本发明涉及生物分析领域，具体而言，涉及一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法。
背景技术：
研究人员发现，在许多液体生物样品中均含有多种膜包被的微囊泡，这类微囊泡内包含信使RNAs和microRNA等核酸类物质以及多种蛋白质。以外泌体为例，研究证实，外泌体可作为信使，通过血液、尿液、乳液、唾液等途径介导细胞间的信号转导，其内携带各种蛋白、核酸，甚至全基因组的DNA，因而外泌体内容物通常可以反映细胞健康或者疾病的状态，并且对周围细胞产生的影响，其在一定程度上反映了肿瘤等疾病的相关信息。由此，有效分离此类细胞微囊泡具有重要意义。
目前，分离此类细胞微囊泡的方法主要有：1)超速离心法，这种方法需要采用昂贵的设备才能实现；2)聚合物沉淀法，其缺点在于所获得的杂蛋白过多，影响纯化过程；3)凝胶排阻法，其缺点在于分离效率低，产品纯度不高；4)脂质探针捕获法，该方法是使用偶联生物素的脂质分子与样品接触，脂质分子插入微囊泡的磷脂双分子层中，再用亲和素偶联的磁珠捕获生物素-脂质分子-微囊泡复合物。该方法的缺点是脂质分子在水溶液中分散性差，易自组装成脂质体。该方法的改进型是将脂质分子通过硅烷化修饰在玻璃基底上，缺点是硅烷化的效率有限，玻璃基底的表面积有限；5)正电膜捕获法，该方法是使用带正电的再生纤维素多孔膜、以及带正电的强阴离子交换树脂，捕获带负电的微囊泡，其缺点是纯度和分离效率有限。
由上述分析可知，现有技术中分离细胞微囊泡的技术都各有局限性，无法满足研究需要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，旨在提高细胞微囊泡的分离效率和纯度。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其包括：
将预处理后的生物样品与脂质颗粒混合孵育后，形成细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物；再将细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物从生物样品中分离。
与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：
本发明提供的这种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，通过对生物样品进行预处理，去除生物样品中的细胞、细胞碎片以及团聚物，得到包含有细胞微囊泡的生物样品上清液；再将该生物样品上清液与脂质颗粒混合孵育，在孵育过程中，由于脂质颗粒的表面具有亲脂性的基团或表面具有正电荷，其能够通过亲和作用与上清液中的细胞微囊泡结合、或者与上清液中的细胞微囊泡相融合，形成细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物；由于这种细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物的质量及分子大小均远大于细胞微囊泡，故可利用较为常规的分离技术，便可使细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物与上清液分离，得到携带有细胞微囊泡的复合物或融合物；可进一步将其裂解，从中提取核酸或蛋白质，用于多种生物分析中。
该方法使用脂质颗粒捕获细胞微囊泡，克服了现有的脂质探针捕获法在分离细胞微囊泡时脂质分子在生物样品溶液中分散性差、易组装的缺陷，有效提高了细胞微囊泡的分离效率和纯度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1所得细胞外囊泡的蛋白与标准超速离心法所得的细胞外囊泡的蛋白，同时进行Western blot分析，得到的细胞外囊泡标志物含量的结果。
图2为实施例2所得的外泌体RNA进行荧光定量PCR，得到的β-actin mRNA扩增曲线。
图3为实施例2所得的外泌体RNA进行荧光定量PCR，得到的β-actin mRNA溶解曲线。
图4为采用标准超速离心法所得的外泌体RNA，进行荧光定量PCR，得到的β-actin mRNA扩增曲线。
图5为采用标准超速离心法所得的外泌体RNA，进行荧光定量PCR，得到的β-actin mRNA溶解曲线。
