专利名称：重组胃泌酸调节素融合蛋白及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及构建一种长效稳定的胃泌酸调节素，及其用于治疗代谢疾病如糖尿 病和肥胖症的用途。
背景技术：
人体食欲和能量代谢调控主要由下丘脑、脑干孤束核、胰岛素、脂联素、瘦素 等胰岛、脂肪代谢信号分子、胃促生长激素、高血糖素样肽、胃泌素调节激素等胃肠激 素和迷走神经等来共同调节。下丘脑、延脑孤束核分泌的激素和神经递质及脂肪代谢信 号分子都需要通过神经系统和血液循环系统来发挥作用，针对这些调节通路的减肥药物 需要通过中枢神经来起作用，影响面大，副作用严重。只有胃肠激素多直接作用于胃肠 道，调节食欲和能量代谢。因此，针对胃肠激素的减肥药物靶点局限，副作用小。胃泌酸调节素(Oxyntomodulin，OXM)是肠上皮L-细胞分泌的一种短肽激素。 在人肠道末端有大量的OXM分布，在啮齿类动物胃肠道中，从十二指肠到回肠，OXM 的浓度逐渐增高，盲肠之后逐渐减少。肠上皮分泌胃泌酸调节素受营养和能量代谢调 节，进食后5-10分钟后OXM水平开始升高，30分钟后达到高峰。在体内有一定的昼夜 规律，清晨分泌水平低，晚上分泌水平高。OXM由37个氨基酸组成。对于OXM的认识来源于一些胃肠及腹部疾病患者血清中OXM的变化。人们发 现在一些胃肠道疾病如热带吸收不良，空肠回肠改道术等病态情况下，OXM水平显著变 化，其减轻体重的作用引起人们的注意。前期研究结果也显示，OXM是有效的减肥药 物，长期中枢性和周围性地给与OXM可减少大鼠的体重增加。静脉给与高于生理水平 的OXM可减少受试者食物摄取。Dhilfows等在为期四周的研究中发现，自行给与OXM 的超重或肥胖受试者，其摄入量显著少于生理盐水对照组，并且体重减轻也显著快于对 照组，这种效应在四周的研究过程中持续维持。OXM可减缓胃内营养物质的排空。具 有减少食物吸收，抑制食欲及动员脂肪、减少能量摄入，增加能量消耗，使能量代谢处 于负平衡状态，从而减轻体重的功能。啮齿动物脑室注射或皮下注射胃泌酸调节素可降低食物吸收和体重，减少脂 肪。英国研究人员在《糖尿病》杂志上报告，皮下注射OXM可有效地减轻体重和减少 脂肪组织。研究人员对26名过重或肥胖的志愿者进行了一项双盲研究。受试者被随机 指定在每餐前30分钟皮下注射OXM或盐水，同时要求他们在研究期间保持正常饮食和 常规水平的体育锻炼。治疗组体重减轻了 2.3kg，对照组0.5kg。治疗组显示瘦素水平降 低，脂联素增加，与脂肪组织减少一致。受试者的热量摄取也显著减少。开始研究进 餐时减少了 170kcal，最后进餐时250kcal。在嗜食性的感知上没有变化。OXM主要通 过三条途径调节食欲和能量摄取。一是直接作用于胃肠道胰高血糖素样肽-I(GLP-I)受 体，作用于迷走神经，调节食欲，抑制糖和脂肪的吸收。二是下调胃生长素的分泌，抑 制食欲。研究显示，皮下注射OXM可使啮齿动物血液中的胃生长素下降20%，而人类 可下降到44%。三是通过甲状腺途径刺激甲状腺素的合成分泌，增加能量消耗，动员脂肪分解。现在多认为OXM通过GLP-I受体起作用。在GLP-I受体敲除的小鼠实验中 发现，OXM的厌食效应消失。OXM具有很短的半衰期，可被细胞表面的二肽基肽酶IV (DP-IV)迅速失活， 然而，DP-IV抑制剂在临床中的体重效果居中，表明可能需要超生理水平的OXM来实现 人体的减肥。因此，胃泌酸调节素显示了作为代谢疾病如糖尿病和肥胖症的治疗手段的 潜力，但是，因为OXM的体内稳定性差，所以需要开发可被安全有效的给药用于治疗代 谢疾病如糖尿病和肥胖症的长效OXM。抗体的Fc结构域通常包含每个链的至少两个重链恒定区结构域，其二聚化形成 Fc结构域。Fc结构域负责提供抗体效应功能，包括决定抗体半衰期和在体内的分布固定 补体和结合细胞表面Fc受体的能力。Fc结构域的性质使其称为有用的治疗剂。许多研 究已将Fc结构域融合于其他非抗体蛋白质，例如受体蛋白，例如伊纳西普，也可将Fc结 构域融合体用做研究试剂，Fc标签其有利于蛋白的检测与纯化。