一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法及其应用与流程

文档序号:15469435发布日期:2018-09-18 19:56阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法,其特征在于包括以下步骤:

1)、采集原因不明原因复发性流产患者配偶的外周血,梯度离心分离出外周血单个核细胞;

2)、利用磷酸盐缓冲液洗涤所述外周血单个核细胞两次,计数;

3)、通过磁珠分选技术分离出CD4+T细胞、Treg细胞;

4)、将Treg细胞进行扩增。

2.按照权利要求1所述的一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法,其特征在于所述步骤3)中通过磁珠分选技术分离CD4+T细胞的具体步骤为:

将所述外周血单个核细胞按比例加分选试剂,即每107细胞加40ul CD4+CD25+CD127-T细胞抗生物素抗体、200ul CD4+CD25+CD127-免疫磁珠,震荡均匀,4℃孵育25min;再加磷酸盐缓冲液至10ml,1200rpm离心10min;离心后去上清,用500ul磷酸盐缓冲液重悬,过LD磁珠分选柱,待阴性细胞完全过柱后用3ml分离缓冲液冲洗柱子3次;将柱子取下,用5ml分离缓冲液将阳性细胞冲洗下来,收集入新的离心管;1200rpm离心5min,弃去4ml分离缓冲液,余下1ml分离缓冲液重悬细胞,取10ul计数,为6.4×106个,占外周血单个核细胞的20%;加分离缓冲液至5ml,1200rpm离心5min,弃上清,得CD4+T细胞。

3.按照权利要求2所述的一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法,其特征在于所述步骤3)中通过磁珠分选技术分离出Treg细胞具体步骤为:

(1)在获取的所述CD4+T细胞中,按比例加入分选试剂,即每107细胞加入180ul分离缓冲液、100ul CD25磁珠,4℃孵育15min;

(2)加磷酸盐缓冲液10ml,1200rpm离心10min;离心后弃上清,用500ul分离缓冲液重悬,过MS磁珠分选柱,用3ml分离缓冲液冲洗柱子3次,收集通过柱子的细胞,即为CD4+CD25-细胞;

(3)将柱子取下,用5ml分离缓冲液将阳性细胞冲洗下来,收集入新的离心管,即为Treg细胞。

4.按照权利要求3所述的一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法,其特征在于所述步骤4)中Treg细胞进行扩增具体步骤为:

将2×105个Treg细胞培养于加有1%青链霉素、1%谷氨酰胺酶、10%人AB血清,RPMI 1640完全培养液的96孔细胞培养板中,每孔中加入游离的anti-CD3单抗(终浓度为10ug/ml)和包被的anti-CD28单抗(终浓度为2ug/ml),400U/ml IL-2,100nmol/L的雷帕霉素作为刺激因子,置37℃、5%CO2培养箱饱和湿度培养,第一周磁珠数:细胞数量比为4:1,以后比例为1:1,每3天换液1次,1周后开始每3天按1:3传代,连续培养3周,得到扩增100倍的Treg细胞。

5.按照权利要求4所述的一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法,其特征在于所述分离缓冲液为磷酸盐缓冲液。

6.按照权利要求1-5任一权利要求所述的一种人外周血Treg细胞的体外分离扩增方法获得的人外周血Treg细胞。

7.按照权利要求6所述的人外周血Treg细胞在治疗原因不明复发性流产中的应用。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1