菌在生产2, 5-呋喃二甲酸方面的应用。
【文档编号】C12P17/04GK104371955SQ201410606067
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】刘龙, 陈坚, 堵国成, 李江华, 袁海波 申请人:江南大学