人IgG免疫球蛋白是体 内的主要抗体，它在人体内的半衰期约为20天，其稳定性是由于IgG的Fc片段可与新生 Fc受体(FcRn)结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。因此，IgG的Fc片段被用来与活 性蛋白连接构成融合蛋白，以提高活性蛋白的体内半衰期，达到长效的目的。IgG可通过 Fc片段上的补体结合位点激活补体，起到细胞杀伤作用。根据铰链区的长短及Fc片段氨 基酸序列的不同，人IgG分为4个亚型，其中IgG Fc Y 2具有较低的诱导细胞毒性作用,而 IgG Fc Y 1最强。IgG融合蛋白的构建方式大多是将IgG的Fc (Hinge_CH2- CH3)片段或 CH(CH1-Hinge-CH2-CH3)片段的N端与活性蛋白的C端相连，以避免构建融合蛋白可 能对活性蛋白生物活性造成的影响。另外，如果活性蛋白以同源二聚体的形式发挥其生 物活性，Fc γ片段及铰链区的半光氨酸构成的分子间二硫键可增强和稳定融合蛋白二聚体 的形成。例如人白细胞功能抗原3 (LFA-3),肿瘤坏死因子受体II(TNFRII),白细胞介素 12(IL-12)等，这些融合蛋白在保留细胞因子生物功能的同时在动物实验中明显延长细胞 因子的半衰期。此外，IgG的融合蛋白可以通过Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。 因此尽管很多细胞因子与IgG的融合蛋白还处于研究的前期阶段，但是由于其高效性、半 衰期长及纯化方便的特点已经引起广泛的关注。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明通过构建OXM与人IgG Fc融合蛋白，增强了 OXM多肽的体内稳定性和延长了半衰期，并提供了该融合蛋白用于治疗代谢疾病如糖尿 病和肥胖症的方法。本发明的一个方面提供了一种重组胃泌酸调节素融合蛋白OXM-Fc，它由人免 疫球蛋白G的Fc片段和人胃泌酸调节素通过一个连接肽构成的融合蛋白。其中，OXM与Fc之间的链接肽选择至关重要，OXM通过连接肽来连接Fc与 OXM以形成融合蛋白，OXM连接肽-Fc或Fc-连接肽-OXM。连接肽可以是(G4S) 3_1(1， 连接肽长度优选是2-100个氨基酸，更优选是5-50个氨基酸，最优选为14-30个氨基 酸。连接肽长度可短至Fc对OXM形成的位阻保持最小，例如(G4S) i_2。连接肽有利 于OXM与其受体结合。所说的融合蛋白OXM-FC可以是包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽，或其片段同源物、类似物或衍生物。在一优选的实施方案中，OXM-Fc由SEQ ID NO:5所
示氨基酸序列组成。本发明的另一个方面提供了一种编码重组OXM-Fc融合蛋白的多核苷酸分子， 它是选自下列核苷酸序列的一种
1)SEQ ID NO:6的核苷酸序列；
2)与SEQID NO:6所示核苷酸序列至少70%相同的核苷酸序列；
3)在严谨杂交条件下能与SEQID NO:6或其互补的多核苷酸分子杂交的核苷酸序
列；
4)编码与SEQID NO:5相同的氨基酸序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而在序 列上有所不同的核苷酸序列。本发明所说的融合蛋白OXM-Fc可通过以下方法制备
(1)分别制得人胃泌酸调节素及免疫球蛋白G的Fc片段基因，
(2)连接人胃泌酸调节素和Fc基因；
(3)构建含上述(2)连接片段的重组表达载体；
(4)用上述(3)中得到的重组表达载体转化宿主细胞，
(5)培养宿主细胞，然后从细胞培养物中回收和纯化得到重组融合蛋白。上述方法中提供了含有编码本发明的多核苷酸的重组表达载体，由该重组表达 载体转化的宿主细胞，以及由该宿主细胞所衍生的新的细胞系。在一优选实施方案中， 本发明提供一种包含本发明多核苷酸分子的重组真核表达载体pOXM-Fc，以及含有该重 组表达载体的宿主细胞pOXM-Fc/CHO。上述步骤(5)具体是在适于该融合蛋白的条件下培养用重组表达载体转化的宿 主细胞，以及从细胞培养物中回收和纯化该重组融合蛋白的步骤。在一个优选的实施方 案中，宿主细胞经细胞培养，离心后，上清液分别用亲和层析和分子筛层析纯化。