一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法及其应用与流程

本发明涉及一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法及其应用，属于细胞体外分离扩增方法及其应用技术领域。

背景技术：

复发性流产(Recurrent Spontaneous Abortion，RSA)指患者与同一性伴侣连续发生2次及2次以上自然流产，在育龄妇女中发病率约为5％，此类患者再次妊娠失败率高达50％以上。RSA病因复杂，临床上约50％与染色体异常、生殖系统解剖异常、内分泌异常、感染和血栓形成倾向有关，另有50％RSA患者病因不明，称原因不明复发性流产(URSA)，被认为与母胎免疫排斥有关，是目前亟待解决的难治性不育症。

连续3次或3次以上流产患者(复发性流产)采用淋巴细胞主动免疫治疗(lymphocyte immunotherapy,LIT)于上世纪80年代在国际上获得成功，在临床上逐渐得到推广应用，并在国内取得共识。

近年研究表明，URSA与妊娠免疫耐受异常、生理性免疫抑制反应减弱有关，这涉及到CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞比例和Th1/Th2细胞比例失衡，调节性T细胞数量及功能下降，NK细胞毒力增强，巨噬细胞功能异常，HLA抗原组织相容性增加，封闭抗体产生减少等，从而导致胚胎遭受免疫排斥而流产。但是由于上述实验室指标变化不够敏感和稳定，尚未能作为URSA实验室诊断指标，所以URSA的诊断主要靠临床排除性诊断，没有确切的实验室诊断指标。

申请人自2007年致力于URSA及反复种植失败的研究。近年来，申请人在2项国家自然科学基金、2项生殖医学基金的资助下，深入开展URSA的临床及基础研究，在其发病原因、发病机制、免疫防治、规范诊疗等方面上取得了一定的成绩。前期研究中，1)我们首次提出母胎“Th17/Treg平衡”理论，我们认为正常妊娠存在Th17/Treg平衡，URSA患者Th17/Treg失衡，偏向Th17；URSA患者外周血、蜕膜中Treg细胞(细胞表面标志CD4+CD25+CD127dim/-)表达降低，确定Treg细胞的表面标志，为URSA患者病因学筛查临床检验提供可靠依据(Wang et al.,2010)。2)URSA患者Treg细胞调控Th17细胞功能降低，Th17细胞表面趋化因子及细胞因子表达异常(Wang et al.,2010)。3)URSA患者巨噬细胞功能异常、Treg细胞调控巨噬细胞的功能异常，正常妊娠妇女Treg细胞能够有效调控URSA患者Th17、巨噬细胞功能(Wang et al.,2011)。4)注射rIL-17能引起鼠种植率降低、流产率增加，转输正常孕鼠Treg细胞能提高种植率及妊娠成功率(Wang et al.,2014)。6)种植期Treg细胞水平、体外倍增的能力以及细胞因子的分泌与种植成败关系密切，反复种植失败患者种植期外周血Treg细胞表达降低(Wang et al.,2017)。7)Treg细胞免疫治疗URSA患者，提高了抱婴率(Wang et al.,2017ARSImeeting)。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中存在的不足之处,提供一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法，通过本方法不仅可以获得纯度较高的Treg细胞，还可以通过体外扩增的方法获得临床应用所需要的细胞数量首次应用于治疗原因不明复发性流产。