图6为实施例2所得的外泌体RNA与标准超速离心法所得的外泌体RNA，同时进行荧光定量PCR，得到的β-actin mRNA相对含量统计结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本实施方式提供一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，以获得高纯度的细胞微囊泡，并分离其携带的核酸或蛋白质进行常规生物分析。
其中，细胞微囊泡为细胞所分泌、脱落或破碎后产生的，具有脂质膜结构。细胞微囊泡包括细胞外囊泡、微粒(100～1000nm)、脱落囊泡(100～1000nm)。其中，细胞外囊泡包括外泌体(40～150nm)、微囊泡(100～1000nm)、凋亡小体。
其中，生物样品包括血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、汗液、精液、组织积液、细胞或组织培养物上清液。
该分离方法包括以下步骤：
步骤S1：将预处理后的生物样品与脂质颗粒混合孵育后，形成细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物。
进一步的，生物样品的预处理方法包括：将生物样品进行过滤或离心，以去除样品中的细胞、细胞碎片和团聚物，得到生物样品上清液。优选的，过滤时选用0.2～0.8μm的滤膜，或0.3～0.7μm的滤膜，或0.4～0.6μm的滤膜。优选地，在1PA18000431SC～16000g、4～25℃下离心10～30min，或者为在12000～14000g、3～7℃下离心15～25min。
进一步的，在较佳的实施例中，脂质颗粒的粒径为100nm～10μm，或者为500nm～8μm，或者为1μm～8μm，或者为3～6μm。
进一步的，在一些实施例中，脂质颗粒的表面修饰有胆固醇或类固醇衍生物、C6～C24脂肪酸或其酯、壳聚糖、肽、抗体、半抗体、纳米抗体、以及适配体中的至少一种。脂质颗粒经表面修饰后可增强其与细胞微囊泡之间的亲和作用力。其中，用胆固醇或类固醇衍生物、C6～C24(或者C10～C20、或者C13～C16)的脂肪酸或其酯修饰脂质颗粒，可增强其与细胞微囊泡之间的亲脂作用；用壳聚糖修饰脂质颗粒，可增强其与细胞微囊泡之间的静电作用；用肽、抗体、半抗体、纳米抗体以及适配体修饰脂质颗粒，可增强其与细胞微囊泡之间的分子间特异性识别能力，可用于分离某一类表面具有生物标志物的细胞微囊泡。
进一步的，在本发明的另一些实施例中，脂质颗粒的表面具有两亲性外壳，该两亲性外壳是通过用两亲性脂类化合物修饰脂质颗粒形成。其中，优选的，两亲性脂类化合物包括以下至少一种：(a)C6～C24、或者C10～C20、或者C13～C16的磷脂或糖脂；(b)胆固醇或类固醇衍生物；(c)甘油酯。
进一步的，脂质颗粒为能与所述细胞微囊泡结合的脂质体、固体脂质颗粒、脂复合物颗粒或其组合。这类脂质颗粒可参照本领域中的常规方法来进行合成，例如液相沉淀法、水热反应法、微乳液法、溶胶凝胶法、微波法、超声法等。这类脂质颗粒的表面具有亲脂性基团、正电荷或者能够与细胞微囊泡进行特异性结合的生物大分子，其能够通过亲和作用与细胞微囊泡形成较强的作用力，进而在孵育过程中，形成细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物。
进一步的，表面具有两亲性外壳的脂质颗粒可以为以下几种形式：
A.脂质颗粒是由两亲性脂类化合物形成的单层或多层囊泡结构的脂质体；
B.脂质颗粒是由固体脂质核芯和两亲性外壳组成的固体脂质颗粒；
其中，固体脂质核芯包括在室温下呈固体形式的C12～C24甘油酯、C12～C24脂肪酸及其酯中的至少一种。
C.脂质颗粒是由非脂质核芯和两亲性外壳组成的脂复合物颗粒；
其中，非脂质核芯包括由聚合物、氧化铁、氧化硅、壳聚糖、碳纳米管和碳纳米球组成的群组中的至少一种。优选的，非脂质核芯为氧化铁或碳纳米管。
采用B、C这两种形式的脂质颗粒，其核芯的比重较大，在后续将细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物的分离步骤中，可直接使用离心分离法，而无须采用工序较为复杂的膜过滤或分子阻尼法。
进一步的，生物样品与脂质颗粒混合孵育时的温度为4～37℃、孵育时间为10min～24h。较为优选的，采用混匀器进行孵育。
步骤S2:再将步骤S1中所得的细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物从所述生物样品中分离。
进一步的，将细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物从生物样品中分离时，采用膜过滤法、分子排阻法或离心法。