在一 个优选的实施方案中，亲和层析是ProteinA sepharose FF亲和层析柱，分子筛是Superdex 200 PREP grad 柱。本发明进一步提供含有本发明OXM-Fc融合蛋白作为活性成分和药学上可接受 载体的药物组合物，以及该药物组合物在治疗内分泌相关疾病的药物中的用途，包括糖 尿病和肥胖症等。本文中提到的OXM-Fc融合蛋白为同源性多肽，本文中的同源性多肽是指，多 肽本来具有OXM-Fc融合蛋白的氨基酸序列，但其中一个或多个氨基酸残基已被不同的 氨基酸残基保守的取代，并且所得到的多肽可用于实施本发明。保守氨基酸取代时本领 域已知的。造成这样的取代原则包含由Dayholf，MD等所述的取代规则。更具体的说， 保守氨基酸取代发生在与其酸性、极性或侧链大小相关联的氨基酸家族内。生产和操作本文公开的多核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可 按照描述的重组技术完成。可用于表达本发明的OXM-Fc融合蛋白序列的表达载体 是本领域已知的，其中包括含有特定编码序列的重组噬菌体DNA，质粒DNA和粘 粒DNA表达载体，可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型原核表达质粒包括 PUC8,PUC9,PBR322和PBR329,pET系列载体，PQE50等等，可经加工而含有本发明的多 核苷酸分子的典型真核表达载体包括蜕皮激素诱导型哺乳动物表达系统，基于鞠细胞病毒启动子-增强子的表达系统，和基于杆状病毒表达系统。可用于实施本发明的宿主细胞可以是真核或原核细胞。这样的宿主细胞包括单 不限于微生物，例如用重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA载体转化的细菌，或 者用重组载体转化的酵母，或者是动物细胞，如用重组病毒载体如杆状病毒感染的昆虫 细胞，或用重组病毒载体如腺病毒或痘苗病毒感染的哺乳动物细胞等。例如，可使用大 肠杆菌菌株，如BL21菌株。真核细胞包括酵母细胞，但也可有效地利用小鼠、仓鼠、 牛、猴或人细胞系等哺乳动物细胞。可用于表达本发明的重组蛋白质的真核宿主细胞包 CHO,和 HEK293，NIH-3T3 细胞等。含有本发明的重组融合蛋白质的药物组合物可用于内分泌相关疾病的治疗，尤 其是在减肥和糖尿病领域。本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口 服给药，经皮给药，静脉给药，肌肉内给药，局部给药，经鼻给药等。根据所采用的给 药方式，可将本发明的重组蛋白药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含至少一种有 效剂量的本发明的多肽和至少一种药学上可接受的药用载体。适当剂型的实例为片剂，胶囊，糖衣片剂，粒剂，口服溶液和糖浆，用于皮肤 表面的油膏和药贴，气雾剂，鼻喷剂，以及可用于注射的无菌溶液。含有本发明重组蛋白的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉末以用于胃肠外给 药，在使用前科加入适当溶剂或其他可药用的载体将粉末重新配置，液体配方一般是缓 冲液，等渗溶液和水溶液。剂型中还包含由其他常规组分，如防腐剂，稳定剂，表面活性剂，缓冲液，调 节渗透压的盐，乳化剂，增甜剂，着色剂，调味剂等。本发明药物组合物种使用的稳定 剂优选柠檬酸钠，甘氨酸，甘露醇，神经节糖苷等。含有本发明药物组合物的注射水针 或冻干粉针更优选的配方包括，Roxm-Fc，NaCl 4mg，硫酸盐3.02mg，甘氨酸IOmg或 甘露醇15mg，注射用水0.5ml。本发明药物组物种多肽的用量可以再一个较大范围内变动，本领域技术人员可 以根据一些一直的因素如根据疾病的种类，病情严重程度，病人体重，剂型，给药途径 等因素很容易的加以确定。本发明的优点
1)在分子数相同时与天然OXM相比，具有类似的生物学活性；
2)在药物的药代实验中显示出显著延长的半衰期和稳定性；
3)选择IgG的Fc片段作为融合片段，避免副作用的产生；