一种人外周血Treg(CD4⁺CD25⁺CD127^dim/-T)细胞的体外分离扩增方法，其特殊之处在于包括以下步骤：

1)、采集原因不明复发性流产患者配偶的外周血，梯度离心分离出外周血单个核细胞；

2)、利用磷酸盐缓冲液洗涤所述外周血单个核细胞两次，计数；

3)、磁珠分选技术分离出CD4⁺T细胞、Treg细胞；

4)、将Treg细胞进行扩增；

所述步骤3)中通过磁珠分选技术分离CD4⁺T细胞的具体步骤为：

将所述外周血单个核细胞按比例加分选试剂，即每10⁷细胞加40ul CD4⁺CD25⁺CD127^-抗生物素抗体，200ul CD4⁺CD25⁺CD127^-免疫磁珠，震荡均匀，4℃孵育25min；再加磷酸盐缓冲液至10ml，1200rpm离心10min；离心后去上清，用500ul分离缓冲液重悬，过LD磁珠分选柱，待阴性细胞完全过柱后用3ml分离缓冲液冲洗柱子3次；将柱子取下，用5ml分离缓冲液将阳性细胞冲洗下来，收集入新的离心管；1200rpm离心5min，弃去4ml分离缓冲液，余下1ml缓冲液重悬细胞，取10ul计数，为6.4×10⁶个，占外周血单个核细胞的20％；加分离缓冲液至5ml，1200rpm离心5min，弃上清，得CD4⁺T细胞；

所述步骤3)中通过磁珠分选技术分离出Treg(CD4⁺CD25⁺CD127^dim/-T)细胞具体步骤为：

(1)在获取的所述CD4⁺T细胞中，按比例加入分选试剂，即每10⁷细胞加入180ul分离缓冲液、100ul CD25磁珠，4℃孵育15min；

(2)加磷酸盐缓冲液10ml，1200rpm离心10min；离心后弃上清，用500ul分离缓冲液重悬，过MS磁珠分选柱，用3ml分离缓冲液冲洗柱子3次，收集通过柱子的细胞，即为CD4⁺CD25^-细胞；

(3)将柱子取下，用5ml分离缓冲液将阳性细胞冲洗下来，收集入新的离心管，即为Treg细胞；

所述步骤4)中Treg细胞进行扩增具体步骤为：

将2×10⁵个Treg细胞培养于加有1％青链霉素、1％谷氨酰胺酶、10％人AB血清，RPMI 1640完全培养液的96孔细胞培养板中，每孔中加入游离的anti-CD3单抗(终浓度为10ug/ml)和包被的anti-CD28单抗(终浓度为2ug/ml)，400U/ml IL-2，100nmol/L的雷帕霉素作为刺激因子，置37℃、5％CO2培养箱饱和湿度培养,第一周磁珠数：细胞个数比为4:1，以后比例为1:1，每3天换液1次，1周后开始每3天按1:3传代，连续培养3周，得到扩增100倍的Treg细胞。

一种人外周血Treg细胞在治疗原因不明复发性流产中的应用。

本发明不仅可以获得纯度较高的Treg细胞，还可以通过体外扩增的方法获得临床应用所需要的细胞数量，本发明获得的人外周血Treg细胞应用于治疗不明原因复发性流产，本发明通过分选、扩增复发性流产患者丈夫Treg细胞，注射至患者体内，诱导耐受夫源抗原Treg细胞百分比来治疗URSA患者，显著提高原因不明反复性流产患者的抱婴率。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例的一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法，取50mL患者丈夫外周血，通过密度梯度仪(流速为1.077g/mL)分离出外周血单个核细胞(PBMC)，利用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，计数之后，通过磁珠分选技术分离CD4⁺T细胞(纯度为95％-99％)，通过抗体孵育及磁珠分选技术分离出Treg细胞(纯度为90％)，然后进行扩增Treg细胞。

具体的体外分离扩增方法如下：

1)采集原因不明复发性流产妇女配偶外周静脉血50ml(肝素抗凝，25u/ml血)，将静脉血以1：1体积比平铺于淋巴细胞分离液(聚蔗糖-泛影葡胺，d＝1.077)上，其中分离液：外周血＝1：1.5-2倍体积，室温下离心2000r/min，10min，缓慢减速，无制动停转；

2)吸取中间层淋巴细胞层于另外离心管中，离心1200rpm，10min，见管底白色沉淀；

3)通过磁珠分选技术分离Treg细胞：

a、弃上清，加PBS至10ml，弹匀，离心1200rpm，10min；

b、弃上清，加PBS至10ml，弹匀，计数；

c、离心1200rpm，10min，(此时准备LD柱，加PBS冲洗)；

d、缓弃上清，弹匀，按比例加入CD4⁺CD25⁺CD127^-T-cell Biotin-Antibody cocktailⅡ(每10^7细胞加入40ul试剂)，混匀，4℃孵育10min，每10^7细胞加入200ul CD4⁺CD25⁺CD127^-T cell Anti-Biotin Microbeads，混匀，4℃孵育15min；

