本发明涉及一种高粱原生质体的制备方法及制备的原生质体的转化方法，属于植物细胞学领域。
背景技术：
高粱为禾本科一年生草本作物。高粱谷粒可供食用、酿酒；穗可制笤帚；嫩叶阴干可作青贮饲料；颖果能入药，可祛痰，宁心安神，属重要经济作物。近年来对高粱的研究主要集中在采用基因工程手段培育抗病、抗寒、抗逆的高粱品种等方面。但是，由于高粱转化及再生体系技术还不成熟，制约了利用转基因技术研究高粱基因功能，而利用原生质体可以对植物基因功能进行快速验证，因而，对高粱原生质体制备与转化研究具有重要意义。
自18世纪Klercker第一次从藻类分理出原生质体以来，人们已经陆续从小麦、玉米、水稻、大麦等禾本科植物中成功分离出原生质体，原生质体的应用也扩展到基因瞬时表达、蛋白亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、启动子分析以及种质资源改良等领域。目前，有报道用高粱悬浮细胞制备原生质体的方法，但是该方法费时、费力，不利于快速验证基因功能的需要。本发明克服以上缺点，采用高粱黄花苗进行原生质制备，转化过程只需要2天时间，简单、快速。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是：提供一种高粱原生质体的制备方法，以解决现在采用悬浮细胞制备原生质体费时、费力、效率低的问题。
本发明的技术方案是：一种高粱原生质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)取高粱种子于水中催芽，并将芽播种、培育成黄化苗；
(2)剪取生长良好的高粱黄化苗，用甘露醇预处理后，取中间的叶鞘部分，用刀片切成细条；
(3)对切好的叶鞘用原生质体酶解液进行酶解处理，裂解高粱原生质体；
(4)对裂解的高粱原生质体进行固液分离，即得高粱原生质体。
还包括以下步骤：用预冷的缓冲液W5调节高粱原生质体的浓度。
所述缓冲液W5按照如下方法制备而成：称取0.37g的KCl，18.4g的CaCl2，9.0g的NaCl，0.3g的MES和0.9g的glucose，加ddH2O至900mL，用KOH调节pH至5.7，最后定容至1L，灭菌备用。
所述原生质体酶解液按照如下方法制备而成：称取0.3g的Cellulose R10，0.75g的MacerozymeR10，2.184g的Mannitol，800uL的0.5M MES(PH5.7)，20uL的1M CaCl2，0.02g的BSA，最后用ddH2O定容至20mL，细菌过滤器抽滤灭菌备用。
所述固液分离包括如下步骤：将酶解处理后的高粱原生质体进行过滤，收集滤液，然后对滤液进行离心处理，弃去上清液，获得离心沉淀物，即得高粱原生质体。
本发明还提供一种根据前述方法制备的高粱原生质体的转化方法，包括以下步骤：
1)将高粱原生质体溶液与外源DNA混合摇匀；
2)加入40％PEG溶液，混匀，室温静置孵育；
3)加入缓冲液W5，轻柔颠倒混匀，即得转化子。
本发明的有益效果是：本发明首次建立了高粱原生质体制备及转化体系，其方法简单、有效，可以用于高粱蛋白亚细胞定位，高粱蛋白互作(双分子荧光互补，BiFC)和蛋白纯化以及荧光素酶(Luciferase)标记的基因表达等方面的研究，因此，可用作高粱基因功能的研究。
附图说明
图1为用GFP和YFP转化高粱原生质体的结果。
具体实施方式
下面结合附图及具体的实施例对发明进行进一步介绍：
1、高粱种子的培育
高粱种子泡在水中24小时，使种子充分吸水，每隔12小时换一次水；24小时后倒掉水，种子用湿布盖住，持续24小时，直至种子长出白色的芽。然后将其播种于育苗盘中，播种后置于25度光照下至苗长齐(约1-2天)，25度黑暗培养8天。
2、高粱黄化苗的预处理
剪取生长良好的高粱黄化苗(约50株)，放于0.6M甘露醇中预处理10分钟，取中间的叶鞘部分，用刀片切成0.5mm细条(越细越好，尽量一刀切碎，不要反复切，避免使细胞受到损伤)。
