本发明涉及遗传工程领域，尤其涉及一种能够提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，还涉及利用该重组枯草芽孢杆菌过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶促进合成乙酰氨基葡萄糖的方法。
背景技术：
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被 FDA 认证为“generally regarded as safe”(GRAS) 安全级别。以往构建的重组枯草芽孢杆菌（BSGNK）发酵生产乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）时，存在GlcNAc产量低的问题。在B. subtilis中，葡萄糖首先在葡萄糖激酶和磷酸葡萄糖异构酶作用下合成6-磷酸果糖，随后在6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS）催化作用下合成6-磷酸氨基葡萄糖（GlcN-6P），再在6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶（GNA1）的作用下生成6-磷酸乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc-6P），最后在脱磷酸生成GlcNAc被转运至胞外。但有研究表明，6-磷酸果糖在GlmS的催化作用下生成6-磷酸氨基葡萄糖（GlcN-6P）的过程受到由glmS核酶开关介导的严格反馈控制，具体过程如下：当胞内GlcN-6P积累时，其能够与glmS核酶开关结合，激活核酶开关对glmS基因转录产物进行自切割；3’端mRNA切割部分因切割形成的5’-OH端被RNA酶J1特异性识别，在RNA酶J1作用下mRNA被进一步降解，造成glmS基因的mRNA无法翻译，降低glmS基因的表达；而当GlcN6P浓度较低时，glmS基因转录产物可正常翻译。因此，要想过量合成GlcNAc，必须解除glmS核酶对GlcNAc合成关键酶GlmS在转录水平的抑制调控。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种通过强组成型启动子P43过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS），解除glmS核酶对GlcNAc合成关键酶GlmS在转录水平的抑制调控，避免了glmS基因的mRNA被RNA酶降解，使得glmS基因的mRNA正常翻译，促进了胞外乙酰氨基葡萄糖积累的重组枯草芽孢杆菌。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：重组枯草芽孢杆菌，在重组枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，进一步过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS），得到重组菌BSGNKS；所述重组枯草芽孢杆菌BSGNK，是以B. subtilis 168 Δ nagP Δ gamP Δ gamA Δ nagA Δ nagB Δ ldh Δ pta Δ glck :: lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glms、GNA1的重组表达。
作为进一步优选的技术方案，所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS）编码基因glmS如NCBI中geneID:938736所示。
作为进一步优选的技术方案，所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS）的构建整合表达框为SEQID NO.1，并经同源重组整合至glcK位点。
本发明还涉及了重组枯草芽孢杆菌过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法，以重组枯草芽孢杆菌BSGNK作为出发菌株，过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS），所得的重组菌BSGNKS用于生产乙酰氨基葡萄糖，所述重组枯草芽孢杆菌BSGNK是以B. subtilis 168 Δ nagP Δ gamP Δ gamA Δ nagA Δ nagB Δ ldh Δ pta Δ glck :: lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glms、GNA1的重组表达。
作为进一步优选的技术方案，利用所述重组菌BSGNKS结合复合培养基复合生产乙酰氨基葡萄糖。
作为进一步优选的技术方案，所述复合培养基包括按g/L计的以下组分：
初始葡萄糖55～65、蛋白胨 5～8、酵母粉 10～14、(NH4)SO45～8、 K2HPO4·3H2O 11～13、KH2PO4 2～3.5、CaCO3 3.5～6、微量元素溶液 8～12ml/L；
所述微量元素溶液包括按g/L计的以下组分：
MnSO4·5H2O 0.75～1.25、Cocl 2·6H2O 0.3～0.5、NaMoO4·2H2O 0.1～0.3、ZnSO4·7H2O 0.1～0.3、 Alcl3·6H2O 0.05～0.15、Cucl 2·H2O 0.05～0.15、H3BO4 0.04～0.06。
作为进一步优选的技术方案，利用所述重组菌BSGNKS结合发酵培养基发酵法生产乙酰氨基葡萄糖。