进一步的，采用膜过滤法进行分离时，采用孔径为100nm～2μm的滤膜。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例1
本实施例提供一种血浆中细胞外囊泡的分离方法，其包括：
a.将EDTA抗凝处理的血液于1000g的离心力、室温下离心15min，去除血液中的红细胞、白细胞、血小板等，得到血浆。将血浆进一步于1PA18000431SCg的离心力、室温下离心30min，去除细胞碎片、直径较大的囊泡和蛋白团聚物，得到上清液；
b.采用超声乳化法合成脂质体。例如，将N-[1-(2，3-二油酰氯)丙基]-N，N,N-氯化三甲胺(DOTMA)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)按照质量比92:8溶解在4％乙醇的水溶液中，置于水浴中超声乳化30min。置入真空干燥箱中过夜去除溶剂，加入磷酸盐缓冲液制成带正电荷的脂质体悬液；
c.将1mL上清液与2X1015带正电荷的脂质体悬液混合，置于旋转混匀器上，于室温下孵育2h后，脂质体与细胞外囊泡结合，形成脂质体-细胞外囊泡复合物或融合物；
d.用孔径为100nm的聚碳酸酯膜进行过滤，得到脂质体-细胞外囊泡复合物或融合物；
e.用常规的裂解和抽提试剂，得到细胞外囊泡所含的RNA、DNA或蛋白质，进行后续分析。
f.所得蛋白用Western blot分析细胞外囊泡标志物Alix和TSG101的含量。同时，也采用标准的超速离心法从1mL血浆上清液(经过预处理)提取细胞外囊泡并抽提蛋白，做Western blot分析，超离得到的上清作为阴性对照。结果如图1所示。用本方法所提取的细胞外囊泡中蛋白标志物的含量高于标准超速离心法。
实施例2
本实施例提供一种尿液中外泌体的分离方法，其包括：
a.将尿液于2000g的离心力、室温下离心20min，去除尿液中的细胞、细胞碎片。再用孔径为0.22μm的滤膜过滤，去除其中的直径较大的囊泡和蛋白团聚物，得到过滤液；
b.采用微乳法合成固体脂质颗粒。例如，将烧杯放入70℃水浴中恒温，依次加入80mg单油酸甘油酯、29mg十六烷基棕榈酸酯、20mg酯基季铵盐和1mg DSPE-PEG2000-DBCO，磁性转子搅拌，直到全部融化，缓慢加入0.5mL热水。用注射器吸取上述液体，加入正在搅拌的4℃冷水中，得到固体脂质颗粒。将1mgcholesterol-PEG1000-azide与固体脂质颗粒在磷酸盐缓冲液中混合，4℃孵育12h，得到胆固醇修饰的固体脂质颗粒。
c.将20mL过滤液与5X1015胆固醇修饰的固体脂质颗粒混合，置于旋转混匀器上，于室温下孵育6h后，固体脂质颗粒与外泌体结合，形成固体脂质颗粒-外泌体复合物或融合物；
d.用孔径为200nm的聚碳酸酯膜进行过滤，得到固体脂质颗粒-外泌体复合物或融合物；
e.用常规的裂解和抽提试剂，得到外泌体所含的RNA、DNA或蛋白质，进行后续分析。
f.所得RNA用荧光定量PCR分析其中β-actin的mRNA含量。同时，也采用标准的超速离心法从20mL尿液过滤液(经过预处理)提取外泌体并抽提RNA，做荧光定量PCR分析。本方法的扩增曲线与溶解曲线的结果如图2和图3所示，超速离心法的扩增曲线与溶解曲线的结果如图4和图5所示。对应的β-actin的mRNA相对含量统计结果如图6所示。用本方法所提取的外泌体中β-actin mRNA的含量高于标准超速离心法。
实施例3
本实施例提供一种血清中细胞外囊泡的分离方法，其包括：
a.将凝血管采集的血液置于室温待血液完全凝固，于1000g的离心力、室温下离心10min，得到血清。将血清进一步用孔径为0.8μm的滤膜过滤，去除细胞碎片、直径较大的囊泡和蛋白团聚物，得到过滤液；
b.采用冷冻干燥法合成脂复合物颗粒。例如，将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、胆固醇和DSPE-PEG2000-DBCO按摩尔比200:40:1混合，采用超声乳化法制备脂质体。将脂质体缓慢滴加到含有2％吐温-80的Fe3O4纳米颗粒悬液中，振荡30min，静置30min后，冷冻干燥得到脂复合物颗粒。将叠氮-赖氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸短肽，与脂复合物颗粒按摩尔比500:1在磷酸盐缓冲液中混合，4℃孵育12h，得到短肽修饰的脂复合物颗粒。
c.将1mL过滤液与1X1016短肽修饰的脂复合物颗粒混合，置于旋转混匀器上，于37℃下孵育1h后，脂复合物颗粒与细胞外囊泡结合，形成脂复合物颗粒-细胞外囊泡复合物或融合物；