e、每10^7细胞加入PBS1-2ml，离心1200rpm，10min；

f、弃上清，弹匀，加PBS混匀(根据细胞量调整)，细胞悬液加入LD柱，细胞悬液流完后，加2mlPBS冲洗LD柱，两次；

G、收集流出的液体，即为CD4⁺细胞，加PBS10ml，细胞计数，离心1200rpm，10min；

H、弃上清，弹匀，每10^7细胞加180ul PBS重悬，100ul CD25磁珠Ⅱ混匀，4℃孵育15min(此时准备MS柱)；

I、细胞悬液加入PBS至10ml，离心1200rpm，10min，弃上清，弹匀，每10^8细胞加入500ulPBS混合，加至MS柱，液体流尽后，PBS冲洗2-3次，流出的细胞即为CD4⁺CD25^-细胞；

J、将MS柱置于无菌管中，加2mlPBS，迅速推动柱芯，冲出的细胞即为Treg细胞；

4)体外扩增Treg细胞

将2x10⁵Treg细胞培养于加有1％青链霉素，1％谷氨酰胺酶，10％人AB血清，RPMI 1640完全培养液的96孔细胞培养板中，每孔中加入游离的anti-CD3单抗(终浓度为10ug/ml)和包被的anti-CD28单抗(终浓度为2ug/ml)，400U/ml IL-2，100nmol/L的雷帕霉素作为刺激因子，置37℃、5％CO2培养箱饱和湿度培养。第一周磁珠数：细胞数4:1，以后比例为1:1，每3天换液1次，1周后开始每3天按1:3传代，连续培养3周，3周后细胞数量约为原代细胞数的100倍。

(4～6)×10⁷PBMC细胞层，可以分离出(1～3)×10⁵个Treg细胞。

其中上述CD4⁺T细胞、Treg细胞的纯度，检测方法具体如下：

流式细胞仪(FCM)检测MACS法，取CD4，CD25磁珠分离后的细胞1×10⁵左右，加入FITC anti-human CD4抗体20ul，PE anti-human CD25抗体20ul，室温下避光孵育15min；加入2ml PBS，1000r/min，7min，弃上清。

另设对照组，上机检测，分析CD4⁺T细胞和CD4⁺CD25⁺T细胞的纯度。

其中上述扩增Tregs的纯度、数量的检测方法，具体如下：

扩增后的Tregs悬液用10μL台盼蓝染色，镜下计数细胞，并计算活细胞率；取扩增后Tregs悬液用100μL，进行三重单克隆抗体染色，包括CD4抗体及CD25抗体，及胞内Foxp3抗体或同型对照染色，采用流式细胞仪检测三重阳性细胞的比例。

其中上述扩增Tregs对CD4⁺T细胞的抑制功能的检测方法，具体如下：

取扩增的夫源Treg细胞、原因不明复发性流产患者Treg细胞、原因不明复发性流产患者CD4⁺CD25^-T细胞各2×10⁵/ml，分别在24孔板单独培养6天；

Transwell体系共培养：取CD4⁺CD25^-T细胞2×10⁵/ml放入下室，上室分别置夫源的、自身的Treg细胞2×10⁵/ml共同培养；

将细胞培养于加有1％青/链霉素，1％谷氨酰胺酶，10％热灭活胎牛血清，RPMI 1640完全培养液的24孔细胞培养板中，每孔中加入游离的anti-CD3单抗(终浓度为10ug/ml)和包被的anti-CD28单抗(终浓度为2ug/ml)作为刺激因子，置37℃、5％CO2培养箱饱和湿度培养，每3天换液1次。

流式细胞术检测Treg、Th1、Th2、Th17细胞的表达。

实施例2

试验例

患者5名，年龄34-39岁，尽管接受了低剂量的阿司匹林、泼尼松、肝素、叶酸、子宫内注入人体绒毛膜促性腺激素(hCG)和激素治疗，所有的病人在6-9周妊娠期间仍经历了4-7次URSA(原因不明复发性流产)。