作为进一步优选的技术方案，将活化后的所述重组枯草芽孢杆菌的种子培养液以至少10%的接种量转入所述发酵培养基中进行接种，接种至少2 h后加入诱导剂并置于摇瓶内，在30～40 oC的温度环境中以200～240rpm 的转速条件下培养至少 48 h。
作为进一步优选的技术方案，所述发酵培养基包括按g/L计的以下组分：
初始葡萄糖55～65、蛋白胨 5～8、酵母粉 10～14、(NH4)SO45～8、 K2HPO4·3H2O 11～13、KH2PO4 2～3.5、CaCO3 3.5～6、微量元素溶液 8～12ml/L；
所述微量元素溶液包括按g/L计的以下组分：
MnSO4·5H2O 0.75～1.25、Cocl 2·6H2O 0.3～0.5、NaMoO4·2H2O 0.1～0.3、ZnSO4·7H2O 0.1～0.3、 Alcl3·6H2O 0.05～0.15、Cucl 2·H2O 0.05～0.15、H3BO4 0.04～0.06。
作为进一步优选的技术方案，所述诱导剂包括木糖，所述木糖的用量为5 g/L；所述摇瓶的装液量为50 mL。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：在重组枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，进一步过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS），得到的重组枯草芽孢杆菌可提高乙酰氨基葡萄糖在胞外积累和底物的转化效率，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量为11.4 g/L，与对照菌BSGNK相比分别提高了37.4%，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础，且重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。在下面的详细描述中，只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例。毋庸置疑，本领域的普通技术人员可以认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，描述在本质上是说明性的，而不是用于限制权利要求的保护范围。
实施例一：
重组枯草芽孢杆菌，在重组枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，进一步过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS），得到重组菌BSGNKS；所述重组枯草芽孢杆菌BSGNK，是以B. subtilis 168 Δ nagP Δ gamP Δ gamA Δ nagA Δ nagB Δ ldh Δ pta Δ glck :: lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glms、GNA1的重组表达。所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS）编码基因glmS如NCBI中geneID:938736所示，所述NCBI中geneID:938736为本技术领域内普通技术人员所熟知的内容，在此不再详细说明。所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS）的构建整合表达框为SEQID NO.1，并经同源重组整合至glcK位点。
根据 NCBI 上公布的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis 168 购自美国典型微生物保藏中心 ，ATCC No.27370) 的整合位点glcK的上下游序列、博来霉素抗性基因的序列、强组成型启动子P43，以及6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS）构建序列如SEQ ID NO.1所示的整合框。
将构建好的整合框转化重组枯草芽孢杆菌BSGNK，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，确认整合成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKS。重组枯草芽孢杆菌BSGNK的构建方法参见文 献 Liu,Y.et al. Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production. Metab. Eng. 23:42-52, 2014。BSGNK是通过pP43NMK-GNA1质粒游离表达GNA1基因，通过 pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因。
重组枯草芽孢杆菌过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法，以重组枯草芽孢杆菌BSGNK作为出发菌株，过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS），所得的重组菌BSGNKS用于生产乙酰氨基葡萄糖，所述重组枯草芽孢杆菌BSGNK是以B. subtilis 168 Δ nagP Δ gamP Δ gamA Δ nagA Δ nagB Δ ldh Δ pta Δ glck :: lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glms、GNA1的重组表达。利用所述重组菌BSGNKS结合复合培养基复合生产乙酰氨基葡萄糖。