d.于室温下5000g离心10min，或采用磁铁吸附，得到脂复合物颗粒-细胞外囊泡复合物或融合物；
e.用常规的裂解和抽提试剂，得到细胞外囊泡所含的RNA、DNA或蛋白质，进行后续分析。
实施例4
本实施例提供一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其包括：
a.用孔径为0.8μm的滤膜过滤细胞培养液上清，去除其中的细胞、细胞碎片和团聚物等，得到过滤液；
b.将过滤液与脂质体混合，于25℃下孵育24h后，脂质体与细胞微囊泡结合，形成脂质体-细胞微囊泡复合物或融合物；
c.用孔径为100nm的滤膜进行过滤，得到细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物。
实施例5
本实施例提供一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其包括：
a.用孔径为0.2μm的滤膜过滤血液，去除血液中的细胞、细胞碎片和团聚物等，得到过滤液；
b.将过滤液与固体脂质颗粒混合，于20℃下孵育10min后，固体脂质颗粒与细胞微囊泡结合，形成固体脂质颗粒-细胞微囊泡复合物或融合物；
c.用孔径为2μm的滤膜进行过滤，得到细胞微囊泡-固体脂质颗粒的复合物或融合物。
实施例6
本实施例提供一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其包括：
a.用孔径为0.4μm的滤膜过滤生物样品汗液，去除汗液中的细胞、细胞碎片和团聚物等，得到过滤液；
b.将过滤液与带正电荷的脂质颗粒混合，于23℃下孵育6h后，脂质颗粒与细胞微囊泡结合，形成脂质颗粒-细胞微囊泡复合物或融合物；
c.用孔径为500nm的滤膜进行过滤，得到细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物。
实施例7
本实施例提供一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其包括：
a.将生物样品脑脊液于1PA18000431SCg的离心力、2℃下离心30min，去除脑脊液中的细胞、细胞碎片和团聚物等，得到上清液；
b.将上清液与表面修饰有壳聚糖的脂质颗粒混合，于25℃下孵育12h后，脂质颗粒与细胞微囊泡结合，形成脂质颗粒-细胞微囊泡复合物或融合物；
c.用孔径为1μm的滤膜进行过滤，得到细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物。
实施例8
本实施例提供一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其包括：
a.将生物样品组织积液于16000g的离心力、10℃下离心10min，去除组织积液中的细胞、细胞碎片和团聚物等，得到上清液；
b.将上清液与表面修饰有甘油酯的脂质颗粒混合，于24℃下孵育4h后，脂质颗粒与细胞微囊泡结合，形成脂质颗粒-细胞微囊泡复合物或融合物；
c.用分子排阻法进行分离，得到细胞微囊泡-脂质颗粒的复合物或融合物。
实施例9
本实施例提供一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其包括：
a.将组织培养物上清液于12000g的离心力、4℃下离心20min，去除组织积液中的细胞、细胞碎片和团聚物等，得到上清液；
b.将上清液与固体脂质颗粒混合，于25℃下孵育2h后，固体脂质颗粒与细胞微囊泡结合，形成固体脂质颗粒-细胞微囊泡复合物或融合物；其中，固体脂质颗粒是由固体脂质核芯和两亲性外壳组成的颗粒结构。
c.将步骤b所得的溶液于14000g的离心力、4℃下离心15min，得到细胞微囊泡-固体脂质颗粒的复合物或融合物。
实施例10
本实施例提供一种生物样品中细胞微囊泡的分离方法，其包括：
a.将血清于13000g的离心力、4℃下离心20min，去除组织积液中的细胞、细胞碎片和团聚物等，得到上清液；
b.将上清液与脂复合物颗粒混合，于23℃下孵育1h后，脂复合物颗粒与细胞微囊泡结合，形成脂复合物颗粒-细胞微囊泡复合物或融合物；其中，脂复合物颗粒是由非脂质核芯和两亲性外壳组成的颗粒结构。
c.将步骤b所得的溶液于12000g的离心力、5℃下离心25min，得到细胞微囊泡-脂复合物颗粒的复合物或融合物。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。