3、酶解处理
把切好的叶鞘移入含有20毫升酶解液的50mL三角瓶中(用锡箔纸遮住)；用真空泵-40kPa抽真空20min后，在黑暗中消化酶解7h(28℃，80rpm，酶解液加入链霉素抑制细菌生长)，期间显微镜检查原生质体裂解状态。
所述原生质体酶解液按照如下方法制备而成：称取0.3g的Cellulose R10，0.75g的MacerozymeR10，2.184g的Mannitol，800uL的0.5M MES(PH5.7)，20uL的1M CaCl2，0.02g的BSA，最后用ddH2O定容至20mL，细菌过滤器抽滤灭菌备用。
酶解液配方：
注：酶解液需现用现配。需55℃水浴加热10min待完全溶解后，泠却至室温，再加入CaCl2和BSA，最后后用0.44μm细菌过滤器过滤灭菌。
4、固液分离
将酶解处理后的高粱原生质体进行过滤，收集滤液，然后对滤液进行离心处理，弃去上清液，获得离心沉淀物，即得高粱原生质体。
具体的固液分离手段为，使用200目尼龙网过滤裂解的原生质体，用少量W5提前润湿尼龙网，过滤到50mL离心管。残渣用W5漂洗再过滤，合并滤液。室温下1000g离心5min，沿离心管壁倒入10mL预冷的缓冲液W5，重悬沉淀，离心。
重复上一步2次。吸去上清，用预冷的W5重悬沉淀，冰上放置30min，(此时可进行原生质体计数)。
所述缓冲液W5按照如下方法制备而成：称取0.37g的KCl，18.4g的CaCl2，9.0g的NaCl，0.3g的MES和0.9g的glucose，加ddH2O至900mL，用KOH调节pH至5.7，最后定容至1L，灭菌备用。
W5溶液(1L)：
注：用KOH调节pH至5.7再高压灭菌，4度保存。
5、原生质体计数
1)用缓冲液W5稀释原生质体，取少量稀释后的原生质体悬浮液滴加在血球计数板上；
2)在普通光学显微镜下观察，并用血球计数板测定原生质体的浓度：计算4个角上大格及中央大格(共5个大格)内的原生质体个数；
3)调节原生质体浓度为106个/mL，按如下公式计算：
原生质体浓度(个/mL)＝5个大格内原生质体总个数×104×稀释倍数。
6、原生质体转化
1)准备含有绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)植物表达载体的菌液，用QIAGEN公司的质粒制剂盒提(货号12125)取高质量的质粒DNA，使得质粒最终浓度达到1ug/ul。
2)准备3μg提取的GFP和YFP质粒DNA，分别加到2mL离心管底部，向管中加入100μL高粱原生质体，轻轻混匀。
3)每管中加入80μL PEG(40％)溶液，轻轻混匀，室温静置孵育10min。
4)加入320μL的W5，轻柔颠倒混匀，终止转化。
5)室温离心，1000g，5min。
6)吸去上清(剩约50μl)，缓慢加入500ul的W5，轻柔颠倒混匀，室温离心，1000g，5min。
7)重复上一步。
8)吸去上清，缓慢加入500ul的W5，轻柔颠倒混匀，即得转化子。
9)将样品置于室温培养12h。
10)将样品1000g，离心5min,用剪口的1mL枪头吸去上清，余下约80μL，用于荧光观察。
11)在激光共聚焦显微镜下观察GFP或YFP信号(结果见图1)，对其结果进行分析说明。从图1可以看出，用GFP或YFP转化高粱原生质体，都可以明显看到在细胞质、细胞膜和细胞核都有很强的荧光信号，并且原生质体呈现圆形、未破裂的状态，这说明用本方法所制备的高粱原生质量很好，用本发明进行的转化效率也很高，因此，可以用本发明对高粱的其它基因进行亚细胞定位研究。40％PEG溶液：
本实施例所涉及的试剂及配方如下：
试剂：
其中，MES过滤灭菌，4℃保存，pH＝5.7；其余高温灭菌。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。