4)表达量高，稳定性好，易于放大生产，成本低。本发明的工程细胞株连续传代100代后，仍能稳定分泌表达OXM-Fc融合蛋 白，通过悬浮培养方式进行培养，用ELISA方法检测上清中的表达量，统计50余次的数 据，表达量均在400-1000mg/L。在纯化方面，由于融合蛋白在细胞培养上清中含量高， 而纯化工艺中的亲和层析步骤具有很高的纯化效率，每毫升凝胶可以结合50mg的蛋白， 易于放大生产。
图1 显示重组质粒pOXM-Fc的构建过程。图2:显示重组质粒pOXM-Fc的酶切鉴定结果(l%agrose电泳)，其中泳道M 为分子量标准，1,分别代表号克隆。图3:显示纯化后蛋白的电泳图谱(12%SDS-PAGE)，其中泳道M为蛋白质分 子量标准，泳道S为纯化后的样品。图4 OXM-Fc蛋白以腹腔一次给药方式注射雄性C57小鼠后的药代动力学结^ ο图5 OXM-Fc蛋白对肥胖小鼠体重的影响，* = ρ < 0.001,和对照组比较。图6 OXM-Fc蛋白对肥胖小鼠食物摄入量(FI)的影响，’=ρ < 0.05，和对照
组比较。图7 OXM-Fc蛋白对肥胖小鼠糖耐量的影响
图8: OXM-Fc蛋白对肥胖小鼠口服葡萄糖后胰岛素释放的影响，’ = ρ<0.05，和 对照组比较。
具体实施例方式实施例1 OXM目的基因及人IgGl Fc片段基因的获得
根据OXM基因序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO 1，基因序列为SEQ ID NO 2，送交基因合成公司合成。根据人IgGl Fc基因序列，以正常人淋巴细胞总RNA为模 板，RT-PCR扩增IgGl Fc片段，反应条件如下RT-PCR反应混合物在50°C变性30分 钟后，按下列条件进行反应逆转录反应94°C变性30秒；55°C退火30秒；68°C延伸 1分钟，反应10个循环。PCR反应94°C变性30秒；60°C退火30秒；68°C延伸1分 钟，反应25个循环。然后68°C再延伸12分钟。反应完成后，1%琼脂糖凝胶电泳检测 RT-PCR产物。如图1所示，我们得到了预计大小的DNA片段(约600bp)。经测序， 其氨基酸序列为SEQIDNO 3，基因序列为SEQIDNO 4。实施例2 重组质粒的构建
载体的构建如图1所示，通过over-lap PCR技术将OXM和Fc的基因序列拼合；利 用引物延伸PCR技术，通过三次PCR将鼠IgK信号肽连接在OXM-Fc序列的氨基端； 再将目的基因与pcDNA3.0质粒分别用Hind III和EcoR V内切酶进行酶切；将酶切产物 用T4连接酶连接，将构建好的质粒命名为pcDNA3.0/OXM-Fc。具体是 1.1根据OXM和人IgGl Fc (hinge+ CH2+ CH3) cDNA序列设计如下引物 POXMlCATGGCGAGGGCACCTTCACCTC 3' POXM2: 5，CAGGTGTGGGTCTTGTCAGAGGAClTGGGCi ‘ PFcl: 5' GTCCTCTGACAAGACCCACACCTG 3， PFc2: 5' CGCGGATCCTCACTTGCCGGGGCTCAGGGACAG3， 其中POXM2和PFcl斜体部分为互补区域，PFc2含由EcoRV酶切位点。利用重叠 延伸拼接技术合成OXM-Fc。1.2根据鼠IgG κ链和OXM-Fc序列设计如下引物
Pl CCCAAGCTTGCCACCATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGP2 ATCATCCTGTTTCTGGTGGCTACCGCCACCGGAGT
P3 CTACCGCCACCGGAGTGCATTCTGACAAGACCCACACCTGTC
利用引物延伸技术合成信号肽之后，通过重叠拼接技术将信号肽OXM-Fc结合并将 得到的序列酶切后转入PCDNA3.0真核表达载体，酶切鉴定结果为图2，表达质粒命名为 pcDNA3.0/OXM-Fco实施例3: CHO稳定表达株(CHO-OXM细胞)筛选及鉴定