患者排除了以下可核查的原因:(1)抗磷脂抗体综合征；(2)生殖道解剖异常(包括子宫纵隔、子宫肌瘤、子宫内膜息肉等)；(3)染色体异常；(4)凝血异常；(5)内分泌异常(包括糖尿病、甲状腺机能异常、多囊卵巢综合征)等。

试验方法：

1、取原因不明复发性流产患者丈夫外周血50ml，磁珠分选出Treg细胞，扩增，将10⁷个人外周血Treg细胞重悬于1mL生理盐水中，分别在月经周期第10天、第14天进行皮下注射Treg细胞。

试验结果：

表1为患者1-5的月经周期第10天,14天和28天的Treg细胞数量变化表。治疗前，URSA患者的月经周期的第10天,14天和28天中没有明显的Treg细胞数量变化。如表1所示,使用本申请人外周血Treg细胞治疗后，有明显的Treg细胞数量变化(注：在注射部位没有水泡、疤痕或肉芽肿。没有一个病人出现过敏反应、自身免疫性疾病、传染性疾病)。

表1患者1-5的月经周期第10天,14天和28天的Treg细胞数量变化表

患者的具体试验结果如下：

患者1：

34岁的URSA女性，在她第八次怀孕前接受人外周血Treg细胞，用于治疗原因不明复发性流产。

正常育龄妇女外周血含有3.8-5.0％的Treg细胞。

获得患者丈夫外周血Treg细胞，在月经周期的第10天和第14天进行皮下注射，剂量为2.7×10⁷和3.1×10⁷细胞。

在第一次皮下注射之后，患者Treg细胞的比例从2.7％上升到4.6％。在月经周期28天,Treg细胞的比例是5.2％,而β-hCG水平是112mIU/mL。

2017年11月2日，患者38+2周的剖宫产一健康女婴，体重3600g，母婴健康。

患者2：

36岁的URSA女性，在她第五次怀孕前，接受丈夫外周血Treg细胞，用于治疗原因不明复发性流产。

获得患者丈夫外周血Treg细胞，并给病人皮下接种剂量为1.9×10⁷和2.0×10⁷个细胞。

在第一次皮下注射之后，Treg细胞的比例从3.0％上升到5.8％并且治疗之后在月经周期28天，下降到3.6％，β-hCG水平为28.3mIU/mL。

患者3：

37岁的女性，在她第五次怀孕前接受丈夫外周血Treg细胞，用于治疗原因不明复发性流产。

获得患者丈夫外周血Treg细胞并给病人皮内接种剂量为3.2×10⁷和3.5×10⁷个细胞。

在第一次皮下注射后，Treg细胞的比例从3.2％上升到5.0％。在月经周期28天,Treg细胞群的比例已上升到5.4％,β-hCG水平104mIU/mL。

2017年9月6日，患者孕39周，顺娩一健康女婴，体重3700g，母婴健康。

患者4：

39岁的女性，在她第七次怀孕前接受丈夫外周血Treg细胞，用于治疗原因不明复发性流产。

获得患者丈夫外周血Treg细胞，并给病人皮下接种剂量为2.5×10⁷和3.1×10⁷个细胞。

在第一次皮下注射后Treg的比例从3.4％上升到5.4％。在月经周期28天,Treg细胞群的比例升至6.5％,β-hCG水平135mIU/mL。

2017年11月14日，患者孕39+3周，顺娩一健康女婴，体重3500g，母婴健康。

患者5：

36岁的女性，在她第七次怀孕前接受丈夫外周血Treg细胞，用于治疗原因不明复发性流产。

获得患者丈夫外周血Treg细胞并在月经周期的第10和14天给病人皮下注射，接种剂量为2.2×10⁷和1.7×10⁷个细胞。

在第一次皮下注射后，Treg细胞的比例已经从3.4％上升到4.4％。在月经周期第28天,Treg细胞水平的比例为4.4％。

至2017年12月患者未孕。

本申请通过分选、扩增复发性流产患者丈夫Treg细胞，注射至患者体内，诱导耐受夫源抗原Treg细胞百分比来治疗URSA患者，显著提高原因不明反复性流产患者的抱婴率。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围内。