其中，所述复合培养基包括按g/L计的以下组分：初始葡萄糖55～65、蛋白胨 5～8、酵母粉 10～14、(NH4)SO45～8、 K2HPO4·3H2O 11～13、KH2PO4 2～3.5、CaCO3 3.5～6、微量元素溶液 8～12ml/L；所述微量元素溶液包括按g/L计的以下组分：MnSO4·5H2O 0.75～1.25、Cocl 2·6H2O 0.3～0.5、NaMoO4·2H2O 0.1～0.3、ZnSO4·7H2O 0.1～0.3、 Alcl3·6H2O 0.05～0.15、Cucl 2·H2O 0.05～0.15、H3BO4 0.04～0.06。
具体地含有：初始葡萄糖60、蛋白胨 6、酵母粉 12、(NH4)SO4 6、K2HPO4·3H2O 12.5、KH2PO4 2.5、CaCO3 5、微量元素 溶液10 ml/L；微量元素溶液含有：MnSO4·5H2O 1.0、Cocl 2·6H2O 0.4、NaMoO4·2H2O 0.2、ZnSO4·7H2O 0.2、 Alcl3·6H2O 0.1、Cucl 2·H2O 0.1和H3BO4 0.05。
复合培养条件 ：将 37 oC、220 rpm 下培养 8 h 的种子以 3％的接种量转入复合培养基，接种2 h后加入诱导剂木糖 5 g/L，于500 mL摇瓶、37 oC、220rpm 条件下培养 48 h，摇瓶装液量为50 mL。种子培养基 (g/L) ：胰蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10。
实施例二：
本实施例利用所述重组菌BSGNKN结合发酵培养基发酵法生产乙酰氨基葡萄糖。具体为，将活化后的所述重组枯草芽孢杆菌的种子培养液以至少10%的接种量转入所述发酵培养基中进行接种，接种至少2 h后加入诱导剂并置于摇瓶内，在30～40 oC的温度环境中以200～240rpm 的转速条件下培养至少 48 h。种子培养基包括分按g/L计的以下组：胰蛋白胨 10、酵母粉 5、NaCl 10。所述诱导剂包括木糖，所述木糖的用量为5 g/L；所述摇瓶的装液量为50 mL。
所述发酵培养基包括按g/L计的以下组分：初始葡萄糖55～65、蛋白胨 5～8、酵母粉 10～14、(NH4)SO45～8、 K2HPO4·3H2O 11～13、KH2PO4 2～3.5、CaCO3 3.5～6、微量元素溶液 8～12ml/L；所述微量元素溶液包括按g/L计的以下组分：MnSO4·5H2O 0.75～1.25、Cocl 2·6H2O 0.3～0.5、NaMoO4·2H2O 0.1～0.3、ZnSO4·7H2O 0.1～0.3、 Alcl3·6H2O 0.05～0.15、Cucl 2·H2O 0.05～0.15、H3BO4 0.04～0.06。
具体地，初始葡萄糖60、蛋白胨 6、酵母粉 12、(NH4)SO4 6、K2HPO4·3H2O 12.5、KH2PO4 2.5、CaCO3 5、微量元素溶液 10 ml/L；微量元素溶液按 g/L 计含有：MnSO4·5H2O 1.0、Cocl 2·6H2O 0.4、NaMoO4·2H2O 0.2、ZnSO4·7H2O 0.2、 Alcl3·6H2O 0.1、Cucl 2·H2O 0.1和H3BO4 0.05。
乙酰氨基葡萄糖的测定方法 ：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent1200，RID检测器，NH2柱 (250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.75 mL/min，柱温 30 oC，进样体积为 10 μL。发酵液中葡萄糖浓度的检测：SBA生物传感分析仪。
在重组枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，进一步过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS），得到的重组枯草芽孢杆菌可提高乙酰氨基葡萄糖在胞外积累和底物的转化效率，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量为11.4 g/L，与对照菌BSGNK相比分别提高了37.4%，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础，且重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
本发明乙酰氨基葡糖合成、菌体生长、副产物合成及得率与对照菌BSGNK相比如表1所示：
表1
虽然本发明已以较佳实施例公开，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 大自然生物集团有限公司
<120> 重组枯草芽孢杆菌及其过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4645
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
catcaggagc catattcgga tgcttaggtg cattactgta tgttgctttg tctaatcgaa 60
aaatgttttt aagaactata ggaaccaata ttattgtcat tattatcatc aatctgggct 120
ttggttttgc ggtttcgaat attgataatt caggacatat cggcggcttg attggcggct 180
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