1) 取IOug大量制备的实施例2中的pOXM-Fc质粒，利用脂质体Lipofectin2000 转染CHO细胞。两天后按1 5的比例传代，加入0.4 mg/ml的G418筛选，10天可见 克隆形成。随机消化50个边缘明显分开、细胞状态良好的单克隆接种于24孔板培养(第 一轮筛选)。2) 取三天后的培养上请用ELISA检测融合蛋白的表达情况，从中选出表达 阳性的15个克隆分别接种于24孔板(第二轮筛选)及6孔板(用于保种)，培养4天 后，取上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，从中选取表达较高的4个克隆A5-3、 B2-3、B2-5、C1-4 一步用有限稀释法进行筛选。3) 分别接种96孔板(5细胞/孔/200ul)(第三轮筛选)，待细胞长满后 (大约13天后)，去培养上清用ELISA检测融合蛋白的表达情况，B2-3、B2_5、Cl_4
均为均一的克隆，分别挑取表达较高的6个克隆接种24孔板，各平行届2孔。待细胞长 满后，其中一孔用于保种，另一孔接种6孔板。待6孔板内的细胞长满后，抽取基因组 DNA和总RNA，用PCR鉴定整合入基因组的插入片段的存在情况，用RT-PCR鉴定插入 片段的转录(即表达)情况。结果显示B2-3、B2-5、C1-4均为正确的克隆。4) 分别取 B4-3 (C3)、A6-4 (B4)、Cl-5 (D8)接种 96 孔板(1 细 胞/孔/200ul)(第四轮筛选)，待细胞长满后(大约15天后)，取培养上请用ELISA 检测融合蛋白的表达情况，三个克隆均为均一的克隆，将其中表达最高的分别扩增、保 种，进行下一步表达和纯化。pOXM-Fc转化CHO细胞后，将稳定表达的细胞命名为 CHO-OXM 细胞。实施例4制备OXM-Fc融合蛋白
大规模培养CHO-OXM细胞，经离心后上清液用IM的NaOH调节pH至7.3，用 以 IOmM PB(pH7.3)平衡的 rProteinA-Sepharose F.F. (Parmacia)亲和层析柱进行吸附，再 用同样的缓冲液洗涤亲和柱至280nm的OD值小于0.01。用0.05 0.1M的柠檬酸缓冲液 将融合蛋白洗下，收集洗脱峰并立即用200 InMNa2HPO4调节PH至7.0。样品浓缩后， 上分子筛 Superdex 200 prep grade 柱预先用 20 mM PBS (含 150mM NaCL, pH7.2)缓冲液平 衡，将浓缩后的样品上样纯化。纯化后的蛋白电泳图谱见图3，纯度可达到98%以上。实施例5 制备以OXM-Fc为活性组分的注射剂/冻干剂
配方 OXM-FcIOOmg
NaCL8g
Na2HP04 · 12H205.16g
NaH2P04 · 2H200.874g
甘氨酸15g
甘露醇30g注射用水IOOOml
pH 值7.2
无菌过滤后分装成0.5ml/支的注射水针剂或冻干，制成冻干粉针。实施例6 OXM-Fc在雄性C57小鼠体内腹腔注射(IP) —次给药的药代动力
学
实验方法
1)实验动物清洁级10周龄健康雄性C57小鼠66只，体重(21.69 士 1.39)，由上 海中科院SLAC实验动物中心提供。实验前小鼠适应性喂养1周，自由饮水，进食普通 饲料，无不良反应、进食、饮水和活动正常者纳入实验。动物饲养实验室符合国标清洁 级，空间50M2，室内照明控制在12h/12h光暗周期节律。室内平均气温23°C，相对湿度 50%-60%。2)动物分组及实验设计实验前称小鼠体重，按体重随机分成2组，每组33 只，每个时点3只。各组小鼠处理如下OXM组0.16mg/kg; OXM-Fc组5mg/kg。 每只小鼠注射一个IP注射剂量的OXM或OXM-Fe。在给药0.08，0.5，1，6，24，48， 72，96，168，240和336hr后眼眶静脉取血。血样4°C凝固，3500 χ g低温离心IOmin分
离血清，各时点每只小鼠血样于_20°C保持待测。3)药代动力学测定采用ELISA试剂盒测定各个给药方法、各个时间点小鼠血 清中OXM-Fc浓度，得到血药浓度_时间曲线及主要药代动力学参数。以OXM单克隆 抗体10 μ g/ml包被ELISA板。以Bradford法测定OAP标准蛋白液的浓度。将OAP标 准品以抗体稀释液倍比稀释至1000、500、250、125、62.5、30ng/ml, 100 μ /孔。用此 测得的值制定标准曲线，取一特定时间点采到的血清样品以抗体稀释液作1:10，1:100, 1:1000, 1:5000稀释，加入100 μ 1/孔，37°C水浴箱孵育lh。 以洗液洗5遍，每遍3 min,每洗一遍之后以毛巾包裹拍干。之后加入1:5000抗体稀释液稀释的HRP标记的抗 小鼠IgG (Cell Signaling)，37°C水浴箱孵育1 h。按前述方案洗板5遍。之后加入100 μ 1/孔底物液，37°C水浴箱孵育20 30 min，加入反应终止液20 μ 1/孔。于多功能酶 标仪测定OD492nm。4)统计学处理所有数据用均数士标准差(χ 土 S)表示，用统计软件SPSS11.5 处理。根据所测OXM，OXM-Fc血药浓度-时间数据，取各时点3只小鼠血药浓度的 均数，用DAS软件进行曲线拟合并计算主要药代动力学参数。P<0.05视为统计学差异显 著，P<0.001为统计学差异非常显著。图4和表1是OXM-Fc蛋白以腹腔一次给药方式注射雄性C57小鼠后的药代动 力学结果，
权利要求
1.一种重组人胃泌酸调节素融合蛋白，其特征在于，它由人免疫球蛋白G的Fc片段 和人胃泌酸调节素通过一个连接肽构成的融合蛋白。
2.如权利1所述的重组人胃泌酸调节素融合蛋白，其特征在于所述人胃泌酸调节素通 过一个连接肽与Fc片段连接构成融合蛋白，所述连接肽为(G4S) 3_1(1。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于是SEQID NO:5所示氨基酸序列的多 肽，或其片段、同源物、类似物或衍生物。
4.一种编码权利要求1融合蛋白的多核苷酸分子，其特征在于它是选自下列核苷酸序 列的一种1)SEQ ID NO:6的核苷酸序列；2)与SEQID NO:6所示核苷酸序列至少70%相同的核苷酸序列；3)在严谨杂交条件下能与SEQID NO:6或其互补的多核苷酸分子杂交的核苷酸序列；4)编码与SEQID NO:5相同的氨基酸序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而在序 列上有所不同的核苷酸序列。
5.制备权利要求1所述融合蛋白的方法，包括以下步骤(1)分别制得人胃泌酸调节素及免疫球蛋白Fc片段基因，(2)连接人胃泌酸调节素和Fc基因；(3)构建含上述(2)连接片段的重组表达载体；(4)用上述(3)中得到的重组表达载体转化宿主细胞，(5)培养宿主细胞，然后从细胞培养物中回收和纯化得到重组融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于宿主细胞经细胞培养，离心后，上清 液分别用亲和层析和分子筛层析纯化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于亲和层析中使用的是ProteinAsepharose FF亲和层析柱；分子筛中使用的是superdex 200 Prep grade柱。
8.—种药物组合物，其特征在于该药物组合物由作为活性成分的权利要求1的融 合蛋白以及药学上可接受的载体组成。
9.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗肥胖症、糖尿病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种长效稳定的胃泌酸调节素，它由人免疫球蛋白G的Fc片段和人胃泌酸调节素通过一个连接肽构成的融合蛋白。该融合蛋白的制备方法如下分别制得人胃泌酸调节素及免疫球蛋白Fc片段基因，并将它们连接，然后构建含连接片段的重组表达载体；用重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，然后从细胞培养物中回收和纯化得到重组融合蛋白。本发明的融合蛋白能用于制备治疗代谢疾病如糖尿病和肥胖症的药物。
文档编号A61P3/10GK102010473SQ20101053822
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月10日 优先权日2010年11月10日
发明者卢悟广, 夏志南, 曹鹏, 蔡雪婷, 高健 申请人:夏志南, 曹鹏